химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

m., 97, 56—64 (1979).

61. Wachter E.t Machleidt W.t Hofner H., Otto FEBS Lett., 35 97 (1973).

62. Wachter E., Hofner tf., Machleidt W., See [291, pp. 31—46.

63. Walker F E., Auffret A. D„ Came A., Gurnett A., Hanisch P., Hill D., Saras-te M., Eur. J. Biochem., 123, 253—260 (1982).

64. Waterfietd M. D.f Bridget: /., Sec [46|, pp. 41—71.

65. Westalt F. C, Scotchler J , Robinson А. В., J. Org. Chem., 37, 3363 (1972).

66. Wittmann-Liebold В., Порре-Seyler's Z. Physiol. Chem., 354, 1415—1431 (1973).

67. Wittmann-Liebold В., In Polypeptide Hormones, Beers R. F. J., Bassett E. G. (Eds.), Raven Press, New York, pp. 87—120 (1980).

68. Wittmann-Liebold В., In: Chemical Synthesis and Sequencing of Peptides and Proteins, Liu T.-Y., Schechter A. N., Heinrikson R. L., Condliffe P. G. (Eds.), Elsevier/North Holland, New York, pp. 75—110 (1981).

69. Wittmann-Liebold В., See [161, PP- 27—63.

70. Wittmann-Liebold B.t Ashman K., In Modern Methods in Protein Chemistry, 2, Tschcschc H. (Ed.), Walter de Gruyter, Berlin, New York, pp. 303 (1985).

71. Wittmann-Liebold В., Kihura Al, In: Methods in Molecular Biology. 1, Walker J. M. (Ed.), Humana Press, Clifton, Newr Jersey, pp. 221—242 (1984).

72. Wittmann-Liebold В., Lehmann Д., See [291, PP- 81—90.

73. Wittmann-Liebold В., Lehmann Д., See [51, pp. 49—72.

74. Wittmann-Liebold В., Geissler A.-W., Marzinzig J. Supramol. Struct., .3, 426—447 (1975).

75. Wittmann-Liebold В., Graff under H., Kohis tf., Anal. Biochem., 75, 621-— 633 (1976).

76. Wittmann-Liebold В., Brauer D., Dognin J. Af., See [47], pp. 219—232.

Глава 13

АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИНОВ АМИНОКИСЛОТ

М. Д. УОТЕРФИЛД, Дж. СКРЕЙК, Н. ТОТТИ (М. D. WATTERFIELD, G. SCRACE, N. TOTTY, Protein Chemistry Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PX, UX)

13.1. Введение

Отщепление по Эдману при помощи ФИТЦ — наиболее распространенный и надежный метод определения аминокислотной последовательности пептидов и белков. В настоящее время в анализе и больших, и малых пептидов используют ручной и автоматический методы; при этом в большинстве случаев идентификацию отщепленных аминокислот проводят в виде их ФТГ-производных. Анализу последних посвящено множество статей. В этой главе рассматривается пять основных методов анализа ФТГ-производных аминокислот.

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), использованный Эдманом и Бэггом и описанный в их классической работе, посвященной автоматическому секвенатору [2], наиболее прост в экспериментальном отношении, не требует дорогого оборудования, но характеризуется невысокой чувствительностью (~1 нмоль). ТСХ удобна как для ручного, так и для автоматического определения последовательности; однако это скорее качественный, чем количественный метод. Как бесспорное достоинство метода надо отметить возможность одновременного анализа нескольких образцов. Метод можно сделать полуколичественным, элюируя ФТГ с хроматографической пластинки, но обычно это не делается. При идентификации ФТГ-Arg и ФТГ-His ТСХ следует дополнять другими методами — ВЭЖХ тех же ФТГ-аминокислот, или аминокислотным анализом свободных аминокислот, полученных при обратном гидролизе ФТГ-аминокислот. Следует проводить обратный гидролиз при анализе только коротких пептидов и высокоэффективном определении последовательности аминокислот средних пептидов на секвенаторе с использованием наномольных количеств образца. Для анализа ФТГ-производных аминокислот с середины 60-х годов стала использоваться газожидкостная хроматография (ГЖХ). Этим методом можно быстро и количественно определить большинство, но не все ^ТГ-производные аминокислот. В неспособности ГЖХ обеспечить однозначную идентификацию ФТГ-производных всех 20 аминокислот заклю-

405

406

13. АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИОНОВ АМИНОКИСЛОТ

чается главный недостаток метода. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) позволяет быстро разделить и количественно идентифицировать ФТГ-производные всех 20 аминокислот на пикомольном уровне. Отметим еще один метод, используемый лишь в некоторых лабораториях. Это масс-спектрометрия; метод характеризуется наивысшей чувствительностью, но требует сложного оборудования, доступного лишь немногим лабораториям.

При выборе метода анализа надо четко учитывать цену и доступность оборудования, а также реальную чувствительность, необходимую для работы. В настоящее время предпочитают ВЭЖХ, особенно для высокочувствительных определений. В данной главе рассматривается главным образом этот аспект ее применения.

13.2. Аналитические методы

13.2.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография

В конце 70-х — начале 80-х годов происходил взрывообразный рост числа публикаций по ВЭЖХ ФТГ-производных аминокислот, причем в разных лабораториях работали на разных приборах, колонках и применяли разные буферы. Поэтому новичку трудно сделать правильный выбор условий разделения. В этом разделе описываются те системы, относительно которых мы имеем личный опыт. Замечания и оговорки, относящиеся к этим и другим системам, помогут читателю сделать выбор хроматографической системы.

13.2.1 .1. Оборудование. Большое число коммерческих моделей лроматографов доступно либо в виде набора модулей, либо в виде моноблоков. Часто можно собрать хроматограф из модулей, производимых разными фирмами. Это позволяет соблюсти разумный компромисс между ценой и качеством прибора, но неопытному аналитику не следует выбирать такой вариант. Основные требования к аналитической системе вкратце можно сформулировать следующим образом:

1) Система подачи растворителей должна обеспечивать возможность создания линейных градиентов при скоростях потока 0,1—2,75 мл/мин и при давлениях 0,3—35,0 МПа. Эффективность колонки повышается при уменьшении размера частиц; при этом возрастает рабочее давление (при сохранении длины колонки) и поэтому разумно предусмотреть возможность работы при больших давлениях. Растворители, используемые для градиентного элюирования, можно предварительно смешивать и подавать на колонку с помощью одного насоса (как прави-

13.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

407

ло, имеющего несколько головок). В то же время описаны системы, включающие несколько насосов, каждый из которых подает свой растворитель в смесительную камеру. В обоих случаях для создания градиента требуется электронное программирующее устройство; часто форма градиента выбирается из наоора готовых форм разной крутизны. Следует отметить, что добиться хорошей воспроизводимости разделения ФТГ-производных аминокислот при ВЭЖХ довольно трудно; важную роль при этом отводят подбору градиентов. Эффективность системы легко оценить, выполнив несколько разделений в одних и тех же условиях. Следует предусмотреть возможность задания и поддержания изократического режима разделения на разных участках анализа, особенно в конце градиентного разделения. С помощью электронного программирующего устройства система в конце каждого аналитического цикла нозвращается в исходное состояние. Используя систему, состоящую из водного буфера А и органического растворителя В*У надо иметь возможность на короткое время между анализами увеличивать содержание компонента В в элюенте до 100% (для С8-колонок см. разд. 13.2.1.5); это позволяет хорошо промыть колонку, а также способствует продлению срока службы колонки. Как и во всех хроматографических аналитических методах, колонка как средство разделения играет решающую роль в создании высокого разрешения. При наличии эффективной колонки нет необходимости в программировании скорости потока или в создании сложных форм градиентов с промежуточными изокра-тическими участками. Однако полезно иметь такие возможности для того, чтобы при необходимости использовать их.

2) Необходимо иметь инжектор, позволяющий наносить образец на колонку без сброса давления и соответственно без изменения скорости потока. При помощи инжектора на колонку наносят от одного до нескольких сотен микролитров раствора образца с точностью ±1%. Многие операторы быстро осознают преимущества автоматических инжекторов, оправдывающие высокую стоимость этих модулей.

3) Для оптимизации разделения по температуре термостат колонки должен контролировать температуру в, диапазоне 20—65 °С.

4) Поглощение элюата записывают на длине волны 254 нм в кюветах малого объема (10 мкл и менее) при давлениях в кювете до 3,5 атм. Полезно использовать второй канал детектирования (при 313 нм) для регистрации модифицированных производных Ser, Thr, образующихся в ходе автоматического

* Обычно это чистый органический растворитель (ацетонитрил, метанол и т. д.). — Прим. перев.

408

13. АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИОНОВ АМИНОКИСЛОТ

анализа последовательности. Конструкции проточных ячеек некоторых фирм позволяют свести к минимуму влияние изменения коэффициента преломления, происходящего при градиентном элюировании. По мере увеличения разрешающей способности колонки возрастает скорость анализа. При уменьшении диаметра колонки сокращается время пребывания элюируемых компонентов в проточной ячейке, поэтому для проведения скоростных анализов необходимо использовать детекторы, способные работать при малых значениях постоянной времени детектора. Рабочая чувствительность лучших (спектро)фотометров составляет 0,001 ед. опт. плотн. на всю шкалу при удовлетворительном отношении сигнала к шуму.

При использовании 1,0—0,01 нмоль пептида диапазон до 0,005 ед. опт. плоти, является достаточным, но при работе с меньшими количествами необходим более чувствительный детектор. При работе на микроуровие необходима оптимизация всех элементов прибора и параметров разделения; необходимы растворители высокой чистоты, потому что резко возрастает дрейф базовой линии в ходе высокочувствительного элюирования. Может понадобиться дополнительная очистка растворителей, буферов, воды.

5) Для регистрации результатов разделения необходима система записи данных идентификации ФТГ-производных аминокислот. Существует несколько типов интеграторов, обладающих разными возможностями. В большинстве случаев перед разделением продуктов отщепления проводят градуировку по методу внешних стандартов, что позволяет оценить удельные площади пиков (в наномолях) и ширину «окна» для идентификации пиков. Интеграторы могут обрабатывать базовую линию сложного вида и находить площади неразделенных пиков. Чтобы получить достоверные результаты при расчетах площадей пиков разной формы, для разных участков хроматограммы используются различные значения ширины пиков и уровня шумов. Эксплуатация хроматографов на пикомольном уровне часто соответствует пределу рабочих параметров, поэтому необходимо иметь прибор с большим запасом возможностей. В на% стоящее время существуют дешевые однокаиальпые интеграторы, записывающие результаты измерений на термочувствительную бумагу. Некоторые интеграторы можно соединять с компьютерами для хранения исходных или предварительно обработанных данных, поступающих с детектора непосредственно в компьютер. Можно использовать интерфейс на основе 12—16-разрядного аналого-цифрового преобразователя (АЦП) или применять стандартный интерфейс (например IEEE, RS232 или 16-разрядный интерфейс общего назначения). В этом случае нужна относительно низкая скорость записи хроматографиче-

13.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

409

ских данных (10—25 точек/с); необходимо приобрести или составить самостоятельно программу интегрирования для данного компьютера. После сбора данных компьютер может проводить сглаживание сигнала и вычитание базовой линии для улучшения соотношения сигнал/шум.

В исследованиях, результаты которых излагаются в данной главе, использовалась система фирмы Waters, состоящая из автоинжектора WISP (модель 710В), двух насосов (модель 6000), детектора (модель 440, длины волн 254 и 313 им), колонки с водяным термостатом. Для работы па шкале 0,002 и 0,001 ед. опт. плотн. применяют детектор фирмы Altex (модель 160) с автоматической установкой исходной базовой линии после проведения каждого анализа. Выход сигнала (шкала на 10 мВ) присоединен к системе обработки данных (модель 730 фирмы Waters). Насосы управляются с помощью программирующего устройства (модель 720 фирмы Waters). Для записи и обработки данных используется система, описанная выше. Для прямого сбора данных детектор соединен с АЦП, который через HPIB имеет выход на компьютер (модель 9845/204 фирмы Hewlett-Packard). В последнее время применяют также многоканальную систему фирмы Nelson Analytical в комбинации с компьютером фирмы Hewlett-Packard (модель 9816).

13.2.1.2. Хроматографические растворители. Наиболее важное значение имеет оптическая чистота воды, растворов солей и органических растворителей. Буферы должны быть стерильны и свободны от посторонних частиц. Дли очистки воды удобна патронная система фирмы Milliporc (разд. 8.3). Органические растворители приемлемого качества продают фирмы Rathburn Chemicals, BDH, Burdick and Jackson, Fisons and Merck. По мере увеличения чувствительности анализа все большее значение приобретают пики примесей и дрейф базовой линии. При необходимости воду, используемую для приготовления буферов, можно дополнительно очистить, пропустив ее через колонку с грубой фракцией С^-сорбента, например патроны Sep-Pak (фирма Waters). Органические растворители пропускают через слой активированного угля высшего качества, перегоняют на колонке Widmcr или на установке с вращающейся мешалкой. Однако в руках новичка эта методика может скорее загрязнить, чем очистить растворители и обычно не является рентабельной с точки зрения цены и эффективности очистки. Ацетонитрил фирмы Rathburn (марка S), используемый в нашей лаборатории без очистки при градиентном разделении, вызывает дрейф базовой линии, составляющий 0,005—0,001 ед. опт. плотн.

Наличие загрязнений в реагентах и растворителях, используемых в анализе последовательности, является отдельным фактором, влияющим на чувствительность анализа. При необходимости реагент можно очистить, как описано в работе [8].

Качество уксусной кислоты и ацетата натрия не представляет проблемы, если используются продажные реактивы высшей степени чистоты. Растворители деаэрируют пропусканием через них сильного потока гелия в течение 2—3 мин, через водный буфер гелий барботируют в течение всего времени работы насосов, подающих растворы на колонку. Другие методы деаэрирования в нашей лаборатории дают менее надежные результаты, хотя любые методы, рекомендованные фирмами — производителями обору-

410

13. АНАЛИЗ ФЕНИЛТИОГИДАНТОИОНОВ АМИНОКИСЛОТ

дования, при тщательном повседневном приготовлении буферов дают вое-произодимые результаты. Мы готовим исходный 1 М буфер, стерилизуем его фильтрованием. Буферы для хроматографического элюирования готовят каждые два дня разбавлением исходного буфера. Невозможно предотвратить случайное попадание и рост микроорганизмов в ацетатных буферах. Для предотвращения роста бактерий и грибов буфер А содержит неботь-шос количество ацетонитрила (см. разделение на С8-колонке в разд. 13.2.1.5).

13.2J.3. Хроматографические колонки. Возможности разделения на колонках продолжают улучшаться благодаря более строгому

страница 63
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
металлическая мебель от производителя
ремонт тормозов audi
рамка шторка с пультом ду
установка litened 90-50 к1в1 nd16-062758цена

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.02.2017)