химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

лубой, заштрихованные — в оранжевый, е — ДАБТК-производное диэтиламина; U — побочные продукты разложения избытка реагента. Подробно о ДАБТГ-производных серина, треонина, лизина см. работу [3].

нии 6 мм от прилегающих сторон с помощью микропипетки на 1 мкл (Я. Е. Pederson) с тонким, тщательно отшлифованным сферическим кончиком. Диаметр пятна не должен превышать 1 мм, при нанесении пользуются феном с холодным воздухом. Двумерную хроматографию проводят в закрытых камерах (30X80X80 мм) в восходящем потоке растворителя. Насыщение фазами необязательно. Растворитель / (в первом направлении): вода — уксусная кислота (2:1), растворитель 2 (во втором направлении): толуол — я-гексан — уксусная кислота (2:1:1).

Разделение производных Не и Leu достигается одномерной хроматографией на пластинках с силикагелем в системе хлороформ— этанол (100:3) [9]. После высушивания пластинку помещают в пары HCI, при этом желтые пятна превращаются в красные или голубые (рис. 14.3). Успешная идентификация ДАБТГ-производных аминокислот в значительной степени за-

14.6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДАБТГ-АМИНОКИСЛОТ

423

L/1

s

г

О

Время, мин

РИС. 14.4. Разделение смеси ДАБТГ-производных аминокислот (5 пмоль каждого) методом ВЭЖХ на колонке Zorbax ODC. Условия хроматографии: растворитель А — 35 мМ ацетатный буфер (рН 5,0), растворитель Б — ацетонитрил. Градиент от 45 до 70% буфера Б в течение временного интервала 0— 10 мин; 70% Б 10—12 мин; 70—80% Б 12—14 мин; 80% Б 14—22 мин; 80 — 45% Б 22—25 мин. Температура колонки 22 °С. Скорость ленты самописца 40 см/ч. Детекция при 436 нм, шкала — 0,005 опт. ед.

висит от искусства экспериментатора в проведении хроматографии и интерпретации полученных результатов [2, 10].

Необходима большая практика для того, чтобы корректно идентифицировать производные таких аминокислот, как серии, треонин и лизин, каждое из которых дает на хроматограмме несколько пятен [3, 10].

14.6.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография

ДАБТГ-производные аминокислот могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе (рис. 14.4; условия указаны в подписи). Метод делает возможным количественную оценку результатов и особенно удобен в сочетании с твердофазной деградацией. Однако при анализе не проявляются различия в окраске между тиокарбамильными производными (голубые) и тиогидантоинами (красные), которые отчетливо видны на тонкослойной хроматограмме,

14.7. Заключение

Ниже перечислены основные преимущества ДАБИТЦ—ФИТЦ-методики по сравнению со стандартными методиками ручного определения аминокислотной последовательности.

1. Чувствительность: 1—10 нмоль пептида или белка достаточно для определения последовательности в 20—30 остатков, что в 10—20 раз превышает возможности других методов.

424 14. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 4-ДИМЕТИЛАМИНОАЗОБЕНЗОЛ-4'-ИЗОТИОЦИАНАТА

2. Эффективность: последовательность в 20—30 аминокислот может быть установлена без особых затруднений как в жидкофазном, так и в твердофазном вариантах деградации. Таким образом, этот метод существенно не уступает автоматическим методам секвенирования.

3. Простота: для реализации методики необходимо простое оборудование. Использование ТСХ, хотя и не обеспечивает количественной оценки, однако позволяет с достаточной степенью надежности идентифицировать все ДАБТГ-производные аминокислот.

Литература

1. BridgenJ., Biochemistry, 15, 3600—3604 (1976).

2. Chang J.-Y., Biochem. J., 163, 517—520 (1977).

3. Chang J.-Y., Biochem. Biophys. Acta, 578, 175—187 (1979).

4. Chang J.-Y., Biochem. Biophys. Acta, 578, 188—195 (1979).

5. Chang J.-Y., Biochem. J., 199, 557—564 (1981).

6. Chang J.-Y., Methods Enzymol., 91, 79—84 (1983).

7. Chang J.-Y., Methods Enzymol., 91, 455—466 (1983).

S.Chang J.-Y., Creaser E. H., Beatley K. WBiochem. J., 153, 607—611

(1976) .

9. Chang J.-Y., Creaser E. H., Hughes G. J., J. Chromatogr., 140, 125—128

(1977) .

10. Chang J.-Y., Brauer D., Wittmann-Liebold В., FEBS Lett., 93, 205—214

(1978) .

11. Edman P., Henschen A., In: Protein Sequence Determination, Needleman S. B. (Ed.), 2nd ed., Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 232—279 (1975).

Глава 15

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ АВТОМАТИЧЕСКОГО ЖИДКОФАЗНОГО АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

М. ЗИГЕЛЬМАН, Дж. Д. КАПРА (М. SIEGEL-MAN, J. D. CAPRA, Department of Microbiology, The Universiii/ of Texas Health Science Centre at Dallas, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, Texas 75235, U.S.A.)

15.1. Введение

Создание автоматического пептидно-белкового секвенатора [1], его последующие усовершенствования и использование оказали большое влияние на методологию определения структуры белков. Вклад автоматических методов в изучение структуры белков можно оценить по быстрому росту накопленных данных о структурах [4—8]. Назрела необходимость создания компьютерных систем хранения и выдачи данных для того, чтобы можно было полнее использовать опубликованные последовательности аминокислот (прим. ред. в конце главы).

Определение структуры белков сегодня оказывает гораздо большее влияние на решение биологических проблем, чем 15— 20 лет назад. Это обстоятельство объясняется необычайной эффективностью современных приборов и чувствительностью систем детекции, позволяющих исследователю определять полную структуру белка, располагая <100 нмоль материала.

В этой главе рассматриваются некоторые методики, используемые в настоящее время в автоматическом ЖФ-анализе аминокислотной последовательности пептидов и белков. Рассматриваются правила эксплуатации прибора, методы подготовки образца и способы контроля состояния прибора. Помимо этого, обсуждаются вопросы использования носителей и основные проблемы автоматического определения последовательности. Опубликованы обширные обзоры по каждому из упомянутых вопросов [10, 14, 16].

15.2. Подготовка образца

Невозможно обсуждать размер навески и степень пригодности образца для проведения анализа, не упоминая об особенностях и возможностях самого прибора, выбранной программы анализа, вспомогательного оборудования, потому что направление обсуждения во многом диктуется тем, применяется ли 1 М или 0,1 М раствор квадрола [3], используется ли полибрен совместно с охлаждаемой ловушкой или без нее. В большинстве слу-

426

15. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

чаев в зависимости от этих различий рабочие параметры анализа могут измениться почти на порядок (но не более). Кроме того, на результат определения влияет природа буфера (квадрол или Г^ГЧ-диметилаллиламин, или сокращенно ДМАА).

13 лет назад, когда наша лаборатория занималась определением аминокислотной последовательности тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, для установления последовательности из 30—40 аминокислот обычно требовалось 10—20 мг образца. В настоящее время, применяя модифицированный прибор, 0,1 М квадрол, полибрен, охлаждаемую ловушку, мы регулярно проводим определение 60—80 остатков, загружая п прибор 1—2 мг образца (двукратное увеличение эффективности отщепления). Трудно точно указать причины такого улучшения результатов — вероятнее всего, проявляется взаимное влияние многих факторов.

Обычно мы готовим образцы к анализу на секвенаторе лио-филизацией их из воды, разбавленных растворов кислоты, летучих водных буферов. Образцы хранятся в закрытых сцин-тилляционных баночках в виде белого пушистого порошка. В нашей практике бывали случаи, когда образцы, не имевшие такого внешнего вида, не удавалось анализировать. Причины подобных неудач не ясны, но, возможно, они связаны с нерастворимостью образца и наличием в нем примесей. Из-за трудностей идентификации остатков цистеина большинством обычных методов определения ФТГ-производных аминокислот почти всегда перед анализом последовательности мы восстанавливаем и карбоксиметилируем наши образцы радиоактивными реагентами. Поэтому небольшая аликвота каждого определяемого ФТГ-производного проверяется на наличие радиоактивности.

Образцы, содержащие соли, нельзя наносить в реактор секвенатора, так как это может привести к вымыванию всего образца. Это легко прослеживается при анализе радиоактивно меченных препаратов — в продуктах первых двух-трех циклов* отщепления радиоактивность постоянно и сильно уменьшается, достигая в конце концов уровня фона. Поэтому следует избегать присутствия солей в реакторе секвенатора. В последние годы часто наносят образцы в присутствии ДСН. Хотя этот прием не получил очень широкого распространения в нашей лаборатории, наличие до 1% ДСН оказывается обычно полезным для растворения образцов, в особенности мембранных белков, выделенных из ДСН-гелей, без ущерба для последующего определения структуры белка.

В выборе наилучшего растворителя для нанесения образца в реактор нет единодушного мнения, и используемые гисте-

15.2. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА

427

йы растворителей меняются от лаборатории к лаборатории. По-видимому, этот вопрос никем не изучался систематически. Мы растворяем образцы в 25%-ной уксусной кислоте. Если они при этом не растворяются, то их нагревают до 80 °С в течение 10—30 мин с одновременным тщательным перемешиванием на вибромешалке. Если и такая обработка не помогает, то образец немедленно лиофилизируется и сохраняется в таком состоянии в течение 24 ч. На следующий день можно использовать два разных варианта растворения. Во-первых, можно по-пробовать растворить его в 1 М аммиаке. Многие белки растворяются при повышении рН среды, поэтому переход к 1 М аммиаку позволяет перевести в раствор около половины белков, не растворимых в 25%-ной уксусной кислоте. Если белок не растворяется в аммиаке, обычно он вновь лиофилизируется, а нанесение в секвеиатор задерживается еще на 24 ч. Второй вариант, часто используемый в нашей лаборатории, заключается в растворении образца в концентрированной летучей органической кислоте (муравьиная или гептафторомасляная). Во многих лабораториях гептафторомасляную кислоту (ГФМК) регулярно используют для этой цели. Мы не применяем ее для растворения образцов из-за трудностей обращения с ГМФК> а также ее хранения и использования в качестве растворителя общего назначения. Однако можно применять кислоту, заливаемую в секвеиатор, и тем самым исключить некоторые осложнения, связанные с хранением этого опасного реактива.

Белки, заведомо имеющие неблокированную N-концевую аминокислоту, но не поддающиеся анализу на секвенаторе, ведут себя так по разным причинам. Если в ходе восстановления и алкилирования (в гидрохлориде гуанидипа или в мочевине) не было тщательного контроля рН (>7,0) и концентрации ал-килирующего агента, то существует определенная вероятность реакции этого агента с N-концевой аминокислотой. Если это происходит, то белок оказывается «блокированным». Эта частная проблема становится бедствием, ибо не существует удобного способа удаления алкилирующей группы. Второе затруднение возникает, если белок нерастворим в одном или нескольких реагентах (растворителях). Мы обнаружили, что чаще всего это относится к квадрольному буферу. Часто, когда в присутствии квадрола было невозможно провести анализ, замена его на ДМАА-буфер позволяла получить отличные результаты.

После нанесения каждого образца, по до начала каждого анализа па приборе надо выполнить несколько операций. В нашей лаборатории проводят две таких операции. Первая—«высушивание образца» — заключается в попеременной продувке реактора аргоном и вакуумировании. Такая подготовка позволяет получить на стенке реактора тонкую, равномерно распре-

428

15. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

деленную сухую пленку образца. Эта операция автоматически проводится перед началом каждого анализа, но затем автоматически же исключается из общей программы анализа. После этого обычно проводится другая подготовительная операция — один полный цикл отщепления при отключенной подаче ФИТЦ в реактор (клапан подачи этого реагента R{ в положении «off»). Это задерживает весь процесс определения не более чем ¦на 10 мин после сушки образца, потому что сразу же после ^выполнения по программе команды «добавление R\» можно включить клапан «добавление Ri» и далее весь процесс продолжается автоматически по полной обычной программе.

Программирование при помощи микропроцессора позволяет упростить выполнение этих операций. Мотивы для указанного «высушивания — вакуумирования» очевидны. Перед добавлением ФИТЦ и квадрола важно тщательно высушить образец и равномерно распределить его по поверхности реактора. Обычно образцы анализируются без добавления ФИТЦ в первом цикле отщепления для удаления (промывками) всех посторонних примесей, ясно детектируемых ВЭЖХ. Такая предварительная обработка образца служит дополнительным средством стандартизации условий нанесения образца в реактор и подготовки его к анализу.

15.3. Сравнение квадрола с летучими буферами

Со времени появления секвенатора квадрол оставался главной составной частью буферов. Он удовлетворял всем основным требованиям автоматического анализа, но обладал единственным недостатком — для его удаления необходима экстракция реакционной массы растворителями (например, этилацетатом), в которых растворяются некоторые пептиды. Во избежание этого в 70-е годы стали широко использовать летучие буферы на основе ДМАА, Ы,Ы-диметилбензиламина (ДМБА) и тому подобных аминов. И только после появления [3] в 1975 г. программы с применением 0,1 М квадрола предложения использовать небелковый носитель — полибрен — и введения в комплект прибора охлаждаемой ловушки буферы на основе квадрола снова оказались приемлемыми.

ДМАА имеет два очевидных преимущества. Во-первых, он лучше квад-* рола растворяет многие белки. Доказательством этого служат результаты сравнительного анализа многих белков. Во-вторых, летучесть ДМАА позволяет исключить промывку реакционной массы этилацетатом и ограничиться только промывкой бензолом.

Для уменьшения вымывания коротких пептидов при использовании --квадрола в реактор вводят полибрен и применяют буферы с низкой концентрацией квадрола.

В табл. 15.1 приведены выходы С-концевой аминокислоты для пяти пептидов, аминокислотная последовательность которых анализировалась в различных условиях: с использованием квадрола или ДМАА, с добавлением или без добавления полибрена.

В графе А представлены результаты, полученные при использовании ДМАА^тго стандартной «пептидной» программе без каких-либо добавок; в графе Б — результаты анализа с добавлением полибрена. В обоих случаях

15.3. СРАВНЕНИЕ КВАДРОЛА С ЛЕТУЧИМИ БУФЕРАМИ

429

Таблица 15.1. Сравнение результатов анализа на секвенаторе с использованием 0,1 М квадрольного буфера, ДМАА-буфера в присутствии и в отсутствие полибрена

Выход8, нмоль

Пептиды

Л Б В Г

Lys-содержащие пептиды TISK

GQLLPQEK TLFAGLCVIK

Arg-содержащий пептид

EQLNLR Trp-содержащий пептид

AGEEDCITSW

2,7 7,1 0 4,5

2,0 5,1 0 4,2

2,6 5,1 0,25 5,0

2,9 5,8 2,0 4,7

2,0 6,1 0,20 5,7

-/

а Л — ДМАА (без полибрена); Б — ДМАА (с полибреном); В — ОД М квадрол (без полибрена); Г — ОД М квадрол (с полибреном). Указан выход С-концевой аминокислоты пептида (наномоль) при загрузке в реактор секвенатора 10 нмоль каждого

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
подвесные подставки под телевизор
частотныйпреобразователь fc-051p2k2 в хабаровске
Кастрюли Suprema купить
wizardfrost.ru

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.03.2017)