химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

контролю производственных процессов, а также внедрению более эффективных сорбентов с постоянно уменьшающимся размером частиц. Для анализа ФТГ-производных аминокислот в настоящее время используется три типа обращенных фаз — октильная, октадецильная, цианопропильная. Несколько фирм выпускают колонки с сорбентами, покрытыми указанными фазами и различающиеся типом и размером частиц (3—10 мкм). Эти носители имеют разную степень покрытия углеводородными цепями и дополнительной модификации (блокировки) остаточных силанольных групп. В последние годы мы испытали много колонок разных фирм и отметили значительное улучшение воспроизводимости разделения. Однако до сих пор наблюдается существенное различие в разделении некоторых пар ФТГ-производных аминокислот на колонках различных фирм, по описанию заполненных сорбентом одеюго типа. Во многих случаях можно почти полностью разделить стандартную смесь (за исключением какой-либо одной пары ФТГ-производных), состоящую из 18 компонентов. Иногда в случае ФТГ-Arg и ФТГ-His наблюдается значительный «хвост». Мы считаем, что единственным решением этой проблемы разделения является опробование разных колонок. По нашему мнению, по воспроизводимости разделения ФТГ-аминокислот и продолжительности жизни колонки наиболее подходящими являются колонки Zorbax С8 (фирмы Dupont). При проведении на этих колонках ~2000 анализов воспроизводимость времени удерживания ФТГ-производных аминокислот ото дня ко дню составляет 0,01 мин. По нашему опыту» сдинствеЕшой колонкой другого типа, дающей удовлетворительные результаты при хроматографии основных ФТГ-производных аминокислот, является цианопропильная колонка фирмы IBM.

13.2.1.4. Приготовление стандартных растворов ФТГ-производных аминокислот. Сухие ФТГ-производные (фирмы Pierce) растворяют в ацетонитрнле или в метаноле до концентрации ~7,5 нмоль/мкл, отбирают по две алпкво-ты, разбавляют для измерения поглощения при 269 нм. Зная коэффициенты молярного поглощения (табл. 13.1), можно определить точную концентрацию растворов и разбавить каждый раствор до концентрации 5 пмоль/мкл. ФТГ-Arg и ФТГ-His обрабатывают специально. Гидрохлориды этих соединений можно перевести в растворимые трифтороацетаты путем добавления 20%-ной ТФУ, раствор затем упаривают в потоке азота. Высушенные такие образом ФТГ-производные затем растворяют в ацетонитрнле и разбавдякгг до нужной концентрации, как указано выше. Готовят смесь, содержащую равные количества каждого ФТГ-производного (при разделении па С8-ко-лонках добавляют также ФТГ-производное норлейцина), разбавляют раствор до получения нужной концентрации ФТГ-производных аминокислот в подходящем объеме (например, 50 пмоль в 10 мкл). Растворы индивидуальных производных храпят при —20 °С в течение нескольких месяцев, а в виде смесей — несколько недель при той же температуре. Приготовление стандартных растворов ФТГ-Ser и ФТГ-Thr — особый случай и обсуждается ниже.

13.2.1.5, Разделение ФТГ-производных аминокислот методом обращенью-фазовой ВЭЖХ. Большинство из многочисленных опубликованных методик

13.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

411

Таблица 13.1. Молекулярные массы и экстинкция ФТГ-производных

аминокислот

ФТГ-производные Молекулярная масса

ФТГ-А1а 206 16 000

ФТГ-Asn 249 17 200

ФТГ-Asp 250 16 100

ФТГ-Arg НС1 328 15 900

ФТГ-Glu 264 15 900

ФТГ-Gln 263 17 000

ФТГ-Giy 192 14 900

ФТГ-His-HCI 309 15 500

ФТГ-Пе 248 17 000

ФТГ-Leu 248 16 700

OTr-N-e-OTK-Lys 398 29 000

ФТГ-Mct 266 17 100

ФТГ-Phe 282 15 500

ФТГ-Рго 232 14 300

ФТГ-KM-Cys 297 16 600

ФТГ-Тгр 321 19 700

ФТГ-Tvr 298 15 600

ФТГ-Val 234 16 500

для анализа ФТГ-производных имеет лишь незначительные преимущества по сравнению с первоначальным вариантом разделения, предложенным в 1977 г. [20], когда использовали сорбент с октадецильной фазой (С]8), ацетатные буферы и ацетонитрил. Единственное серьезное затруднение вызывала хроматография ФТГ-Arg и ФТГ-His, которые элюировались в виде гораздо более широких зон, чем ФТГ-производные других аминокислот. На колонках выпуска последних лет, заполненных сорбентом с меньшим размером частиц и имеющих большее число теоретических тарелок, можно добиться значительно большей эффективности разделения, но анализ ФТГ-Arg и ФТГ-His до сих пор представляет проблему при использовании колонок с фазой Cie. Острота этой проблемы зависит от содержания свободных силанольных (кислых) групп, остающихся после модификации носителей. Существенное улучшение результатов разделения можно получить при использовании колонок с фазами Cs (Dupont) и CN (IBM). Колонки фирмы Dupont (Zorbax Cs) наиболее пригодны для разделения ФТГ аминокислот, возможно, из-за того, что сорбент имеет высокую степень модификации остаточных силанольных групп. В данной главе приведены различные методики, заимствованные из литературы и модифицированные в нашей лаборатории.

Разделение на колонках с фазой С8.

Буферы. Исходный 1 М ацетат натрия доводят до рН 4,1 уксусной кислотой. Работают с двумя буферами А и 5, которые отличаются содержанием ацетонитрила. Оба буфера (А и В) содержат 0,008—0,02 М ацетата; буфер А содержит 10% ацетонитрила, буфер 5 — 80%. Растворы деаэрируют гелием. Колонка термостатирована при 43 °С, скорость потока элюента 2 мл/мин.

Колонка. Zorbax С8, 4,6x250 мм (Dupont). Между инжектором и колонкой присоединена спираль из трубки длиной не менее 600 мм, помещенная в термостат для предварительного обогрева буфера.

412

13. АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИОНОВ АМИНОКИСЛОТ

0,015 -

0,01

Г

X

ш

о о

0,005 -

РИС. 13.1. ВЭЖХ ФТГ-производных аминокислот на колонке Zorbax С8. Влияние концентрации соли в буфере на разделение производных Arg и His. Условия разделения приведены в разд. 13.2.1.5. Концентрация ацетата натрия (моль/л): а — 0,005, 6—0,01, 0 — 0,02. Обозначения аминокислот — в однобуквенном коде, Nor — ФТГ-производное норлейцина.

Условия анализа. Для оценки начальных условий разделения можно использовать линейный градиент буфера В от 20 до 40% в течение 8 мин. Результаты такого разделения показаны на рис. 13.1, а. Положения пиков ФТГ-Arg и ФТГ-His зависят от концентрации соли в буферах, и, как видно из рис. 13.1,6 и в, при изменении концентрации соли пики этих веществ могут перемещаться относительно пиков ФТГ-пронзводных других аминокислот. На разделение ФТГ-производных гидрофобных аминокислот влияет содержание буфера В в конце градиента. Проведя 2—3 анализа с различной конечной кон-Nor центрацней этого буфера, можно оптимизировать разделение; изменение концентрации в 1 % может оказаться решающим. Проведя оптимизацию хрома-тографических параметров, можно не менять условия разделения в течение нескольких недель. Точность анализа ,при этом зависит главным образом от воспроизводимости приготовления буферов. По мере старения колонки для сохранения прежнего положения пиков ФТГ-Arg и ФТГ-His на хроматограмме следует увеличивать концентрацию соли в буферах. Может потребоваться оптимизация условий элюирования этих двух соединений относительно ФТГ-производных других аминокислот и пиков'побочных продуктов, образующихся в ходе реакций, протекающих в секвенаторе. На рис. 13.2 приведены кривые элюирования с С8-колонки при определении ФТГ-производных аминокислот, полученных на газофазном секвенаторе.

Разделение на колонке с фазой С\&. Для анализа ФТГ-производных чаше всего используют колонки с фазой Ci8, производимые фирмами

5 10 15

Время,мин

t

о

О 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15

Времч,мим

РИС. I3.2. ВЭЖХ продуктов 21 цикла анализа по Эдману рибонуклеазы (ГФ-секвенатор). Условия хроматографии приведены в разд. 13.2.1.5 (0,0025 М ацетат натрия). Обозначения пиков примесей указаны в подписи к рис. 13.3.

414

13. АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИОНОВ АМИНОКИСЛОТ

Dupon (Zorbax ODS), Waters (Ci8 u,Bondapak), Altex (Ultraspere ODS).

Подробное описание методик для этих колонок можно получить от фирм-производителей и найти в журналах Analytical Biochemistry, Journal of Chromatography. Поскольку параметры колонок, производимых разными фирмами, сильно отличаются друг от друга, то это привело к появлению огромного числа публикаций, описывающих бесчисленное множество вариантов условий разделения. В последнее время значительно усовершенствованы как условия синтеза носителей, так и способы упаковки колонок, что позволяет надеяться на увеличение межлабораторной воспроизводимости результатов. Методология, описанная в работе [20], до сих пор лежит в основе серийного анализа. Хорошие результаты получают при использовании натрийацетатных буферов (рН 4,0—4,5) с концентрацией 0,001 — 0,04 моль/л, ацетонитрила или метанола в качестве органических модификаторов, а также градиента концентраций органического растворителя от 20 до 40% при температуре 40—45 °С. При этом остается проблема «хвостов» пиков ФТГ-Arg и ФТГ-His. При скоростях потока элюента до 2,5 мл/мин можно провести анализ менее чем за 20 мин. Ацетонитрил предпочтительнее метанола или этанола из-за более низкого уровня фона и меньшей вязкости при высоких концентрациях растворителя в буфере. Изменением концентрации соли в буфере можно повлиять на хроматографическое поведение ФТГ-Arg и ФТГ-His и на их положение относительно других ФТГ-производных аминокислот.

На разделение ФТГ-производных влияют температура, скорость потока элюента, концентрация органического растворителя, форма градиента. При оптимизации условий разделения на новой колонке полезно провести анализ при четырех разных температурах (например, при 25, 35, 45 и 55 °С), для оптимизации анализа производных гидрофобных аминокислот изменить конечную концентрацию ацетонитрила, скорость изменения градиента. Важное значение имеет предварительный подогрев буфера, проводимый в ¦соединительной трубке, помещенной между инжектором и колонкой. При необходимости следует изучить влияние рН. В литературе описаны примеры использования колонок с фазой Ct8, например:

1) колонка Zorbax ODS (Dupont); система ацетат натрия — ацетонитрил [5, 13, 20];

2) колонка piBondapak (Waters); ацетат натрия — метанол [19, 17];

3) колонка Ultrasphere ODS (Altex); ацетат натрия — ацетонитрил с добавкой ТГФ [16].

Разделение на колонках с CN-фазой.

Буферы. Исходный 1 М ацетат натрия доводят уксусной кислотой до рН 5.7. Буфер А—0,015—0,04 М ацетат натрия, содержащий 15% буфера В, который в свою очередь состоит из метанола (50%) и ацетонитрила (50%). Буферы деаэрируют гелием, элюирование приводят при 32 °С со скоростью 1 мл/мин. Для оптимизации разделения состав буфера меняют, как указано далее.

Колонка. Цианопропильная (IBM), размером 4,6x250 мм. Опубликова* иы условия полного разделения смеси ФТГ-производных обычных аминокислот на колонках Zorbax CN (Dupont) [10] и CN (IBM) [8]. Главное преимущество цианопропильных колонок перед колонками с фазой С]8— лучшая форма пиков ФТГ-Arg и ФТГ-His, большее время жизни колонки (число вводов пробы), большая чувствительность (отношение высота пика: количество ФТГ). Мы испытывали с 1982 г. колонки С3, С]8 и циано-цропильные и нашли, что в отношении формы пиков ФТГ-Arg и ФТГ-His колонки с фазами С8 и цианопропил имеют преимущество перед С^-колон-ками. По нашему опыту, срок службы С8-колонок и цианопропил (число вводов пробы) сопоставим. У нас нет опыта работы с колонками Zorbax ODS, достаточного для заключения о сроках службы этих колонок.

Оптимизацию разделения на цианопропильных колонках проводят из-

13.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

415

менением концентрации соли; добиваются того, чтобы пики ФТГ-Arg и ФТГ-His оказались между пиками ФТГ-производных других аминокислот. Увеличение концентрации соли сокращает время элюирования этих соединений. Следует учитывать, что наличие побочных продуктов реакции Эдма-на может диктовать свои условия выбора положения пиков ФТГ-Arg и ФТГ-His. По мере старения колонки для поддержания постоянства времени элюирования производных основных аминокислот необходимо увеличивать концентрацию соли. Для оптимизации разделения ФТГ-производных Туг, Val, Pro, Met следует менять соотношение ацетонитрила и метанола в буфере В. Увеличение концентрации метанола улучшит разделение произгод-ных Pro и Met, а снижение улучшит разделение ФТГ-Tyr и ФТГ-Val. Для оптимизации разделения производных Asn, Ser, Thr, Gin, Gly следует изменить начальную концентрацию буфера В и крутизну градиента буфера В. При наличии программирующего устройства можно поддерживать многоступенчатые градиенты, подобные описанным в работе [8], и благодаря этому добиться оптимального разделения. При воспроизведении этих градиентов следует учитывать различие в объемах смесителей разных систем.

Разделение ФТГ-производных аминокислот на фенилалкильных колонках. Описано эффективное, но длительное разделение на колонках u, Bond а -рак (фирма Waters) [6].

13.2.L6. Анализ ФТ Г-производных аминокислот в продуктах отщепления по Эдману. При анализе более чем I нмоль исходного пептида идентификация ФТГ-производных обычных аминокислот, полученных в ходе ручного или автоматического определения последовательности по Эдману, являс1ся однозначной. При работе с количествами >1 нмоль образца примеси, вносимые из секвенаторных реактивов, обычно не влияют на ВЭЖХ.

ФТГ-Arg и ФТГ-His. Для превращения анилинотиазолинонов в ФТГ-производные аминокислот лучше использовать не НС1, а ТФУ. Может потребоваться очистка ТФУ (обработка хромовой кислотой, перегонка над дитиотреитом для получения чистой ТФУ, свободной от пероксидов) [8]. Конверсию проводят с 20%-ной ТФУ при 55 °С в течение 20 мин. Затем кислоту удаляют в токе азота, образец растворяют в ацетонитрнле. При этом ФТГ-Arg и ФТГ-His анализируются в форме трифтороацетатов, а пс гидрохлоридов. Эта методика требует приготовления стандартов в виде трифтороацетатов (разд. 13.2.1.4). Время выхода с колонки указанных ФТГ-производных оптимизируют, меняя концентрацию соли в буфере.

ФТГ-Asp и ФТГ-Glu. Эти ФТГ-производные характеризуются небольшими временами удерживания, и при количественном анализе встречаются затруднения либо из-за образования множественных пиков, либо вследствие выходов этих производных из колонки совместно с дитиотреитом, добавляемым в секвеиаторные реагенты и растворители в качестве антиоксидапга. В случае ГФ-апализа показано, что это несущественно при использовании колонки с фазой С8 (рис. 13.2). Для увеличения времени удерживания ФТГ-производных кислых аминокислот их можно этерифицировать [8].

Методика. Готовят 1 М раствор ацетплхлорида в тщательно охлажденном метаноле (см. разд. 8.17.1.1). К пробе добавляют 50 мкл полученного раствора, выдерживают реакционную массу в течение 20 мин. Реагент удаляют испарением в потоке азота, образец растворяют в ацетонитрнле. Положение пиков метиловых эфиров производных Asp и Glu показано па рис. 13.3. При анализе ФТГ-производных в виде метиловых эфиров повышается точность количественного анализа из-за того, что эти сложные эфиры элюируются в области низкого уровня фона примесей, появляющихся в реакции Эдмана. Если необходимо получить иное положение пиков иск

страница 64
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
нанопленка
нео космо №343
треугольник световой короб такси в самаре
учеба по маникюру и наращиванию ногтей домодедово

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)