химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

трифугируют, сушат в вакууме.

12.4.5. Контроль степени присоединения

12,4.5.1. Проба на растворимость. Пептиды обычно проверяют на растворимость в буфере, используемом для присоединения. Пептид растворяют в буфере, отбирают аликвоту, содержащую 2 нмоль образца, высушивают

12.5. ОТЩЕПЛЕНИЕ НА ТВЕРДОФАЗНОМ СЕКВЕНАТОРЕ

393

пробу в вакууме или сразу же наносят на пластинку ТСХ (целлюлоза Cell 300, фирма Macherey and Nagel). Хроматографируют в системе: пиридин — бутанол — уксусная кислота —вода (10:15:3:12, по объему). Опрыскивают пластинку раствором нингидрина в ацетоне (3 г на 100 мл). Должно проявиться только одно пятно с интенсивностью окрашивания, соответствующей 2 нмоль пептида. Если объем пробы превышает 2,5 мкл, то следует удалить соли лиофилизацией. При анализе структуры на микроуровне для экономии материала такой тест следует проводить более чувствительными методами, например методами ВЭЖХ или аминокислотного анализа.

12.4.5,2. Контроль степени присоединения. По окончании реакции конденсации жидкость над осадком проверяют на содержание остаточного (пеири-соединенного) пептида. Отобранную пробу подвергают гидролизу и проводят аминокислотный анализ. При наличии пептида в растворе присоединение повторяют при других условиях. Если располагают достаточным количеством образца, то после обессоливапия образец вновь используют в реакции конденсации.

Определение выхода в реакции присоединения. Порцию пептидилсмолы или стекла (10 мг) промывают ТФУ (2 раза по 0,5 мл) для удаления нековалентио связанного пептида, сушат в вакууме. Смолу смешивают с 250 мкл раствора состава: 12 М соляная кислота—проиноновая кислота (1 : 1), помещают в ампулы, вакуумируют и выдерживают в течение 24— 48 ч при 110 °С [57] или 2 ч при 130 °С (в ампулах под азотом) [65]. Затем частицы смолы отделяют фильтрованием, отбрасывают, раствор упаривают, сухой остаток растворяют в нитратном буфере для аминокислотного анализа (рН 2,2). Проводят аминокислотный анализ и рассчитывают выход аминокислот. Гидролиз пептидилполимера можно проводить и в смеси 12 М соляная кислота — уксусная кислота — фенол (2:1:1) под вакуумом в течение 24 ч при 110°С [20].

Пробные анализы на секвенаторе. Рабочий режим прибора и чистоту используемых реактивов и растворителей можно проверить, используя в качестве стандартных образцов брадикинин или В-цель инсулина (в конденсацию вводят 10—100 нмоль образца) [78].

12»5. Отщепление на твердофазном секвенаторе

Конструкция прибора описана ранее [27—29, 35].

12,5.1. Колонка

Оба конца тонкой стеклянной трубки (длина 230 мм, внутренний диаметр 2,5 мм) полируют до получения ровной поверхности торца. Материалом соединений служит тефлон и кель 'F [27]. Колонку помещают д обогреваемый алюминиевый блок, термостатированный при 45 °С.

12.5.1.1. Микроколонка. Для анализа пептидов в количестве <20 нмоль используются колонки уменьшенного размера (например, 15X2 мм), заполненные шариками пептидилстекла, смешанными со стеклом-наполнителем. Известна конструкция колонки, сделанной из тефлоновой трубки (рис. 12.4), внутренний объем которой соответствует количеству используемого пептидилстекла. Под нижний суженный конец трубки помещен пористый тефло-повый фильтр (размер пор 2 мкм), лежащий в адапторе, закрывающем конец колонки. А1ертвый объем вверху колонки уменьшен введением короткого отрезка узкой тефлоновой трубки. Колонка в сборке помещена в стеклянный термостат (рис. 12.6).

394

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

РИС. 12.4. Колонка для анализа пептидов на микроуровне. Материал колонки — тефлоновая трубка, внутренний объем которой зависит от количества используемого носителя. В верхнюю часть колонки введена узкая тефлоновая трубка, нижний конец колонки закрыт пористым тефлоновым фильтром с диаметром пор 2 мкм (фирма Zitex, Chemplast Inc.). Колонка помещена в термостатированную стеклянную трубку (см. рис. 12.1) Г52, 69].

12.5.2. Упаковка колонки

В зависимости от размера колонки и количества пеп-тидилполимера, последний смешивают с разными количествами стеклянных шариков (до 900 мг; разд. 12.2.3) и упаковывают колонку сухим способом [29]. Микроколонку заполняют пептидилполимером без разбавления стеклом, или же смолу помещают между двумя слоями инертных стеклянных шариков.

12.5.3. Программа работы секвенатора

Программы анализа различаются в зависимости от прибора, растворителей, и буферов, используемых на стадии присоединения ФИТЦ. Перед работой заполненную реакционную колонку и трубки подачи реагентов промывают всеми используемыми растворителями (например, метанолом и 1,2-дихлороэтаном). В двухколоночном варианте секвенатора анализ на первой колонке начинается с промывки ее метанолом, после чего проводится реакция конденсации (подачи буфера и раствора ФИТЦ). В это же время вторая колонка промывается 1,2-дихлороэтаном, затем следует промывка ТФУ. При необходимости вторую колонку можно использовать в качестве лвтоматического конвертора. Тназолинон, поступивший на вторую колонку после первого цикла, превращают в ФТГ, проводя одновременно стадию карбамоилирования второго цикла на первой колонке (см. ниже). Программа микроанализа приведена на рис. 12.5, а ее вариант применительно к сек-венатору фирмы LKB описан в табл. 12.2.

12.5.4. Реакция карбамоилирования

На этой стадии чаще всего используется буфер № 1 [27]. Недавно предложен безводный буфер на основе ДМФА (содержащий 2,5% триэтиламина или N-метилморфолина) [43, 60]. В анализе с использованием ДАБИТЦ — ФИТЦ хорошие результаты дает использование буфера № 3 (рис. 12.5). Безводные или содержащие ДМФА буферы * предпочтительнее предлагавшихся ранее водных (поскольку безводная среда создает гидрофобное окружение пептида, присоединенного к полимеру). Эти буферы применимы как для полимерных, так и для стеклянных носителей.

Используется 5%-ный раствор ФИТЦ в ацетонитриле; для работы одновременно с ДАБИТЦ и ФИТЦ оба реагента растворяют в ДМФА (рис. 12.5), так как ДАБИТЦ меньше гидролизуется в этом растворителе.

12.5. ОТЩЕПЛЕНИЕ НА ТВЕРДОФАЗНОМ СЕКВЕНАТОРЕ

395

Время, О Ю 20 30 if) цп ап 7П Ск0Р0СТЬ

мин 1 • 1 ' ¦ л° 6Р 7Р потока,

ивПн м в _ мл/мин

а ¦ ¦ ШШ ШШ Ш 1 о

Буфер in щ/т III мш штш

ДАБИТЦ Mill Mill ФИТЦ ш ТФУ

Сбор фракций а т

Азот ¦ J III

0,15 0,0 7 S 0,15 0,15

Коллектор фракций

РИС. 12.5. Усовершенствованная программа для твердофазного анализа на микроуровне с использованием ДАБИТЦ —ФИТЦ. Обозначения: МеОН — метанол, содержащий 0,2% пропиламина; буфер — буфер № 3 для реакции кар-бамоилирования; ДАБИТЦ — 0,5%-ный раствор ДАБИТЦ в ДМФА; ФИТЦ — 5%-ный раствор ФИТЦ в ДМФА; ТФУ — безводная ТФУ [52].

12.5.5. Растворители

Для промывки колонки после взаимодействия с ФИТЦ обычно используют метанол и 1,2-дихлороэтан, который можно заменить бензолом. В одной из недавно предложенных программ для анализа на микроуровне используется только метанол [52]. Более высокие выходы получены в случае 0,2%-ного> пропиламина в метаноле. При этом буфер добавляется порциями, между-которыми колонка продувается азотом (рис. 12.5).

12.5.6. Отщепление анилинотиазолинона

В твердофазном методе для циклизации применяется ТФУ. Важное значение имеет время реакции отцепления, количество добавляемой кислоты: короткое время отщепления приводит к неполной циклизации, длительное — вызывает неспецифическое расщепление пептидных связей и рост загрязнения отщепленных тиазолипонов. Рекомендуется проводить циклизацию в течение 8 мин при 45 °С. Оптимальное время добавления кислоты можно, определить, используя брадикинин, имеющий остатки пролина в положениях 2, 3 и 7. Время реакции считается достаточным, если в четвертом цикле отщепления содержится не более 10% остаточного пролина. Кроме того, выход третьего остатка пролина (седьмая N-концевая аминокислота) не должен резко упасть по сравнению с содержанием предыдущих остатков пролина. Отщепление при помощи ТФУ становится более эффективным, если перед добавлением кислоты колонку продуть азотом [43].

12.5.7. Перегруппировка анилинотиазолинона в ФТГ

12.5.7Л. Условия проведения процесса. Отщепленные анилинотиазолиноньи (АТЗ) превращают в ФТГ аминокислот в водных растворах кислот илш в безводном растворе хлороводорода. Используют следующие среды и условия превращения:

1) 1 М соляная кислота, 10—15 мин, 80 °С [14];

2) 20%-ная ТФУ, 10 мин, 80 °С [27];

3) 20%-ная ТФУ, 20—30 мин, 55°С [72];

4) 30—40%-ная ТФУ, 45—65 мин, 49—50°С [52];

3%

12, МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

Таблица 12.2, Модификация секвенатора (модель 4020, фирма LKB) для работы по методике ДАБИТЦ — ФИТЦ

Твердофазный стандартный секвенатор (модель 4020) модифицирован для работы на микроуровне [52]. Программа работы прибора показана на рис. 12.5. Модификация включала следующие изменения конструкции прибора:

1) введена линия продувки азотом (см. рис. 12.6) для высушивания колонки прибора на стадиях карбамоилирования, отщепления, промывки растворителями;

2) стандартная колонка фирмы LKB заменена тефлоновой микроколонкой (см. рис. 12.4), погруженной в стеклянный термостат, прогретый до .50 °С;

3) колонка № 2 используется в качестве конвертора (30%-ная ТФУ, ¦65 мин, 50 °С; превращение в автоматическом режиме). Вместо стандартной лсолонки применяется тефлоновая спираль (1,5X400 мм), в которую с колонки № 1 поступает раствор тиазолинона в ТФУ. Одновременно в ту же линию подается вода, смешивающаяся с раствором тиазолинона [4];

4) все соединительные линии уменьшены в диаметре и укорочены по мере возможности.

5) 1 М хлороводород в метаноле (полученный добавлением 1—2 М хлороацетила к метанолу при охлаждении на льду), 5—10 мин при 55°С [23, 58].

6) 2,4 М метиламин в изопропаноле (или газообразный метиламин) предложены для превращения в метиламиды фенилтиокарбамоиламинокислоты [1].

Оптимальные условия количественного превращения тиазо-линонов отдельных аминокислот в ФТГ сильно отличаются друг от друга. Gly и Lys превращаются с наименьшими скоростями, тогда как Ser и Thr не только быстро переходят в ФТГ этих же аминокислот, но и претерпевают частичную деструкцию. Поэтому в общем случае методика реакции превращения АТЗ в ФТГ должна компромиссно учитывать эти крайние условия с присущими им недостатками. При анализе дорогостоящих пептидов желательна специальная обработка отщепленных производных в каждом цикле. Превращение в соляной кислоте предпочтительнее обработки ТФУ в случае Ser и Thr. При работе с ФТГ-производными Gin и Asn лучше использовать водную ТФУ, так как в этом случае возможно быстрое упаривание разбавленного раствора после завершения реакции, что уменьшает до минимума дезамидирования ФТГ этих аминокислот. В то же время применение разбавленной соляной кислоты ведет к почти полному дезамидированию Gin и Asn, что не позволяет надежно определять присутствие амидов.

Проведение реакции в безводном хлороводороде имеет некоторые преимущества перед водными средами (более мягкие условия, большая летучесть реагента). Недостаток методики связан с тем, что могут этерифицироваться боковые цепи Asp и Glu. При неполной этерификации после проведения конверсии

12.5. ОТЩЕПЛЕНИЕ НА ТВЕРДОФАЗНОМ СЕКВЕНАТОРЕ

397

в реакционной среде присутствуют два вида производных (ФТГ-Asp и ФТГ-СНзО-Asp). Аналогичная картина наблюдается в случае ФТГ-производного Glu. Полнота протекания реакции зависит от устойчивости раствора хлороводорода в метаноле, которая низка при высоких температурах; поэтому всегда следует использовать свежеприготовленные растворы.

12.5.7.2. Ручная конверсия. В твердофазных секвенаторах отщепленные тиазолиноны аминокислот элюируются в пробирки коллектора фракций в растворе, содержащем 1,5 мл ТФУ и 3 мл метанола. При ручном превращении АТЗ хранят в этой смеси в течение ночи при комнатной температуре. Однако АТЗ чувствительны к кислороду, поэтому происходит частичное разрушение производных некоторых аминокислот (например, Ser, Thr, Arg, His). Кроме того, если после обработки ТФУ колонка промывается метанолом, то Asp и Glu частично превращаются в соответствующие метиловые эфиры. Для предотвращения этого рекомендуется после проведения реакции колонку промывать сначала 1,2-дихлороэтаном или ДМФА. Для увеличения выхода ФТГ-производных Ser и Thr раствор АТЗ разбавляют водой, как указано ниже.

Перед началом анализа в каждую пробирку коллектора фракций наливают 3—7 мл воды, на следующий день содержимое пробирок упаривают на роторном испарителе или на вакуумном концентраторе и проводят конверсию.

Методика превращения. В потоке азота добавляют 0,3 мл 20%-ной водной ТФУ, выдерживают 30 мин при 55 °С. Упаривают раствор в вакууме. Для удаления летучих побочных продуктов остаток выдерживают в вакууме (масляный насос, до 5 ч). Растворяют содержимое пробирки в метаноле и идентифицируют ФТГ-производные аминокислоты методами ГЖХ, ТСХ, ВЭЖХ. Для упрощения методики предложено использовать обогреваемый эксикатор как для упаривания растворителей, так и для проведения конверсии.

12.5.7.3. Автоматическая конверсия. Описаны устройства, позволяющие проводить в атмосфере азота быстрое превращение АТЗ неустойчивых аминокислот в их относительно устойчивые ФТГ-производные. При этом налицо следующие преимущества: меньшая степень разрушения ФТГ, т. е. незначительное содержание побочных продуктов, меньшее (в зависимости от использованной среды) деамидирование Asn и Gin, повышение выходов ФТГ-Ser и ФТГ-Thr, сокращение времени процесса. Первый конвертор был выполнен в виде термостатированного при 55 °С стеклянного сосуда (колбы) с двойными стенками; кислый раствор упаривался в токе азота [66, 75]. Описан конвертор в виде реактора с рубашкой [7]. В другом устройстве используется реакционная спираль, через которую проходит поток раствора

398

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

кран продувки азотом

клапан ТФУ

4

I-«- N

7ч1

2

СЛИВ

ТФУ

„аналитическая колонка

клапаны коллектора

- спиральный реактор

. коллектор фракции

-перисталь-

тический насос

РИС. 12.6. Схема модифицированного секвенатора для твердофазного анализа фирмы LKB (модель 4020), имеющего продувку колонки азотом и автоматический конвертор [52].

с секвенатора; в поток добавляется необходимое количество воды; конверсия проводится при 80 °С [4]. В этом случае образующиеся ФТГ-производные аминокислот хранят в кислом растворе. Коммерчески доступен автоматический конвертор, схожий с конвертором-колбой (Sequemat Р-6 Auto Convertor; подробное описание см, в работе [23]). Этот конвертор можно присоединить и к жидкофазному, и к твердофазному секвена-тору, причем сообщалось, что при его использовании количественно образуются метиловые эфиры Asp и Glu кислот, отсутствуют свободные кислоты, не наблюдается деамидирования Asn и Gin. Однако при использовании обычного коммерческого конвертора в указанных условиях превращения образуется пеедииственное производное и затруднен количественный анализ. Недавно стал доступен недорогой и несложный вариант модификации секвенатора фирмы LKB (в качестве конвертора с

страница 61
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
холодильник aeg ремонт
ремонт и то чиллеров
матрас 60/180
бактерицидный фильтр для вентиляции

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.08.2017)