химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

омых ФТГ относительно пиков примесей, то можно синтезировать этиловые эфиры тех же ФТГ.

ФТГ-Ser и ФТГ-Thr. Анализ этих ФТГ-производных лучше всего проводить, предприняв некоторые меры предосторожности (добавление антиокси-

416 13. АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИОНОВ АМИНОКИСЛОТ

Время, ми

РИС. 13.3. ВЭЖХ метиловых зфиров ФТГ-Asp и ФТГ-Glu, Условия ВЭЖХ указаны в разд. 13.2.1.5; условия этерификации — в разд. 13.2.1.6. а — разделение стандартной смеси ФТГ-производных аминокислот (40 пмоль, шкала — 0,005 е. о. п.); б—та же смесь, содержащая метиловые эфиры; в и г—разделение продуктов 2-го цикла отщепления по Эдману (рибонуклеаза, ГФ-секве-натор, 0,005 е. о. п.); в — прямое определение ФТГ-Glu; г — анализ метилового эфира ФТГ-Glu. Перед началом анализа к каждому образцу добавлено ФТГ-производное норлейцина (ФТГ-Nor). Указаны пики типичных примесей (дитиотреит) и побочных продуктов взаимодействия ФИТЦ с диметиламином, а также продукты разложения ФИТЦ. Для удаления примесей, реагирующих с аминогруппами, добавлен Gly-Gly, дающий ФТГ-Gly.

даптов, например дитиотреита, во все растворители, перегонка ТФУ или гептафторомасляной кислоты над дитиотреитом). Важно проводить конверсию водной кислотой немедленно после сбора отщепленных АТЗ в коллекторе фракций. Можно добавлять раствор АТЗ в хлоробутане к раствору ТФУ в конверторе с последующим быстрым высушиванием, что помогает увеличить выход ФТГ-производных этих аминокислот. Для быстрого проведения этого процесса лучше всего нспользозать автоматический конвертор.

Коммерческие препараты ФТГ-Ser и ФТГ-Thr могут быть не идентичны тем же производным, отщепленным на секвенаторе. Лучше всего определять время выхода и проводить количественный анализ производных Ser и Thr, анализируя белок известной структуры, содержащий Ser и Thr (например, Scr-З в миоглобине кашалота, Thr-З в рибонуклеазе быка; см. рис. 13.2). Учитывая выход аминокислот, стоящих в последовательности до и после остатков Ser и Thr, можно определить поправку на разрушение ФТГ-производных этих аминокислот. Эти же белки можно использовать для оптимизации условий работы секвенатора и увеличения выхода ФТГ-производных аминокислот (рис. 13.2).

13.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

417

Надежность обнаружения ФТГ-Ser и ФТТ-Thr можно повысить, детектируя их дегидропроизводные на длине волны 314 нм. Для продуктов отщепления на секвенаторе величина поглощения при 314 нм сильно меняется, так как могут образовываться не только дегидропроизводные, по и продукты присоединения к ним дитиотреита. По нашим данным, ФТГ-Tlir, полученный на газофазном секвенаторе, дает два или четыре пика, два из которых элюируются до и после ФТГ-Туг на колонке С8 (рис. 13.2). Полученный в тех же условиях ФТГ-Ser выходит с колонки непосредственно перед производным Ala (рис. 13.2). Вещества, элюируемые в этих положениях, не поглощают при 314 нм. При работе на ЖФ-, ТФ-, ГФ-секвенаторах получаются разные результаты. Лучшим решением вопроса в этих случаях является, как указано ранее, анализ стандартного белка.

ФТГ-Cys. Методика идентификации остатков Cys зависит от природы химической модификации сульфгидрильной группы остатка цистеина до анализа на секвенаторе. Для количественной оценки содержания цистеина наиболее удобно использовать меченое [С14]-карбоксиметильное производное, полученное восстановлением и последующим алкилированием образца [С14]-иодоацетамидом. Все отщепленные остатки проверяют на наличие радиоактивности. Кроме того, можно определить время элюирования соответствующего производного цистеина, оценить количественно его содержание и использовать эти данные для хроматографнческой оценки содержания Cys. Можно анализировать и ФТГ-производное цистеиновой кислоты, однако оно элюируется с колонки очень быстро, и при наличии многих соединений, также выходящих с колонки, содержание ФТГ-производного цистеиновой кислоты трудно оценить (тем более количественно).

13.2J7. Высокочувствительный анализ. При анализе образцов, содержащих <1 нмоль полипептида, наличие посторонних соединений, появляющихся из реактивов, растворителей и даже из пробы образца, может вызвать большие затруднения при идентификации. Реактивы собственной очистки следует дочищать, покупные — проверять на чистоту. Методики очистки приводятся в работах [7, 8].

Моно- и дифенилтиомочевина — обычные примеси, образующиеся в ходе реакции Эдмана в ГФ-секвенаторе при взаимодействии ФИТЦ с диметилами-ном. Кроме того, дополнительные пики на хроматограммах дают полибрен и примеси, присутствующие в органических растворителях и буфере, используемом на стадии карбамоилирования.

13.2.2. Газожидкостная хроматография

В нескольких работах излагаются условия ГЖХ ФТГ-производных аминокислот. Особый интерес представляют два практических- обзора [1, 15]. В руководствах фирмы Bekman Instruments дано детальное описание условий ГЖХ-аиализа.

13.2.3. Тонкослойная хроматография

Существует практическое руководство по одномерному анализу ФТГ-производных аминокислот методом ТСХ [3]. Большое достоинство метода заключается в возможности одновременного анализа сразу нескольких остатков, отщепленных на секвенаторе. Следует анализировать ^1 нмоль образца; предпочтительнее иметь дело с 50—70 нмоль. Наличие остаточных аминокислот сильно затрудняет интерпретацию результатов, поэтому для их подтверждения рекомендуется использовать второй метод. Для определения ФТГ-Arg и ФТГ-His следует проводить ВЭЖХ или ставить обратный гидролиз с последующим аминокислотным анализом продуктов гидролиза.

27—703

418

13. АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИОНОВ АМИНОКИСЛОТ

Двумерное разделение чрезвычайно удобно для идентификации, так как на одну сторону пластинки можно нанести смесь стандартов, а на другую — образец. Чувствительность определения повышается при добавлении к хро-матографическому растворителю флуоресцирующего индикатора. Анализ можно проводить на листах полиамида (50X50 мм), а хроматографию — в небольших закрытых сосудах. Эта методика не позволяет обнаруживать ФТГ-Arg и ФТГ-His, но она используется в некоторых лабораториях как ценное дополнение к другим методам.

13.2.4. Обратный гидролиз ФТГ-производных аминокислот

Описано несколько реагентов для обратного гидролиза (щелочи, иодоводо-родная кислота, метансульфоновая кислота, соляная кислота). Лучше всего работает методика, по которой образец гидролизуют 6 М соляной кислотой, содержащей 0,1% хлорида олова(П) [14]. Образцы высушивают в стеклянных ампулах для гидролиза, добавляют реагенты, продувают азотом для удаления кислорода, запаивают под вакуумом. Гидролизуют при 150 °С в течение 4 ч. Затем образцы сушат и анализируют аминокислотный состав. При этом из большинства тиазолинонов можно получить с хорошим выходом соответствующие аминокислоты. Thr превращается в а-аминомаслянук> кислоту, Ser — в Ala, а Тгр — в Gly. Поэтому для идентификации Ser и Тгр необходим второй метод определения (ТСХ, ГЖХ или ВЭЖХ).

Литература

1. Bridgen J.r Graffeo A. P., Karger В. L.r Waterfield Af. ?>., In: Instrumentation in Protein Sequence Analysis, Perham R. N. (Ed.), Academic Press, London, New York, San Francisco, pp. 111—145, 1975.

2. Edman P., Begg G., Europ. J. Biochem., 1, 80—91 (1967).

3. Edman P., Henschen A., In: Protein Sequence Determination, Needleman S. B. (Ed.), 2nd edn, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg New York, pp. 232— 279 (1975).

4. Harris J. U., Robinson Д, Johnson A. /., Anal. Biochem., 105, 239—245 (1980),

5. Hawke D., Pau-Miau Y„ Shivety J. Anal. Biochem., 120, 302—311 (1982).

6. Henderson L. E., Copeland T. D.t Oroszlan S., Anal. Biochem., 102, 1—7 (1980).

7. Hewick R. AL, Hunkapiller Af. W„ Hood L. E., Dreyer W. J. Biol. Chem., 256, 7990—7997 (1981).

8. Hunkapiller Al W.t Hood L. ?., Methods Enzymol., 91, 486—493 (1983).

9. Hunkapiller Af. W.f Hewick R. AL, Dreyer W. J., Hood L. E.y Methods Enzymol., 91, 399—413 (1983).

10. Johnson N. D.; Hunkapiller M. W.t Hood L. Anal. Biochem., 100, 335— 338 (1979).

11. Kulbe A. D., Anal. Biochem., 44, 548—558 (1971).

12. Kulbe K. D., Anal. Biochem., 59, 564—573 (1974).

13. Margolies AL N., Brauer A., J. Chromatorg., 148, 429—439 (1978).

14. Mendez E.t Lai С. У., Anal. Biochem., 68, 47—53 (1975).

15. Niall H. ?>., Methods Enzymol., 27, 942—1010 (1973).

16. Somack R.r Anal. Biochem., 104, 464—468 (1980).

17. Sottrup-Jensen L.t Petersen Т. E., Magnusson S., Anal. Biochem., 107, 456— 460 (1980).

18. Summers AL R., Smythers G. W., Oroszlan S., Anal. Biochem., 53, 624—628 (1973).

19. Zeeuws R.t Strosberg A. Z>., FEBS Lett., 85, 68—72 (1978).

20. Zimmerman C. L„ Apelta E., Pisano J. A, Anal. Biochem., 77, 569—573 П977)

Глава 14

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 4-ДИМЕТИЛАМИНОАЗОБЕНЗОЛ-4-ИЗОТИОЦИАНАТА (В РУЧНОМ ВАРИАНТЕ)

14.1. Введение

Определение аминокислотной последовательности пептидов деградацией по методу Эдмана основано на идентификации отщепленных фенилтиогидантоинов (ФТГ) аминокислот [11] по поглощению в УФ-свете (л.тах=269 нм, е= 16000). В модифи-

кации метода с использованием вместо фенилизотиоцианата (ФИТЦ) 4-диметиламиноазобензол-4/-изотиоцианата (ДАБИТЦ) образующиеся аминокислотные производные 4-диметиламино-азобензол-4/-тиогидантоины (ДАБТГ) —окрашенные соединения с Атах = 520 нм (в кислой среде) и ? = 47 000. Идентификация ДАБТГ-производных амипокислот в видимой области удобна и возможна на более высоком уровне чувствительности, чем для ФТГ-производных. ДАБТГ-производные нашли применение как для N-концевого анализа пептидов [6], так и для определения аминокислотной последовательности.

Разработана методика, комбинирующая два типа конденсации ДАБИТЦ—ФИТЦ для жидкофазного [5, 7, 10] и твердофазного [4, 7] методов анализа.

14.2. Реагенты и растворители

ДАБИТЦ синтезируют, как описано в работах [8, 9], или используют коммерческий препарат (фирмы Fluka и Pierce). •ФИТЦ (фирма Merck) перегоняют под азотом при пониженном давлении (7Кип~ 92 °С/12 мм рт, ст.). Пиридин (фирма Merck) трижды перегоняют: 1) над КОН (10 г/л), 2) нингидрином (1 г/л) и 3) КОН (10 г/л). Трифторуксусную кислоту (фирма Fluka) перегоняют над CaSO4-0,5H2O (10 г/л). Можно использовать пиридин («для секвенирования») и ТФУ фирмы Pierce.

Дж.-Ю. ЧАНГ (J.-Y. CHANG, Pharmaceuticals Research Laboratories, C1BA-GEIGY Limited, 4002 Basle, Switzerland)

ДАБИТЦ

27*

420 14. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 4-ДИМЕТИ Л АМИПО АЗОБЕНЗОЛ-4-ИЗОТИОЦИАН ATA

Полипептид 1—10 имоль. Добавляют 80 мкл 50%-ного водного пиридина и 40 мкл ДАБИТЦ в пиридине (10 имоль/мкл). Инкубируют под азотом при 52 °С 50 мин. Добавляют 10 мкл ФИТЦ и инкубируют еще 30 мин.

Экстрагируют смесью гептан — этилацетат (2 : 1) по 500 мкл 4 раза. Высушивают досуха в вакууме или в потоке азота.

Добавляют 50 мкл безводной ТФУ. Инкубируют (под азотом) 15 мин при 52 °С. Удаляют растворитель высушиванием в вакууме или в потоке азота.

Добавляют 50 мкл воды. Экстрагируют тиазолииопы 200 мкл бутилаце-тата и высушивают экстракт в вакууме для превращения в ДАБТГ-пропз-водные аминокислот.

Остаток подвергают следующему циклу деградации.

РИС. 14.1. Схема 1. Последовательность стадий в одном цикле жидкофазной деградации с использованием ДАБИТЦ — ФИТЦ-реагента.

Остальные растворители квалификации «для анализа» применяют без очистки.

Для идентификации используют полиамидные пластинки фирм Schleicher and Schtill или Cheng-Chin Со. Аминирование стеклянных шариков (CPG-75, фирма Serva) и их активацию л-фенилендиизотиоциапатом (ДИТЦ) проводят, как описано в гл. 12 [1].

14.3. ДАБИТЦ — ФИТЦ-методика в жидкофазном варианте [5Г 10]

Цикл деградации по ДАБИТЦ—ФИТЦ-методике схематически представлен на рис. 14.1. Следует обратить внимание на то, что

1) ДАБИТЦ не очень стабилен в пиридине, и его раствор лучше готовить ежедневно или перед каждым циклом деградации;

2) некоторые гидрофобные пептиды имеют тенденцию к осаждению в виде мелких частичек или топкой пленки во время экстракции. Осадок концентрируется обычно на поверхности раздела водной и органической фаз после центрифугирования и может быть по невнимательности удален пипеткой.

14.4. ДАБИТЦ — ФИТЦ-методика в твердофазном варианте [4]

Присоединение пептида или белка к активированному с помощью ДИТЦ аминостеклу и цикл твердофазной деградации по ДАБИТЦ—ФИТЦ-методике проводят, как изображено схематически на рис. 14.2. Конденсация пептида с твердым носителем и последующий анализ последовательности осуществляют в пробирках со стеклянными пробками, на дне которых находится «магнит» (2X6 мм). Помещают пробирку в нагревательный блок (52 °С) над магнитной мешалкой. На каждой стадии сушки используют стеклянную пробку (С-10) с пори-

14 5. ПРЕВРАЩЕНИЕ ТИАЗОЛИНОНОВ В ТИОГИДАНТОИНЫ

421

а

Полипептид 1—10 нмоль

1+0,8 мл 0,2 М NaHC03 — NaOH,

рН 8,9

4 +20—25 мг ДИТЦ-стекла

4 N2, 52 °С, 1 ч

4 +20 мкл этаиоламина

|N2, 52 °С, 15 мин

4 Промывка Н20 и СН3ОН

4 Сушка в вакууме

4 +600 мкл 67%-ного водного пиридина

4+50 мкл ФИТЦ

4 N2, 52 °С, 30 мин

4 Промывка СНзОН

4 Сушка в вакууме

4 +200 мкл ТФУ

4 N2, 52 °С, 15 мин

4 Промывка СНзОН

4 Сушка в вакууме

I ДАБИТЦ — ФИТЦ-деградация

б

4 +400 мкл 50%-ного водного пиридина

4 +200 мкл ДАБИТЦ (15 нмоль/мкл

пиридина)

4 N2, 52 °С, 45 мин

4 +20 мкл ФИТЦ

4 N2, 52 °С, 30 мин

4 Удаление супернатанта после легкого центрифугирования 4 Промывка 2 мл пиридина и 2 раза по 2 мл СНзОН 4 Сушка в вакууме 4 +200 мкл ТФУ 4N2, 52 °С, 15 мин 4 Удаление ТФУ в вакууме 4 Экстракция* тиазолинона 300 мкл СНзОН

4 Промывка СН3ОН

4 Сушка в вакууме

4 Следующий цикл деградации

* Идентификация ДАБТГ-аминокислот описана в тексте.

РИС. 14.2. Схема 2. Последовательность операций в иммобилизации пептида на твердом носителе (а) и цикле твердофазной деградации с использованием ДАБИТЦ — ФИТЦ-реагента (б).

стым фильтром (D2), чтобы предотвратить потери стеклянных шариков. Стеклянная матрица не должна подвергаться сильному перемешиванию во избежание растирания в порошок.

К 4.5. Превращение тиазолинонов аминокислот в тиогидантоины

Экстракт, содержащий тиазолинон аминокислоты, полученный при жидкофазиой или твердофазной деградации, упаривают и остаток обрабатывают смесью 5 М НС1—СН3СООН (1:2) при 52°С, 50 мин. Образец высушивают и перерастворяют в подходящем объеме этанола для последующей идентификации.

14.6. Идентификация ДАБТГ-аминокислот

14.6.1. Тонкослойная хроматография

Все ДАБТГ-аминокислоты, кроме Не и Leu, идентифицируют тонкослойной хроматографией на полиамидных пластинках (25X25 мм). Образцы наносят в угол пластинки на расстоя-

422 И. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 4-ДИМЕТИЛАМИНОАЗОБЕНЗОЛ-4-ИЗОТИОЦИАНАТА

-ДАБИТЦ-

Растворитель /

РИС. 14.3. Разделение на полиамиде ДАБТГ-производных аминокислот и побочных продуктов реакции.

Растворитель 1: вода — уксусная кислота (2:1); растворитель 2: толуол — «-гексан — уксусная кислота (2:1:1). ДАБТГ-производные обозначения одно-буквенным кодом для соответствующих аминокислот. Темные пятна — пятна производных, окрашенные в красный цвет; обведенные точками пятна — в го

страница 65
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
виды вывесок в магазине фото
спортивные рюкзаки форвард
канальная приточная установка веза купить
потолочный карниз с подсветкой

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.02.2017)