химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

огруппами к смолам на основе полистирола или к аминопропильным стеклам (АПС или р-АПС) при помощи ДИТЦ (рис. 12.3). Разновидностью «ДИТЦ-метода» является использование бифункционального реагента — лактона N- (я-изотиоцианатобензоил) -DL-гомосерин т для присоединения лизилсодержащих пептидов к носителям па основе стекла, содержащим аминогруппы. Сообщается о высоких выходах присоединения [21].

12ЛАЛ. Методики присоединения.

Преимущества, Выходы в реакциях присоединения обычно очень высокие (80—90%). При сравнении различных полисти-рольпых носителей в реакции Эдмана пептидиламииополистирол дает наименьший выход побочных продуктов. Ранее для присоединения небольших пептидов (содержащих 25—30 аминокислот) наилучшим носителем считался аминополистирол, тогда как более длинные пептиды и белки связывали преимущественно со стеклами (аминопропилстекло или [5-аминопропилстекло). В настоящее время разработаны методы присоединения пептидов меньшего размера к стеклянным носителям (разд. 12.4.2— 12.4.4).

Ограничения.

1. Условия присоединения могут вызвать снижение растворимости некоторых пептидов, ведущее к низким выходам присоединения. Для предотвращения потерь следует проводить контрольные испытания во время и после завершения процесса присоединения (разд. 12.4.5). Некоторые из пептидов, не-

О NH2

NН2-CH-C-N-(gHA])Hg) • (Lys^-COOH I н Ri

Смола

NH

I

NH

NH, NH2 NH

I

NH

^H_C-NH-<5)-gb© - (LyJ)-COOH

О

Отщепление по Эдману

^-Конверсия

РТН-А2;-А3;

N Н 2-<5зИЭ~© *" "СООН

РИС. 12.3. Присоединение пептидов к носителям, содержащим аминогруппы; активация а- и 8-аминогрупп

пептидов я-фенилендиизотиоцианатом.

3.8

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

растворимые в буфере для присоединения (его состав приведен ниже), можно растворить добавлением пиридина или ДМФА. Если это не помогает, то растворимость образца можно повысить изменением рН буфера (от 7,5 до 10). Иногда пептиды становятся растворимыми после предварительной обработки ТФУ и высушивания. Проблему растворимости помогает решить проведение конденсации в безводных условиях (ДМФА — триэтиламин) [60]. Лизилсодержащие пептиды можно также присоединять к аминополистиролу конденсацией с карбодимидом (КДИ) при РН 3^5 (разд. 12.4.4).

2. N-копцевые аминокислоты и остатки лизина после отщепления от пептидной цепи остаются ковалептио связанными с носителями, поэтому их нельзя идентифицировать. Однако в случае неполного присоединения N-копцевых аминокислот к смоле (стеклу) среди продуктов отщепления обнаруживают в небольших количествах ФТГ-производные N-концевых аминокислот. Обычно после пришивки пептида к носителю для блокировании оставшихся свободных аминогрупп смолы (стекла) используют метилизотиоциапат (МИТЦ). В этом случае образуется метил-тиогидантоин (МТГ) первой аминокислоты [28]. Мы заменили МИТЦ на ФИТЦ, поэтому N-концевая аминокислота можег быть определена в виде обычного ФТГ-производиого. При анализе на микроуровне такая обработка не влияет на выходы отщепления при условии, что использовался перегнанный ФИТЦ.

3, ДИТЦ-метод неприменим в случае пептидов, имеющих С-концевой Arg, поэтому остаток Arg гидразинолизом превращают в Огп [28, 45]. Однако при гидразиполизе часто наблюдается расщепление пептидных связей внутри молекулы, например по остаткам Asn, что усложняет интерпретацию результатов отщепления аминокислот. Поэтому ДИТЦ-метод не рекомендуется использовать для пептидов, содержащих С-концевоп Arg.

Методика присоединения. Конденсацию с аминополистиролом или со стекли иным и носителями, содержащими аминогруппы, проводят при рН 9,5 по методике, описанной в работах [28, 59], или по модифицированной методике [30, 55, 61].

Емкость носителей: 1—3 нм пептида/мг полимера или 1 нм/мг стекла.

10—100 нмоль обессоленного пептида переносят в стеклянную пробирку (размер 5х 130 мм) и высушивают в вакууме (масляный насос), предпочтительно в концентраторе (фирма Savant) или в эксикаторе; пептид можно также лиофилизовать. Растворяют пептид под азотом в 50 мкл буфера для присоединения (разд. 12.2.5). Проверяют рН (>9,0) и растворимость пептида. Отбирают аликвоту (2—5 мкл) для контроля методом ТСХ (разд. 12.4.5,1). Добавляют 1,0 "мг ДИТЦ (5 мкм) в 100 мкл ДМФА, перемешивают под азотом 30 мин при 50 °С. В пожелтевшем растворе не должно быть осадка.

30—50 мг аминополистирола (или 100 мг аминопропилстекла) промывают ДМФА, оставляют набухать в 200 мкл ДМФА в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем носитель двумя порциями добавляют к пептиду, предварительно активированному ДИТЦ. Перемешивают смесь под

12.4. МЕТОДЫ ПРИСОЕДИНЕНИЯ

389

азотом 60 мин при комнатной температуре. Для удаления избытка аминогруппы носителя добавляют 100 мкл раствора ФИТЦ и 100 мкл буфера (разд. 12.2.6), перемешивают под азотом 60 мин при 30 °С, центрифугируют. Жидкость над осадком проверяют на содержание исходного пептида (разд. 12.4,5.2). Промывают носитель метанолом (3 раза по 8 мл), центрифугируют, сушат в вакууме. При использовании аминополистирола последний смешивают с 900 мг стеклянных шариков (разд. 12.2.3); такой смешанный носитель упаковывают в колонку.

12.4.2. ДИТЦ-метод с использованием изотиоцианатного стекла

12А.2./. Преимущества, ограничения и методика присоединения Преимущества.

1. Присоединение белков и пептидов к носителям на основе стекла характеризуется более высоким выходом, чем при использовании смол на основе полистирола.

2. Легче представляется обычная проблема растворимости пептида в буфере для конденсации. При плохом растворении пептида в обычном буфере перед добавлением носителя можно попробовать добавить пиридин и (или) ДМФА. При конденсации ДИТЦ-активированного пептида с носителем, содержащем аминогруппы, реагент имеет разную склонность к выпадению в осадок в виде производного мочевины в зависимости от содержания воды, необходимой для растворения пептида.

3. Метод является быстрым в исполнении.

Ограничения. Метод применим только к пептидам, имеющим остатки лизина или аминоэтилцистеина. Пептиды, имеющие эти аминокислоты внутри цепи, можно анализировать только до указанных остатков, являющихся точками присоединения. Метод нельзя рекомендовать для аргинилсодержащих пептидов.

Методика присоединения [40, 41, 42, 62, 72]. Соотношение пептид: носитель 1 нмоль на мг стекла. Растворяют под азотом 10—200 нмоль пептида или белка в 30—100 мкл буфера № 1, Проверяют рН, растворимость (разд. 12.4.5). Добавляют 10—100 мг ДИТЦ — АПС (в сухом виде) и перемешивают под азотом 60 мин при 30 °С. Добавляют 50—100 мкл этано-ламина и перемешивают в тех же условиях. Интенсивно промывают реакционную массу ДМФА, метанолом и эфиром (каждым - растворителем 2 раза по 2 мл). Жидкость над осадком контролируют на содержание пептида; носитель сушат в вакууме.

Модифицированная методика. Если пептид нерастворим в буфере на основе N-метилморфолина, то конденсацию можно проводить в одной из следующих систем: 50%-ный водный пиридин; ДМФА, внесенный после добавления триэтиламина (буфер № 3) или N-метилморфолина; бикарбонат натрия (рН 9,0; буфер № 4) с добавлением (при необходимости) 1% ДСН. Найдено, что при конденсации В-цепи инсулина в буфере N-метилморфо-лин — ТФУ, рН 9,0 выход составляет 45—50%, а в натрийбикарбонатном буфере (рН 9,0)—66—70% [П].

390

)2. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

12.4.3. Присоединение по лактону гомосерина

Для этой конденсации используют ТЭТА-полистирол [24, 33 j, а также стекла (АПС или р-АПС).

12.4.3.1. Преимущества, ограничения и методика присоединения. Преимущества.

1. Для пептидов, содержащих гомосерин, выходы конденсации составляют 80—90%.

2. Можно определить полную последовательность таких пептидов, включая С-концевой остаток.

3. Кроме отщепленных аминокислот в растворе содержится мало других примесей при условии, что носитель хранили в ампулах под азотом при —20°С и тщательно промывали непосредственно перед использованием.

4. Этим методом в продуктах бромоцианового гидролиза можно отделить пептиды, содержащие гомосерин, от С-концево-го пептида, в котором отсутствует гомосерин.

Ограничения.

1. ТЭТА-полистирол довольно неустойчив; его нельзя хранить долго.

2. Следует тщательно промывать ТЭТА-полистирол перед использованием.

3. При работе с лизилсодержащими пептидами этот носитель менее эффективен, чем аминополистирол и аминопропилстекло, поскольку наблюдается увеличение фона примесей. Сообщалось, что обработка пептидил полимер а N-ацетил имидазолом сразу же после конденсации пептида с полимером уменьшает число ложных нингидринположительных пятен при идентификации ФТГ-аминокислот.

Методика присоединения. Емкость носителя 1 нмоль/мг смолы. 50 мг ТЭТА-смолы или 100 мг 3-аминопропилстекла промывают (ДМФА, 4 раза по 2 мл); в случае ТЭТА-смолы дополнительно промывают триэтиламином (2 раза по 3 мл). В заключение промывают метанолом (2 раза по 2 мл) п ДМФА (2 раза по 1 мл).

Лцктонизация пептида. Пептид сушат в вакууме над пентоксидом фосфора. Добавляют перегнанную безводную ТФУ (50—100 мкл на 5—20 нмоль пептида; 0,5 мл — на 50—200 нмоль) и оставляют на 1 ч при комнатной температуре под азотом. Продукт сушат на роторном испарителе или з концентраторе (Speed Vac Concentrator, фирма Savant), затем в вакууме над едким кали. Повторяют обработку ТФУ в течение 15 мин.

Присоединение. Лактон пептида растворяют в смеси 175 мкл ДМФА + + 25 мкл триэтиламина; если пептид не растворяется, добавляют триэтиламин до концентрации 20%. Контролируют растворимость, отбирая пробы по 2—5 мкл. Добавляют под азотом раствор пептида к предварительно отмытой ТЕТА-смоле (или к 20 мг аминопропилстекла). Пробирку, содержащую пептид, ополаскивают ДМФА (2 раза по 100 мкл) и добавляют промывки к реакционной массе. Приливают 50 мкл триэтиламина, озвучивают ультразвуком, выдерживают, мягко перемешивая, под азотом 90 мин

12.4. МЕТОДЫ ПРИСОЕДИНЕНИЯ

391

при 45 °С, промывают ДМФА, метанолом и центрифугируют. Жидкость над осадком контролируют на содержание пептида.

Насыщение. К носителю добавляют 200 мкл раствора ФИТЦ в ацето-нитриле (1 : 5, по об.) и 200 мкл буфера № 1 (разд. 12.2.6). Перемешивают под азотом 30 мин при 30 °С. Центрифугируют и промывают смолу ДМФА (2 мл) и метанолом (2 раза по 2 мл). Сушат смолу в вакууме.

12.4.4. Присоединение по карбоксилу при помощи карбодиимида

С-концевой карбоксил пептида активируется водорастворимым карбодиимидом и ковалентно связывается с аминополисти-ролом и аминопропилстеклом (а также с [}-АПС).

Ранее проводили активацию пептидов, защищенных по N-концевой аминокислоте, в безводных щелочных условиях, используя ТЭТА-смолу и проводя реакцию при 40—50 °С [48]. В настоящее время используют незащищенные пептиды, а саму активацию проводят в более мягких условиях во избежании нежелательных реакций карбоксильных групп белковых цепей [3, 36, 49, 50, 72, 76]. Было найдено, что при использовании аминополистирола присоединение при рН 3—5 предпочтительнее конденсации в щелочных условиях. Напротив, носители на основе стекла лучше применять в безводных условиях [52, 60]. Кроме того, предложено совместное использование присоединения по карбоксильным группам пептида и по остаткам Lys [54, 55].

12 AAA. Достоинства, ограничения, методика присоединения. Достоинства.

1. Присоединение по карбоксилу можно применять почти по всем типам пептидов, включая аргинил- и лизилсодержащие фрагменты триптических гидролизатов.

2. Конденсация в кислых условиях удобна во многих случаях, особенно тогда, когда лизилсодержащие пептиды нерастворимы в щелочных условиях, используемых в ДИТЦ-методе.

3. При наличии в пептиде внутренних остатков Lys с неизвестным расположением в цепи присоединение этого фрагмента по С-концу является предпочтительным.

4. Метод может быть испольозван для изучения аминокислотной последовательности на микроуровне.

Ограничения.

1. Для небольших пептидов конденсация проходит с выходом 40—70% [52]; при наличии С-концевого Lys выходы малы.

2. Пептиды, содержащие более 30 аминокислот, и белки часто присоединяются с выходами до 80—90%. Например, для брадикинина и В-цепи инсулина выходы составили 70—75 и — 60% соответственно [73]. В случае белков эффективность

392

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

конденсации может достичь 90%. Однако чем лучше идет присоединение белков к носителю, тем хуже они вступают в реакцию Эдмана (возможно, из-за стерических препятствий). Поэтому следует избегать количественного присоединения белка по всем СООН-группам. Мы нашли, что лучше всего, когда выход составляет 10—30% теоретического, с преимущественным присоединением по С-концевому карбоксилу. Однако для белков наилучшие результаты определения последовательности получены при использовании ДИТЦ-метода [37].

Методика L Присоединение к аминополистиролу.

Отмывка смолы. К 30—50 мг аминополистирола добавляют 1 мл буфера № 2 (разд. 12.2.5), суспензию перемешивают до появления фиолетовой окраски раствора. Смолу промывают водой (2 раза по 8 мл), ДМФЛ (2 раза по 1 мл), центрифугируют.

Присоединение. Высушивают раствор пептида в вакууме. Образец должен быть свободен от соли и органических кислот (например, уксусной, муравьиной). 5—50 нмоль пептида растворяют (под азотом) в 50 мкл буфера № 2. Отбирают пробу на проверку полноты растворения. Добавляют раствор пептида к предварительно отмытой смоле. Пробирку, содержащую пептид, ополаскивают 200 мкл ДМФА и добавляют промывки к реакционной смеси. Ополаскивание пробирки повторяют (100 мкл ДМФА). Добавляют под азотом свежеприготовленный раствор 2 мг карбодиимида в смеси 20 мкл воды и 80 мкл ДМФА. Перемешивают 60—120 мин при 30 °С (при работе с G!x- и Asx-содержащими пептидами время конденсации составляет 30—60 мин). Реакционную смесь центрифугируют; жидкость над осадком контролируют на содержание несвязанного пептида. Смолу промывают ДМФА, метанолом, буфером ЛНасыщение свободных аминогрупп. Добавляют под азотом к пептп-дилполимеру 200 мкл буфера Л!> 1, затем 200 мкл раствора № 1, содержащего ФИТЦ (разд. 12.2.6). Аккуратно перемешивают 30 мин при 30 °С. Смолу промывают ДМФА (2 раза по 200' мкл), метанолом (2 раза по 200 мкл), центрифугируют, сушат в вакууме.

Методика 2. Присоединение к аминопропилстеклу.

Подготовка пептида. 5—50 нмоль образца сушат в вакууме. Растворяют в 50—100 мкл безводной ТФУ, выдерживают под азотом при комнатной температуре в течение 15 мин. Немедленно сушат в вакууме над таблетками КОН (сушить не более 15 мин, более продолжительное высушивание может сделать образец нерастворимым).

Отмывка носителя. Носитель (взятый в соотношении 1 мг/нмоль пептида) промывают ДМФА (4 раза по 2 мл/50 мг стекла).

Присоединение. К высушенному пептиду приливают свежеприготовленный раствор карбодиимида (2 мг в 200 мкл ДМФА). Озвучивают смесь в течение 1 мин. Добавляют 50 мг аминопропилстекла и деаэрируют. Выдерживают под азотом (при аккуратном перемешивании) при 40 °С в течение 60 мин. Центрифугируют. Жидкость над осадком контролируют па содержание несвязанного пептида. Пептидилстекло промывают ДМФА и метанолом (2 раза по 200 мкл). Цен

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Rondell RD-642
топорик для мяса
спортинвентарь для фитнеса
аренда маленьких помещений для хранения

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.05.2017)