химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ле, управляющего передвижением круга коллектора фракций. Во всех случаях единственный разумный выход — замена реле на новые.

28—703

434

15. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

15.6,5. Клапаны

Клапаны подачи реагентов и растворителей, используемые в модели 890С, являются объектом оживленных споров. Недостатки этих клапанов послужили причиной их модернизации во многих лабораториях по методу Витт-jaaH-Либольд. При постоянном контроле за эффективностью работы прибора снижение постадийного выхода — достоверный сигнал неисправности клапанов. Наиболее часто причина снижения эффективности процесса связана с растрескиванием мембраны. Поломки диафрагм клапанов хорошо известны любому обладателю секвенатора, однако мало кто знает о простых приемах проверки качества диафрагм. В нашей лаборатории проверка проводится напуском вакуума в реактор секвенатора и слежением за наличием реагентов в линиях подачи, идущих от клапанов, находящихся в закрытом положении. Каждая подающая линия поочередно заполняется «своим» реагентом (растворителем). Последующее включение вакуума вытягивает жидкость из линии, которая должна выглядеть совершенно сухой. В ходе вакуумных сушек, проводимых после каждой стадии цикла (присоединение ФИТЦ, отщепление АТЗ, экстракции), не должно быть никаких утечек, особенно в линиях подачи реагентов, так как это может сильно ловредить проведению процесса. При появлении трещин или других нарушений поверхности контакта клапанов также появляется течь.

Клапан переключения потока («коллектор — слив») редко является причиной осложнений в работе, если только не используется автоматический коллектор. На секвенаторе часты отказы многих соленоидных клапанов (разбухание или залипание уплотнительных прокладок), что приводит к прекращению подачи реагентов. Для восстановления работоспособности клапанов необходима частая замена сношенных частей запасными.

15.7. Контроль качества работы прибора

Успешная работа прибора зависит от внимания оператора к частностям процесса, от предотвращения или раннего обнаружения неполадок. Прежде всего перед началом каждого анализа надо убедиться в достижении требуемого значения вакуума во всей системе (путем включения реактора), в отсутствии протечек жидкостей через клапаны подачи реагентов (растворителей). Следует проверить количество реагентов и растворителей в бутылях и степень герметизации самих бутылей. Удивительно то, что во многих лабораториях пренебрегают соблюдением этих простых правил. Используя секвенаторы в нашей лаборатории почти 13 лет, мы регулярно (еженедельно) анализируем миоглобин на каждом приборе. Это может показаться излишеством, но в действительности только так можно своевременно обнаружить ухудшение работы каждого прибора. Кроме того, практически каждый анализ радиоактивно меченных образцов проводится с использова- * нием внутреннего стандарта ([355]иммуноглобулина, продуцируемого плаз-мацитомой МОРС21). Уникальность препарата заключается в том, что МОРС21 выращивается на среде, содержащей [35S]Met. Из надосадочной жидкости этой культуры после диализа и разделения в восстанавливающих условиях в ПААГ получают белки (две полосы в геле, содержащие радиоактивность), соответствующие тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина. Легкая цепь содержит остатки [35S]Met в положениях 4, 11, 13, тогда как в тяжелой цепи первый остаток [35S]Met находится в положении 34. Поэтому для большинства целей сама диализированная надосадочная жидкость может служить внутренним стандартом. Для более точной количественной оценки работоспособности секвенатора можно разделить цепи в ДСН — ПААГ или на сефадексе и нанести легкую цепь в реактор прибора. Этот прием идеален с нескольких точек зрения. Во-первых, можно точно определить постадийный выход на основе данных 4, II, 13-го циклов отщепле-

15.7. контроль работы прибора

4?5>

нин. Во-вторых, сам процесс отщепления можно провести в течение ночи. В наших условиях выходы составляют 92—97% и практически всегда совпадают с результатами анализа миоглобина. В-третьих, можно смешать-миоглобин с меченой легкой цепью, провести 12 циклов отщепления (Val-Leu-Ser-Glu-Gly-Glu-Trp-Gln-Leu-Val-Leu-His-VaI-Trp->-) и продукты отщепления циклов 1, 2, 10, 11 анализировать методом ГЖХ и ВЭЖХ, а циклов 4, И, 13 — оценить на содержание радиоактивности. При расхожде-нии постадийных выходов для этих двух стандартов (обычно выходы дла миоглобина ниже, чем для меченой легкой цепи) причиной этого расхождения чаще всего является неэффективная работа системы превращения ТА в ФТГ-производные аминокислот (плохое качество этилацетата, перегрев конвертора, загрязнения в системе продувки азотом, перегрев испарителя, и т. д.)

В нашей лаборатории используются еще два способа контроля состояния прибора. Оба они заключаются в постоянной записи температуры в ходе-всего опыта. Подключение недорогого самописца к датчику температуры реактора дает оператору ту же информацию, что и кардиограмма кардиологу. Этим путем можно достоверно контролировать включение — выключение-клапанов, подачу и отбор реагентов, растворителей, эффективность вакуумирования. Таким же образом мы контролируем температуру в охлаждаемых ловушках. Температура ловушки — мера эффективности ее работы, а поэтому и мера эффективности всего процесса. Датчики присоединены к главному блоку управления; изменение температуры фиксируется на ленте самописца. Вместе с тем регистрация температуры ловушки позволяет следить, за степенью заполнения криогенной системы для своевременного размораживания ее. На необходимость размораживания указывает и быстрое-падение эффективности вакуумирования. В условиях влажного климата серьезную проблему представляет конденсация паров влаги воздуха на поверхности ловушки во время работы и во время размораживания. Баня с охлажденными этанолом разбавляется водой, что ведет к значительному повышению температуры внутри охлаждающего пальца и, далее, к неэффективному вымораживанию растворителей и реагентов. В этом случае-слежение за температурой позволяет своевременно устранить недостатки в работе системы охлаждения.

От редактора. Данные о последовательностях могут быть получены по» следующим адресам:

Для нуклеиновых кислот:

Genbank, 10, Moulton Street, Cambridge, MA 02238, U.S A. EMBL Nucleotide Sequence Data Library, EMBL, Postfach 10 22 09, D-690O 1 leidelberg, West Germany. Для белков:

Protein Sequence Database, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, 3900 Reservoir Road, N.W., Washington, CC 20007, U.S.A. *

Professor R. F. Doolitle, Department of Chemistry, University of California,, San Diego, La Jolla, California, U.S.A. 92093.

Адреса любезно представлены д-ром Р. Стаденом (Rodger Stadcn).

Литература

1. Begg G. S., Pepper D. S., Chesterman C. N., Morgan F. Ft Biochemistry, 17> 1739—1744 (1978).

2. Begg G. S., Leslie B. Ft., Morgan F. J., Anal. Biochem., 138, 30—33 (1984). 3 Brauer A. W., Margolies M. N., Haber Biochemistry, 14, 3029—3035

(1975).

4. Croft L. /?., Handbook of Protein Sequence Analysis, 2nd edn., Wiley, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, 1980.

28*

436

15. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

5. Dayhoff М. О., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, 1972.

6. Dayhoff M. O., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl. 1, National Biomedical Research Foundation, Washington, 1973.

7. Dayhoff M. O., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl 2, National Biomedical Research Foundation, Washington, 1976.

8. Dayhoff M. O., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, 1978.

9. Edman P., Begg G., Eur. J. Biochem., 1, 80—91 (1967).

10. Hertnodson M. A., Ericsson L. H.t Titani K., Neurath H., Walsh K. A., Biochemistry, 11, 4493—4502 (1972).

11. Hunkapiller M. W.t Hood L. W., Biochemistry, 17, 2124—2133 (1978).

12. Klapper D. G., Wilde С. E., Capra J. D., Anal. Biochem., 85, 126—131 (1978).

13. McCumber L. J., Qadeer Af., Capra J. D.t In: Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis, Proc. Third Internat. Conf., Birr C. (Ed.), Elsevier/North Holland, Amsterdam, New York, Oxford, pp. 165—172 (1980).

14. Niall H. D., Methods Enzymol., 27, 942—1010 (1973).

15. Tarr G. ?„ Beecher J. F„ Bell M., McKean Z)., Anal. Biochem., 84, 622—627 (1978).

16. Waterfield M.$ Bridgen J., In: Instrumentation in Amino Acid Sequence Analysis, Perham R. N. (Ed.), Academic Press, London, New York, San Francisco, pp. 41—47 (1975).

Глава 16

НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО И ЖИДКОФАЗНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Дж. К. ИНМАН (J. К. INMAN, Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infections Diseases, National Institutes of Health. Bethesda, Maryland 20205, U.S.A.), Э. АППЕЛЛА (E. APPELLA, Laboratory of Cell Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20205, U.S.A.)

16.1 Введение

Многие годы не прекращается поток публикаций о новых подходах к определению аминокислотной последовательности и предложений об усовершенствовании существующей методологии. Неискушенному и часто располагающему очень ограниченным временем исследователю — не специалисту в этой узкой области, обычно трудно оценить, является ли новая методика завершенной разработкой, готовой к тиражированию, или это всего лишь заманчивая, но «сырая» идея, по мере внедрения которой выясняется, что она требует значительной доработки. Авторы большинства приоритетных публикаций по понятным причинам полны энтузиазма и склонны к преувеличению достоинства своих разработок. В данной главе излагаются наши соображения о новейших методиках и идеях; мы надеемся, что этот обзор поможет новичкам избежать разочарований и будет полезен более опытным исследователям, испытывающим особенно острую потребность в конкретных методах, реальная отдача которых еще не очевидна. Дополнительно указаны паши специфические требованиня к слабо разработанным методикам и к нарождающимся идеям с целью стимулировать новаторские исследования в методологии.

16.2. Твердофазный анализ. Новейшие подходы

16.2.1. Общие замечания

Большие успехи в применении нерастворимых носителей для твердофазного (ТФ) синтеза пептидов [72] стимулировали разработку метода анализа аминокислотной последовательности пептидов, ковалентно присоединенных к нерастворимым полимерам [61], Впоследствии метод ТФ-анализа гтоуктуры пептидов удалось автоматизировать [62]. Общая особенность методов синтеза («сборки») и анализа аминокислотной последова-

438

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО анализа

тельности состоит в многократном повторении определенного набора химических реакций. Для получения высокого суммарного выхода в результате последовательного присоединения (или отщепления) многих аминокислот каждая отдельная реакция каждого цикла синтеза (или анализа) должна протекать с высоким выходом. Для смещения равновесия реакции используется избыток реагентов, поэтому в ходе процесса возни-кает задача отделения целевых промежуточных продуктов or избытка реагентов и побочных продуктов реакции. Проведение этого процесса в растворе требует больших затрат времени и реактивов. Разделение компонентов можно провести гораздо быстрее и экономичнее, используя принцип фильтрации или экстракции в гетерогенной системе жидкая фаза — твердая фаза. В настоящее время разработано много вариантов проведения высокоэффективных реакций в гетерогенных системах, в частности ТФ-анализ аминокислотной последовательности белков, широко применяемый и на практике дополняющий жидкофазный метод. ТФ-метод обладает следующими достоинствами:

1) реакционную массу можно тщательно промывать практически любыми растворителями без потери пептида;

2) для присоединения пептидов к носителю используется широкий набор реагентов и растворителей без ограничений по летучести или экстрагируемости, а использование больших избытков реагентов не вызывает больших осложнений при удалении последних;

3) постоянно образующиеся побочные продукты реакции непрерывно удаляются потоком проходящей жидкости, что сводит к минимуму их взаимодействие с пептидом или носителем;

4) можно проводить (до или после присоединения пептидл или между отдельными стадиями ТФ-анализа) специфическое расщепление молекулы по внутренним остаткам пептидной цепи [43, 64, 65].

В данной главе не будут обсуждаться известные положения ТФ-подхода, поскольку основные его принципы читатель может найти в сборниках трудов первых четырех международных конференций, посвященных анализу структуры белка [13, 33, 63, 82] и в обзорах [65, 77], а также в данном сборнике (гл. 12).

Метод позволяет определять последовательность аминокислот, расходуя менее 10 нмоль образца. Для уверенной работы на уровне <1 нмоль необходимо коренное усовершенствование методологии, в том числе разработка высокочувствительной идентификации отщепляемых производных аминокислот. В этом отношении, в частности, очень велики возможности масс-спектрометрии. Следует отметить, что при повышении чув-

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

439

ствительности детектирующих систем достоверность получаемой информации ограничена отношением величины сигнала к шуму, который определяется уровнем химического фона. В принципе ТФ-анализ позволяет получить чрезвычайно низкий уровень фона, но для этого следует пересмотреть многие аспекты химии процесса и конструкции прибора.

При работе с количеством образца <1 нмоль уровень фона может быть снижен прежде всего благодаря уменьшению навесок носителя (до нескольких миллиграммов и менее), а также путем миниатюризации всех элементов прибора (минимальная площадь загрязняющих поверхностей). Отдельные узлы и общая схема автоматических секвенаторов до сих пор основываются на старых идеях и включают многие комплектующие детали, которые использовались в установках для полуавтоматического анализа, что ограничивает возможности работы на микро- и ультрамикроуровне. В частности, для управления подачей реагентов лучше использовать не механические, а гидравлические устройства.

Наибольшее внимание следует уделять разработке химических аспектов метода; в этом отношении большие методические возможности и гибкость ТФ-анализа до сих пор мало используются. Для повышения чувствительности анализа необходимо добиваться снижения уровня химического фона и повышения эффективности отщепления аминокислот (выход как в первом цикле отщепления, так и постадийные выходы в последующих циклах). На основе более глубокого понимания всех проходящих химических реакций (как основных, так и побочных) необходимо систематически пересматривать условия проведения реакции Эдмана и разрабатывать другие методы отщепления.

В последующем обсуждении выражено лишь наше частное мнение относительно перспективности химических разработок в области методологии ТФ-анализа. При этом мы не предпринимали попыток всестороннего анализа появляющихся время от времени новых подходов.

16.2.2. Носители

Твердофазные определения проводят поч

страница 68
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
акустическая система под ключ
Предлагаем приобрести в КНС Нева жесткий диск для компьютера 1 тб купить - кредит онлайн не выходя из дома в Санкт-Петербурге!
Кастрюли Moneta Ceramica 01
табличка вход и выход купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.03.2017)