химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

образца [13J.

работа проводилась на одном и том же секвенаторе модели 890С. В графе В приведены данные, полученные на другом секвенаторе с использованием 0,1 М квадрола, в графе Г — с добавлением полибрена после нанесения пептида в реактор. В каждом случае анализировали 10 нмоль пептида. Определение ФТГ-производных аминокислот проводили методом ВЭЖХ. Как следует из приведенных данных, внесение полибрена положительно сказывается на анализе.

Существенное преимущество квадрола по сравнению с ДМАА состоит в более высоких постадийных выходах и в отсутствие артефакторов в разных системах идентификации. Квадрол меньше, чем ДМАА, загрязняет вакуумную систему и систему подачи реагентов.

Конструкция секвенатора модели 890С позволяет быстро переходить от одной буферной системы к другой.

От редактора. Для анализа на секвенаторе с вращающимся реактором первоначально требовалось 250 нмоль белка. В настоящее время можно анализировать 100 пмоль (при условии очистки квадрола перед использованием). Очистка уменьшает величину фоновых пиков и позволяет определять более длинные последовательности*.

Коммерческий препарат квадрольного буфера разбавляют до 0,1 М смесью пропанол-1 —вода (3 : 4). Добавляют 10 мг/мл [}-N-(2-аминоэтил-3-аминопропил)стекла (фирма LKB) и мягко перемешивают в течение 24 ч при 20 °С для удаления следов альдегидов. После отстаивания частиц стекла отбирают буфер пипеткой. Добавляют 2 мг/мл ДИТЦ-[}-Ы-(2-аминоэтил-3-аминопропил)стекла (LKB) к 0,1 М квадролу и мягко перемешивают в течение 4 сут при 20 °С. Хранят буфер над ДИТЦ-стеклом при 20 °С и отбирают его пипеткой по мере необходимости.

* ЖФ-анализ пептидов и белков на пикомольном уровне оказался непосильной задачей для большинства лабораторий. Реально для определения последовательности требуется не менее 1 нмоль образца, что явилось главной причиной вытеснения ЖФ-метода более чувствительным и экономичным ГФ-определением (табл. 17.1). — Прим. перев.

430

15. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

1S.4. Полибрен

«Никто не знает, почему он работает, но он работает». Введение полибрена оказало глубокое влияние на автоматический анализ последовательности [12, 15]. Использованный вначале совместно с ДМАА полибрен в настоящее время широко используется и с 1 М квадролом, и с ОД М квадролом, и с буферами, содержащими 1 М и 0,1 М квадрол, в различных пропорциях. Его продает фирма Aldrich и в «очищенном» виде — фирма Pierce (марка «для секвенирования»). Описан ряд методик для дальнейшей очистки полибрена. По опыту нашей лаборатории, продукт фирмы Aldrich удовлетворяет требованиям анализа. Изучая возможности использования полибрена в сочетании с буферами на основе квадрола и ДМАА, мы загружали в реактор 0,3 мг, 3,0 мг, 30 мг и нашли, что доза в 3 мг является наилучшей. Недавние исследования указывают на то, что следует предпочитать пробы в 1 мг, хотя в некоторых лабораториях применяют навески до< 10 мг. Примеси, присутствующие в полибрене, не обнаруживаются при хроматографии продуктов отщепления на секвенаторе, если до начала анализа провести один цикл без добавления ФИТЦ. Положение пиков на хроматограмме, соответствующих этим примесям, зависит от источника снабжения реактивами, растворителями и полибреном. Незначительные изменения состава растворителей для ВЭЖХ, свойств колонок разных фирм или даже разных колонок одной фирмы ведет к изменению положения артефактов на хроматограмме. От примесей можно избавиться одним из следующих способов:

1) очистить полибрен перед использованием;

2) нанести его в реактор без пептида (белка) или внести в реактор* Gly-Gly, провести несколько циклов отщепления перед добавлением пептида (белка);

3) пептид и полибрен внести одновременно и провести один (или несколько) циклов промывки. Эта методика позволяет удалить большую* часть примесей, присутствующих в полибрене. Пики примесей иногда появляются на хроматограммах первых двух-трех циклов отщепления, но они легко отличаются от пиков фона аминокислот тем, что резко уменьшаются в размерах в течение первых трех циклов отщепления.

Полибрен можно долго хранить, тем не менее использование образца,, простоявшего при комнатной температуре более недели, часто приводит к недостоверным результатам определения структуры. Поэтому следует ежедневно готовить свежий раствор полибрена или хранить такой раствор* при 4°С не более недели. Можно растворить полибрен в воде (30 мг/мл) и хранить раствор в морозильной камере холодильника.

При использовании полибрена в работе на секвенаторе фирмы Beckman не обнаружено вредного воздействия его ни на систему клапанов, ни на систему идентификации. В лаборатории авторов анализировалось >20 000 образцов ФТГ-производных аминокислот методом ВЭЖХ и (или) обратного кислотного гидролиза с последующим определением аминокислот па анализаторе D-500 фирмы Durrum без вредного воздействия на аппаратуру.

15.5. Реагенты и растворители

В автоматическом анализе последовательности наиболее дорогостоящая статья эксплуатационных расходов приходится на реактивы. На обеспечение ими каждого секвенатора в течение одного года требуется ~15 000 долл. США. В печати и в лабораториях все время дискутируется вопрос об источниках снабжения реактивами. Мнения сильно расходятся; одни утверждают, что необходимо окончательную очистку всех реактивов проводить потребителем [1, 11], другие предлагают производить закупку наиболее де-

15.5. РЕАГЕНТЫ И РАСТВОРИТЕЛИ

431

ш^вых коммерческих партий с последующим их испытанием каждым потребителем. Мнение большинства находится где-то между этими двумя крайними точками зрения. В нашей лаборатории используются несколько разных источников снабжения, и наша стратегия заключается в следующем.

Мы покупаем все реактивы у фирмы Beckman. Из всех доступных ранее «секвенаторных» реактивов продукция этой фирмы — самая дорогая, но реактивы только этой фирмы имеют гарантию проверки на секвенаторе. Поскольку каждый из реактивов по отдельности проверен на секвенаторе и все реактивы имеют наименьшие изменения качества от партии к партии, то при работе с ними меньше всего шансов на неудачи в анализе структуры.

Однако их высокая стоимость толкнула многих (в том числе и нас) на поиск других источников снабжения. В целом наш опыт говорит о том, что реактивы фирмы Pierce хорошего, но непостоянного качества, ключевым реагентом является ГФМК и, по нашему мнению, большая часть описанных в литературе изменений постадийных выходов возникает именно из-за непостоянства качества ГМФК. Доказано, что коммерческие препараты «безводной» ГМФК содержат воду, описана методика дальнейшей осушки кислоты [1]. По нашему мнению, в целом это бесполезно, и мы не обнаружили особых преимуществ при снижении содержания воды с 30 до 4— 6 млн-1.

Значительная экономия достигается при покупке растворителей не у фирмы Beckman, а у других фирм. У нас никогда не возникало никаких затруднений при использовании бензола из разных источников, хотя нашим постоянным поставщиком является фирма Burdick and Jackson. Некоторые проблемы могут быть связаны с применением разных партий этилацетата, так как многие партии этого растворителя содержат примеси, разрушающие ФТГ-производные аминокислот.

Мы рекомендуем простой тест для этилацетата. Надо взять стандартное количество ФТГ-производных аминокислот (мы обычно используем наши стандарты, предназначенные для ГЖХ или для ВЭЖХ), смешать их с 1,5 мл этилацетата из испытуемой партии и оставить при комнатной температуре на 30 мин, затем высушить в потоке азота. Остаток затем анализировать количественно методом- ГЖХ или ВЭЖХ, измеряя высоты ликов. Растворение в этилацетате либо не влияет на высоту пиков ФТГ-лроизводных аминокислот, либо разрушает эти производные полностью, и в результате не обнаруживается никаких пиков.

Изредка попадались партии растворителя, дававшие промежуточные результаты. При проведении этого простого теста как для относительно дешевого этилацетата (Burdick and Jackson), так и для умеренно дорогого {Pierce) получены хорошие результаты.

Добавление различных протекторов в реагенты и растворители в последние годы практикуется реже, чем ранее (например, внесение соляной и аскорбиновой кислот). Не так часто, как ранее, применяется добавление восстановителей в хлоробутан, особенно если для анализа производных Ser и Thr используется метод ВЭЖХ*.

Для очистки реактивов необходимо иметь перегонные ^аппараты. Ди-стилляционные установки с вращающейся мешалкой стоят около 4000— 30 000 долл. США (B/R Instrument Corp.).

* Добавление дитиотреита во все реагенты и растворители, используемые на стадиях отщепления тиазолинонов и превращения последних в ФТГ, в настоящее время считается обязательным для проведения высокочувствительного анализа. — Прим. перев.

432

15. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

15.6. Основные проблемы, возникающие

при использовании автоматического секвенатора

15.6.1. Вакуумная система

Большая часть затруднений при автоматическом определении структуры пептидов и белков связана с неполадками вакуумной системы. Устранение утечек в этой системе и поддержание необходимого вакуума занимает большую часть рабочего времени оператора и инженера, обслуживающих прибор. При ликвидации утечки необходимо прежде всего найти и изолировать участок разгерметизации. Эта работа включает набор приемов, позволяющих оператору определить конкретную часть прибора, в которой произошла утечка: реактор, линия, соединяющая реактор и гребенку-распределитель линии низкого вакуума, участок между гребенкой и вакуумным насосом.

В большинстве случаев наличие утечки обнаруживается после замыкания всей линии низкого вакуума на реактор. Обычно это помогает определить, является ли реактор причиной неполадки. При отрицательном заключении следует проводить поиск от реактора к насосу, а не наоборот.

15.6.1.1. Утечка вакуума в реакторе. При разгерметизации реактора существуют два источника утечек. Во-иервых, это линии подачи реагентов, трещины в мембранах, неправильное размещение соединительных линий. Это наиболее частые причины значительного ухудшения вакуума. Во-вторых, утечки (хотя и гораздо реже) могут появиться в линиях отбора растворителей из реактора и в линиях продувки реактора азотом. Наконец, надо тщательно проверить прокладочные кольца на наличие искривлений, разрывов и чрезмерного разбухания.

15.6.1.2. Утечки в гребенке линии низкого вакуума. От гребенки отходят три линии: одна — к источнику балластного азота, вторая — к клапанам, третья — к соленоидному клапану низкого вакуума. Следует поочередно перекрыть каждую из этих линий и проверить вакуум в системе. Мы обычно используем резиновую пробку, покрытую смазкой. Если разгерметизация обнаружена в линии, идущей к клапану балластного азота, то утечка обычно обусловлена поломкой трехходового азотного клапана, соединенного с гребенкой для распределения азота. Этот дефект особенно часто обнаруживается па приборах, интенсивно работающих по программам с использованием ДМАА. Второй причиной ухудшения вакуума часто бывает слишком большое «отпирающее» давление азота в линии управления клапанами, из-за чего клапан постоянно открыт. Если утечка прослеживается до самого клапана подачи реактивов, то это означает, что лопнула одна из диафрагм клапана. Эту поломку обычно обнаруживают только опытные инженеры.* Однако чаще всего утечка прослеживается до соленоидного клапана низкого давления; это случается на приборах, на которых длительно проводилась работа с ДМАА. Соленоидный клапан низкого давления следует регулярно заменять.

15.6.1.3. Утечка между насосом и гребенкой низкого вакуума. Диагностику таких повреждений проводят, отсоединив линию, ведущую к гребенке низкого вакуума и закрыв ее резиновой пробкой, покрытой смазкой. В этом отсеке вакуум должен быть ^50 мм рт. ст.; если это условие не соблюдается, то либо существует утечка между гребенкой и насосом, либо ремонта или замены требует сам насос. Замены можно избежать, проверив вакуум на самом насосе. Разумеется, следует заменить масло в насосе, оба вакуумных датчика, линии, соединяющие датчики с насосом, и соединения между гребенкой и насосом.

15.6. АВТОМАТИЧЕСКИЙ CEKBEHATOP

433

15.6.2. Утечки в вакуумной линии в системе с одним насосом

При этой схеме насос низкого вакуума используется только для активации клапанов подачи реагентов и для вакуумирования коллектора, и поэтому он не доставляет больших хлопот. Наш насос работал нормально более двух лет даже без смены масла! Однако система высокого вакуума, по нашему опыту, может быть источником трудно определяемых утечек, хогя и более редких, чем в схеме с двумя насосами. При наличии крана перед входом в охлаждаемую ловушку легко проверить наличие утечки до и после ловушки. Этот прием особенно полезен, так как многие осложнения, вызываемые, казалось бы, утечкой вакуума в приборе, в действительности зависят от работы ловушки.

Проверив вакуум при закрытом кране, закрывают выход из ловушки большой резиновой пробкой, покрытой вакуумной смазкой, и открывают кран. Утечки в ловушке возникают либо в сливной линии либо в местах плохой герметизации выводов ловушки. Полное размораживание ловушки и герметизация выхлопной линии обычно устраняют проблему (временно). Лучшим решением было бы изменение конструкции узла слива. Разгерметизация выводов устраняется повторным смазыванием кольцевых прокладок или их заменой.

По нашему опыту, утечки вакуума между охлаждаемой ловушкой и реактором маловероятны; ни соленоидные клапаны, ни клапан воздушного цилиндра не были источником серьезных затруднений.

15.6.3. Программирующее устройство

Оператору трудно обнаружить неполадки в работе программирующего устройства. Для замены вышедших из строя деталей и узлов необходимо участие специалиста. Источником многих сбоев, трудных для обнаружения, но легко устранимых, являются счетчики (фирмы Veeder-Rooder). Отказы в работе (залипание контактов) подтверждаются срабатыванием автоматической блокировки при добавлении реагентов по истечении контрольного срока, заведомо большего, чем время добавления реагентов. Если это происходит при работе секвенатора в автоматическом режиме, срабатывают блокировки и процесс останавливается. По нашему опыту, большая часть случаев автоблокировки прибора вызывается именно отказами в работе счетчиков указанного типа. При обнаружении этой причины остановки процесса простая замена счетчика снимает проблему. Другие неполадки, вносимые программирующим устройством, связаны со щетками; для их замены требуется участие специалиста. Во многих лабораториях пренебрегают профилактической очисткой программирующего устройства, в частности не проводится своевременная чистка его головки, хотя это важное условие нормальной работы секвенатора.

15.6.4. Реле

Вся электроника секвенатора чрезвычайно надежна, за исключением реле. Существует несколько простых приемов поиска причин отказов реле. Первый— срабатывание автоблокировки подачи реагентов. Хотя чаще всего это связано с отказом таймера подачи реагентов, но и отказы реле могут быть причиной срабатывания блокировки. Второй причиной является поломка ре

страница 67
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
инвентарь для спортзала
ремонт холодильника Liebherr SBS 61I4
Акция сайта - кликни получи скидку в KNS по промокоду "Галактика" - принтер Kyocera - поставщик товаров и оборудования для бизнеса.
клапан огнезадерживающий козп2 описание характеристики

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)