химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

лужит вторая колонка прибора [52]). В общем случае конверсия проводится по методике, описанной в работе [4], с использованием 30%-ной водной ТФУ при 50 °С продолжается — 60 мин по программе, разработанной для микроанализа с ДАБИТЦ—ФИТЦ (рис. 12.6 и табл. 12.2).

12.5.7.4. Идентификация с использованием ВЭЖХ в режиме прямой стыковки секвенатора с хроматографом («оп line»). В идеале автоматический анализ аминокислотной последова-

12.6. ОБСУЖДЕНИЕ

399

тельности полипептидов требует и автоматического превращения АТЗ; это обстоятельство становится необходимым предварительным условием анализа исчезающе малых количеств пептидов. Разработки ближайшего времени будут включать в себя автоматическую регистрацию результатов определения путем идентификации отщепленных ФТГ-производных аминокислот в режиме непрерывной работы с секвенатором, например при помощи ВЭЖХ. Первый вариант такой непрерывной системы («оп Ппе») был предложен применительно к твердофазному секвенатору [38, 39J. Эта система была разработана для сек-венатора, в который отщепленные ФТГ-производные растворены в смеси органического растворителя, ТФУ, воды. Сначала удаляли кислоту, затем образец дозировали в колонку жидкостного хроматографа.

При использовании конверторов (например, конвертор Witt-mann-Liebold [75]), обеспечивающих удаление кислоты, монтаж системы автоматической идентификации методом ВЭЖХ прост: проба раствора, содержащего тиогидантоин, при помощи автоматического клапана дозируется на колонку ВЭЖХ [69]. Использовали изократическую хроматографию тиогидантоинов на колонке RP8 (диаметр зерна сорбента 3 мкм, размер колонки 4x250 мм) при 61 °С. Элюирование проводилось в системе: 19,5%-ный изопропанол+ 1 %-ный ТГФ+1,5% 10 мМ ацетата натрия (рН 5,3) в режиме рецикла. На колонку дозировалось 25—50% объема образца [70]. Остаток образца высушивался в коллекторе фракций и использовался для дополнительной идентификации в градиентной системе ВЭЖХ. Изократическое элюирование в системе «оп Нпе» проще, чем градиентное. Оно позволяет контролировать ход отщепления и состояние прибора. При этом достигается полное разделение всех производных аминокислот. Наш опыт показывает, что при автоматической идентификации в режиме «оп Нпе» хранение части полученных ФТГ-производных аминокислот необходимо как мера предосторожности на случай поломки хроматографа или для последующей идентификации модифицированных аминокислот.

12.6. Обсуждение

12.6.1. Твердофазный анализ небольших пептидов

Методы твердофазного анализа применимы почти ко всем типам пептидов. Они разработаны для пептидов, содержащих до 30 аминокислотных остатков, но могут быть использованы для анализа и более крупных пептидов и белков. Обязательные стадии включают: 1) присоединение пептидов через а- и е-ами-ногруппы к носителям на основе полистирола или стекла путем

400

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

активации л-фенилендиизотиоциапатом и 2) присоединение через С-концевую карбоксильную группу активацией водорастворимыми карбодиимидами. Наиболее полезными носителями оказались аминополистирол и 3-аминопропилстекло. При использовании носителей на основе стекол в продуктах отщепления присутствует меньше примесей, поэтому в последние годы они стали предпочтительными. Выход на стадии присоединения к носителям составляет 60—90% и зависит от метода конденсации, качества носителя и умения подобрать условия растворения образца для присоединения. Помимо конденсации при помощи двух указанных методов, можно с высоким выходом присоединять пептиды через лактон гомосерина к ТЭТА-поли-стиролу, 3-аминопропилстеклу и p-N-аминоэтил (3-аминопро-пил)стеклу. При работе с ТЭТА-полистиролом необходимы тщательное соблюдение условий синтеза самого ТЭТА-полимера, промывка носителя перед использованием и хранение его под азотом. Были предложены носители других типов, например полимеры на основе поли-М-алкилакриламида [2, 10] или макропористых производных полистирола [26]. Но до сих пор эти смолы не нашли широкого применения для изучения структуры полипептидов, высушенных из биологических источников. С новыми подходами в создании носителей можно ознакомиться в главе 16.

12.6.2. Твердофазный анализ крупных пептидов и белков

Для этой цели наиболее предпочтительны носители на основе стекла. Методика состоит в присоединении активированных ли-зилсодержащих пептидов, тогда как фрагменты, не содержащие такие группы или содержащие главным образом Arg, присоединяются труднее. Общий метод конденсации больших фрагментов, не содержащих Lys, состоит в присоединении по С-концевой аминокислоте при помощи карбодиимидов. Присоединение белков к аминополистиролу проходит с очень малым выходом, но при замене его на АПС или [}-АПС выходы увеличиваются до 20—60%. Следует контролировать не только степень присоединения, по и саму возможность анализа последовательности аминокислот, полученных пептидилполимеров. Опыт показывает, что, несмотря на отличный выход в конденсации белка с носителем, нерастворяющиеся «пришитые» белки могут давать плохие выходы N-концевых аминокислотных остатков. Опыт показывает, что твердофазный анализ последовательности белков на микроуровне лучше всего проводить после присоединения белка через е-ЫН2-группьь

12.6, ОБСУЖДЕНИЕ

401

12.6.3. Сравнение жидкофазного и твердофазного методов

При выборе методов установления аминокислотной последовательности полипептидов предпочтительность метода зависит от свойств пептида или белка (растворимость, аминокислотный состав, длина цепи). Выбор метода анализа обусловлен также доступностью изучаемого материала и чувствительностью определения отщепленных производных. Достоинства твердофазного метода

1) Относительно низкая стоимость секвенатора и простота обслуживания механической части прибора.

2) Дешевизна реагентов и растворителей.

3) Пептид, ковалептно связанный с носителем, не вымывается растворителем при промывках колонки.

4) Наличие ДСН не влияет на процесс присоединения белка к носителю [63].

Недостатки метода заключаются главным образом в неполном присоединении полипептида к носителю и иногда в частичном разрушении самого носителя, которое существенно увеличивается по мере проведения процесса определения. Более детальное сравнение методик автоматического анализа структуры можно найти в работах [67, 68].

12.6.4. Анализ структуры на микроуровне

С появлением ВЭЖХ и высокочувствительных проточных детекторов стал возможным анализ на микроуровне с идентификацией пикомольных количеств вещества. Чувствительность микроанализа ограничивается чистотой производных, их стабильностью в ходе и после отщепления, наличием примесей. Обязательное условие — высокая чистота растворителей; для устранения возможности загрязнения секвенатор, во-первых, должен иметь минимальные «мертвые» объемы и некорроди-рующие клапаны и соединения, во-вторых, необходимо постоянно поддерживать на высоком уровне технические параметры прибора. Лимитирующими факторами в жидкофазпедм анализе является качество полибреиа, в твердофазном — качество носителей. Дополнительно осложняет анализ существенное различие выходов отдельных производных. Некоторые тиогидантоины отщепляются с высокими выходами и устойчивы, другие присутствуют в малых количествах, так как они либо плохо отщепляются, либо разрушаются после отщепления; в любом случае их трудно обнаружить на фоне побочных продуктов. Следует тщательно контролировать техническое состояние прибора для того, чтобы быть уверенным в результатах тех анализов, где

26—703

402

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

-существует риск подавления полезных сигналов шумами, хотя бы и сведенными к минимуму. Работоспособность самого прибора можно проверить проведением холостого опыта (без пептида или белка). Фракции, полученные с каждого цикла опытов, следует проверять на наличие загрязнений, используя для анализа большие аликвоты фракции. Для построения градуировоч-ного графика прибора выполняют контрольные анализы на стандартных образцах пептидов или белков. Следует отметить, что методы выделения, используемые для очистки пептидов и белков, сильно влияют на растворимость объектов, т. е. они имеют большое значение при оценке самой возможности анализа их структуры методом Эдмана. Следы солей буферов (например, ацетат аммония) или аминов снижают эффективность отщепления ФТГ-производных аминокислот и вызывают частичное блокирование N-концевых аминокислот пептидов. Это обстоятельство оказывается решающим при анализе очень малых количеств пептидов; для предотвращения необратимого блокирования N-концевых аминокислот выделение пептидов (белков) следует проводить в восстанавливающих условиях.

12.6.4.1. Отщепление по Эдману с применением меченого реагента. В литературе описано несколько методик, использование которых может существенно снизить расход образца. В одной из таких методик применяется радиоактивно меченный ФИТЦ [6, 8, 9, 27]. Следует работать только с чистым реагентом, так как примеси, присутствующие в исходном ФИТЦ, а также образующиеся в ходе отщепления, делают идентификацию ФТГ-производных аминокислот ненадежной. Уровень радиоактивного фона зависит также от того, насколько плотно подтянуты уплотнения клапанов и резьбовые соединения. Гораздо чище проходит анализ структуры пептидов и белков, меченных in vivo. Трудности, связанные с использованием метки в белках или реагентах, обсуждаются в работе [44].

12.6.4.2. Анализ с использованием ДАБИТЦ. Описан эффективный подход к ручному определению последовательности на микроуровне, при котором ФИТЦ заменен его аналогом 4-\\Кт-диметиламиноазобензолизотиоцианатом (ДАБИТЦ) [12]. Метод очень чувствителен — производные аминокислот можно легко идентифицировать на пикомольном уровне при помощи ТСХ и анализировать количественно методом ВЭЖХ [13, 37]. Подробно методики изложены в гл. 14. Для твердофазного анализа на микроуровне разработан метод совместного использования ФИТЦ и ДАБИТЦ [25]. Недавно предложен улучшенный вариант этого метода, дающий однозначные результаты при работе с очень малыми количествами образца [52].

ЛИТЕРАТУРА

403

Благодарности. Я благодарю А. Лехмана за содействие в подготовке этой главы, а также К. Ашман и П. Ролинга за пред-варительное ознакомление с материалом после перевода его на английский язык.

Литература

1. Apelta Е„ Inman F A., Dubois G. С, See [47], pp. 121—133.

2. Atherton Clive D. L. J., Sheppard R. C, J. Am. Chem. Soc., 97, 6584— 6585 (1975).

3. Beyreuther A., See [471, pp. 107—114.

4. Birr C, See [29], pp. 115—129 (1975).

5. Birr C. (Ed.), Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis, Proc. Third Internat. Conf., Elsevier/North Holland, Heidelberg, Amsterdam, New-York, Oxford (1980).

6. Bridget! A, FEBS Lett., 50, 159—162 (1975).

7. Bridgen A, Methods Enzymol., 47, pp. 385—391 (1977)

8. Bridgen J., Methods Enzymol., 47, pp. 321—335 (1977).

9. Bridgen Waxdal M. A, See [47], pp. 153—162.

10. Cavadore J. C.f Derancourt Ft Previero A., FEBS Lett,, 66, 155—157 (1976).

11. Chang J. У., Biochem. Biophys. Acta, 578, 188—195 (1979).

12. Chang F Y., Brauer D., Wittiminn-Heboid В., FEBS Lett., 93, 205—214 (1978).

13. Chang /. V., Lehmann A., Wittmann-Liebold В., Anal. Biochem., 102, 380— 383 (1980).

14. Edman P., Acta Chem. Scand., 4, 238—293 (1950).

15. Edman P., Begg G., Eur. J. Biochem., 1, 80—91 (1967).

16. Elzinga Al. (Ed.), Methods in Protein Sequence Analysis Proc, Fourth Internat Conf., Humana Press. Clifton N. J. (1982).

\i. Frank R., Doctoral Thesis, Ruprecht-Karl-Universitat, Heidelberg, (1979).

18. Gisin B. F., Analyt. Chim. Acta. 58, 248—249 (1972).

19. Gray \Y. R.t Hartley B. S., Biochem. J., 89, 379—380 (1963).

20. Guile В., Merrijield R. В., J. Biol. Chem., 246, 1922—1941 (1971).

21 Herbrink P.f Tesser G. F. Lamberts /. J. AT, FEBS Lett., 60, 313—316 (1975).

22. Hewick II M, Ilunkapiller AL U"., Hood L. E., Dreyer W. /., J. Biol. Chem. 15, 7990—8005 (1981).

23. Horn M. F, Bonner A. G., See [471, PP- 163—176.

24. Horn Af. Laursen R. A., FEBS Lett., 36, 285—288 (1973).

25. Hughes G. /., Winterhalter IF, Lutz H., Wilson A. FEBS Lett., 108, 92— 97 (1979).

26. Inman F K.t Dubois G. C, Apelta E., See [47], pp. 81—94.

27. Laursen R. A., Eur. J. Biochem., 20, 89—102 (1971).

28 Laursen R. A., Methods Enzymol, 25, 344—359 (1972).

29. Laursen R. A. (Ed.), Solid Phase Methods i-n Protein Sequence Analysis, Proc. First Internat. Conf., Peirce, Rockford, Illinois (1975). .

30. Laursen R. A., In Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies Peptides, Wectall H. H. (Ed.), Marcel Dekker, New York, pp. 567—634 (1975).

31. Laursen R. A., See [291, PP- 3—9.

32. Laursen R. A., See [47], pp. 95—106.

33. Laursen R. A., Methods Enzymol., 47, pp. 277—288 (1977).

34. Laursen R. A., Horn M. Ft Bonner A. G., FEBS Lett., 21, 67—70 (1972).

35. Laursen R. A., Bonner A. G., Horn Af. A, See [46], pp. 173—110.

36. Laursen R. A., Obar R.t Chin F., Whitrock A., See [5], pp. 9—20.

37. Lehmann A., Wittmann-Liebold В., FEBS Lett., 176, 360—364 (1984)

38. Machletdt W., Hofner See [51, pp. 35—47.

26*

404

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

39. Machleidt W., Hofner Я., In: High Performance Liquid Chromatography in

Protein and Peptide Chemistry, Lottspeich F., Henschen A., Hupe K. P. (Eds.), Walter de Gruyter Verlag, Berlin, pp. 245—258 (1981).

40. Machleidt W., Machleid /., See [47], pp. 233—246.

41. Machleidt W., Wachter Methods Enzymol., 47, 263—277 (1977).

42. Machleidt W., Wachter E.t Scheulen Al., Otto /., FEBS Lett., 37, 217 (1973).

43. Machleidt W.t Hofner H., Wachter ?., See [29], pp. 17—30.

44. McKean D. See [51, pp. 143—152.

45. Morris H. R., Dickinson R. J., Williams D, IF, Biochem. Biophys. Res, Commun., 51, 247—255 (1973).

46. Perham R. N. (Ed.), Instrumentation in Amino Acid Sequence Analysis, Academic Press, London, New York, San Francisco (1975).

47. Previero A., Coletti-Previero M.-A. (Eds.), Solid Phase Methods in Protein Sequence Analysis, Proc. Second Internat. Conf., North-Holland, Amsterdam, New York, Oxford, 1977.

48. Previero A., Derancourt F, Coletti-Previero M.-A.t Laursen R. Л., FEBS Lett., 33, 135—138 (1973).

49. Reinbolt J., Tritsch D.t Wittmann-Liebold b.t See [47], pp. 209—218.

50. Reinbolt J., Tritsch D., Wittmann-Liebold В., Biochimie, 61, 501—502 (1979).

51. Robinson P. J., Dunnill P., Lilly M. D., Biochem. Biophys. Acta, 242, 659— 661 (1971).

52 Sulnikow F, Lehmann A., Wittmann-Liebold B.y Anal. Biochem., 117, 433— 442 (1981).

53 Sulnikow J., Lehmann A., Wittmann-Liebold В., See [161, PP- 181 — 188.

54. Schiltz See [471, PP- 247—256.

55. Schiltz E.t Reinbolt J., Eur. J. Biochem., 56, 467—481 (1975).

56. Schmitt H. W.t Walker J. FEBS Lett., 81, 403—405 (1977).

57. Scotchler J., Lozier R.f Robinson A. J. Org. Chem., 35, 3151 (1970).

58. Tarr G. Anal. Biochem., 63, 361—370 (1975).

59. Terhorst C, Mailer IV'., Laursen R. A., Wittmann-Liebold B.t Eur. J. Biochem., 34 [3g_j52 (1973)

60. Wachter E., Werhahn Д., Anal. Bioche

страница 62
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
salice paolo ручки купить
плазма в аренду
справка для прав ээг обязательно
строим домашний кинозал

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.08.2017)