химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

енная для проведения хроматографии с использованием в качестве элюента муравьиной кислоты.

трацией обладает ВЭЖХ. В этом случае укороченное время анализа вполне компенсирует небольшую емкость колонок. Несомненно, что благодаря технологическому прогрессу в недалеком будущем окажутся доступными колонки большой емкости, однако уже сегодня можно предполагать, что они будут иметь высокую стоимость. Мономеры можно разделять также с помощью препаративного электрофореза в ПААГ —ДСН. По производительности метод уступает гель-фильтрации: предельная нагрузка 50 мг белка, однако с помощью электрофореза можно разделять субъединицы с примерно равными молекулярными массами [168]. На практике в основном используются два различных варианта электрофореза. Первый вариант представляет собой модификацию аналитического метода. Можно, например, увеличить толщину пластины геля или, исключив гребенку, наносить образец в виде сплошной полосы. После проведения электрофореза для проявления белковых зон используют обработку по одной из следующих методик:

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

39

1. Гель выдерживают в красителе более короткое время или же используют более разбавленный раствор красителя (0,05%-ный раствор кумасси), чем это принято в типовой методике (разд. 1.2.1.1).

2. Окрашивают контрольные полоски геля (при сравнении с исходным гелем следует учитывать усадку пластины при обесцвечивании в смеси метанол — уксусная кислота).

3. Пропитывают гель 1 М КС1, после чего зоны белка обнаруживают по опалесценции за счет образования нерастворимого додецилсульфата калия [180].

4. Пропитывают гель 4 М ацетатом натрия, при этом зоны белка выявляются в виде прозрачных полосок (предел обнаружения 0,1 нг/мм3) [76].

Зоны, представляющие интерес, вырезают и белок выделяют экстракцией [49, 64] или элюированием в условиях электрофореза [2, 175]. При определении аминокислотного состава приготовленных таким способом образцов обязательно вводят необходимые поправки, учитывающие присутствие акриламид-пого геля [26]. Согласно другому варианту, белки разделяют электрофорезом в блоке акриламидного геля, при этом под действием электрического поля белковые фракции попадают в проточную камеру, откуда и вымываются раздельно потоком элюэнта. Ход элюирования регистрируют с помощью проточного денситометра, элюат собирают на фракционном коллекторе. Недавно разработана методика элюирования белков из системы ПААГ —ДСН в промежуточный гель с использованием восходящего электрофореза [121]. Выход достигается высокий, однако образец может содержать примеси компонентов акриламидного геля и буферной системы. Гели для препаративного электрофореза могут иметь форму столбиков (LKB) или пластин (блоков) (Biorad). Для разделений по описанной методике используют различную аппаратуру, выпускаемую фирмами.

1.3.2.2. Ионообменная хроматография. Для разделения белков на субъединицы по суммарному заряду используют методы ионообменной хроматографии, электрофореза (разд. 1.3.2.3), изоэлектрического фокусирования и хроматофокусирования (разд. 1.3.2.4).

При ионообменной хроматографии образец наносят на колонку с ионитом (сорбентом), несущим положительно (анионит) или отрицательно (катионит) заряженные ионогенные группировки. На сорбенте, заряженном положительно, компоненты разделяемой смеси, также несущие положительный заряд (при условии, что рН буфера не превышает р/С), проходят свободно с потоком элюента, а компоненты, заряженные отрицательно, удерживаются. Слабосорбированные вещества элюируют исход-

40

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

ным буфером, сильносорбированпые «снимают» с колонки, пропуская раствор с более высокой ионной силой или с другим рН. В результате компоненты смеси элюируются в порядке возрастания суммарного заряда.

Ионогенные группы фиксируют на различных инертных носителях; наиболее распространенные из них гранулированная целлюлоза (фирмы Whatman, Serva, Bio-Rad, Eastman) и сферическая целлюлоза (фирма Pharmacia). В качестве носителя используются также агароза и декстран (имеющие поперечную сшивку). Ионообменники на основе декстрана характеризуются высокой емкостью и с успехом применяются для разделения не очень крупных биомолекул. Главным недостатком иопитов этого типа является сильная зависимость объема гранул от ионной силы и рН буферного раствора. При разделении изо-форм соевой липоксигеназы-1 методом ВЭЖХ с успехом использовался катионит TSK-Gel LS-212 [9]. Недавно фирма Pharmacia выпустила крупнопористый ионообмеииик для ВЭЖХ, позволяющий проводить разделение с высокой скоростью и хорошим разрешением (гл. 6).

Большинство анионитов в качестве ионогенных функциональных групп включают диэтиламиноэтильную (ДЭАЭ) или ди-этил (2-гидроксипропил)аминоэтильную (ДГПАЭ) группы. В катеонитах ионогенными группами являются карбоксиметильная (КМ), фосфатная (Ф) и сульфопропильная (СП) группы. На сильных ионообменниках (содержащие группы ДГПАЭ, Ф и СП) рекомендуется фракционировать вещества, проявляющие слабокислотные или слабоосновные свойства, или вести разделения в области экстремальных рН. Эффективность разделения белков на ионитах зависит не только от суммарного заряда. Так, белки с высоким содержанием ароматических аминокислот фракционировали на ДГПАЭ-целлюлозе при рН 0,5 по их гидрофобным свойствам [65].

Выбор ионообменника зависит от свойств исследуемых белков. Обычно хроматографию проводят в том буфере, при котором целевые компоненты смеси предельно различаются по величине суммарного заряда. При выборе рабочего диапазона рН можно руководствоваться результатами электрофореза или изоэлектрофокусировапия (т. е. изоточками компонентов смеси) (разд. 1.3.2.4). При отрицательном суммарном заряде хроматографию проводят на анионите, при положительном суммарном заряде — на катионите. Выбору оптимальных условий ионообменного разделения должна предшествовать предварительная оценка свойств разделяемой смеси с помощью простых тестов.

Выбор ионообменника. Аликвотные части раствора белка смешивают с катионитом и анионитом, уравновешенными буфером с определенным рН. По оптической плотности жидкости

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

41

над ионитом определяют степень связывания белка сорбентом и тем самым находят тип ионита и величину рН, при которых сорбция исследуемого белка достигает максимума. На практике в пробирки помещают по 0,05 г каждого ионита, например ДЭАЭ- и КМ-целлюлозу, и по 30 мл соответствующего буферного раствора (для апионита — 0,05 М трис-HCl, рН 8,5; для катиопита — 0,05 М ацетат натрия, рН 5,0), содержащего 8 М мочевину (необходимую для диссоциации олигомера). Иониты приводят в равновесие с буферным раствором, заменяя супер-иатант свежим буфером дважды или более раз, большую часть жидкости над ионитом удаляют (так, чтобы общий объем ионита с буфером над ним составил 10 мл). В каждую пробирку прибавляют равное количество белка, перемешивают встряхиванием и после оседания ионита жидкость отделяют. Оптическую плотность супериатапта измеряют спектрофотометрически. Некоторые белки сорбируются как па катиопите, так и на аниопи-ге, в этом случае оба этих ионита пригодны в качестве хрома-гографического сорбента. В то же время, если белок не сорбируется на ДЭАЭ и КМ-целлюлозе, необходимо уменьшить концентрацию буфера или использовать более сильные иониты.

Методика проведения ионообменной хроматографии. Исчерпывающую информацию относительно свойств и физических характеристик различных ионитов, а также практические рекомендации по работе с ними можно найти в материалах, выпускаемых фирмами-изготовителями. Хороший обзор по целлюлозным иопообмепникам опубликован Петерсоном [133].

Сухой ионит предварительно подвергают кислотной и щелочной обработке и лишь затем уравновешивают рабочим буфером. Аииониты, например ДЭАЭ-целлюлозу, суспендируют в 0,5 М НС1 (15 мл/г) и перемешивают в течение 30 мин. Жидкость отделяют фильтрованием, ионит промывают водой и суспендируют при перемешивании в равном объеме 0,5 М NaOH в течение 30 мин. Жидкость вновь отделяют, ионит промывают водой. Затем ионит суспендируют в рабочем буфере (20 мл/г), перемешивают в течение 10 мин, отделяют путем декантации и фильтрованием. Операцию повторяют трижды до тех пор, пока рН и электропроводность жидкости над ионитом не сравняется с параметрами рабочего буфера. Катиониты обрабатывают аналогичным образом, однако в иной последовательности. Например, КМ-целлюлозу промывают вначале 0,5 М NaOH, а затем 0,5 М НО. Иониты, поставляемые во влажном виде, не нуждаются в предварительной «тренировке», их уравновешивают рабочим буфером по обычной методике.

Далее удаляют мелкую фракцию ионита. Суспензию взмучивают в мерном цилиндре, оставляют в покое для отстаивания в течение 1 ч, жидкость отбрасывают.

42

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

Готовят суспензию, свободно пропускающую пузырьки воздуха, деаэрируют в вакууме водоструйного насоса и набивают колонку. Для препаративных целей используют колонки диаметром 1,5ч-2,5 см, длиной 50^ 100 см; перед набивкой колонку снабжают насадкой, позволяющей в один прием внести всю массу ионита. После набивки пропускают через слой ионита 1—2 объема рабочего буфера. Скорость промывания должна быть идентична предполагаемой скорости элюирования, а объем сорбента должен оставаться постоянным.

Образец растворяют в исходном буфере, в случае необходимости диализуют в течение 12 ч. Если целевые компоненты смеси сорбируются достаточно прочно, объем раствора образца значения не имеет. В случае слабой сорбции объем вводимого в колонку образца не должен превышать 1—2% ее объема. Нагрузка должна быть <10% емкости сорбента.

Ход элюирования регистрируют по изменению оптической плотности при 280 нм (или с помощью методов, описанных в разд. 1.2.2.1), элюат собирают по фракциям. Компоненты смеси, удерживаемые ионитом, элюируют, изменяя ступенчато или плавно ионную силу или рН рабочего буфера. Элюирование в ступенчатом градиенте приводит к появлению артефактов и вследствие этого применяется все реже.

Способы формирования градиентов. Градиент концентрации или градиент рН формируют с помощью двух сообщающихся сосудов или перистальтического насоса. Выпускаются также специальные формирователи градиента.

Система из двух сообщающихся сосудов с вертикальными стенками изображена на рис. 1.4, а. Обозначим площадь поперечного сечения смесителя 1 и резервуара 2 как Аг и A2t а концентрации исходного и конечного буфера Сг и С2. Если оба буферных раствора имеют одинаковую плотность, то изменение концентрации элюента можно описать следующим образом:

С = С2 — (С* — С{) (1 — v/ V)MIAl

где v — объем элюэнта, поданного системой на колонку, V — суммарный объем смесителя и резервуара. При А\ = А2 формируется линейный градиент, если АХ<А2, градиент выпуклый, если Ai>A2y градиент вогнутый [22].

Для построения градиентов можно использовать многоканальный перистальтический насос (рис. 1.4,6). Форма градиента определяется скоростью потока Ri (из сосуда 2 в сосуд 1) и R2 (из сосуда / в колонку), концентрациями Сх и С2 и объемом V\ сосуда L Через время / концентрацию буфера, поданного на колонку, можно вычислить по формуле [96]:

С = {С,-Сд[ 1-——^—-J

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

43

[f

выход на колонку

выход на - колонку

РИС. 1.4. Способы формирования градиента с помощью сообщающихся сосудов (а) и перистальтического насоса (б). I — смеситель; 2 — резервуар. Форма градиента определяется площадью поперечного сечения сосудов (а) или диаметром эластичных трубок перистальтического насоса (б).

Если R2=2RU формируется линейный градиент, угол наклона которого определяется по формуле:

(С,-CQ R,

Vi

При R2>2R\ формируется выпуклый, а при R2<2Ri вогнутый градиенты. Если RiУ большинства перистальтических насосов скорости потока R\ и R2 можно варьировать путем изменения диаметра трубок. Выпускаются насосы, позволяющие варьировать скорости потоков в широком диапазоне. Если диаметр трубок можно варьировать в ограниченных пределах, линейный градиент формируют с помощью трех каналов одинакового диаметра. По одному каналу подают буфер из сосуда 2 в сосуд /, а по двум остальным — буфер из сосуда 1 в колонку.

1.3.2.3. Электрофорез в полиакриламидном геле. С помощью аналитического электрофореза в присутствии 8 М мочевины идентифицируют мономеры, имеющие различные отношения от-

44

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

рнцательного заряда к массе, а также делают заключение о типе ионита и рН рабочего буфера для выделения мономеров методом ионообменной хроматографии. В препаративном варианте используются условия, повторяющие аналитическую систему, или электрофоретическое элюирование (разд. 1.3.2.1).

Выбору оптимальных условий электрофореза в ПААГ посвящена работа [33]. Имеется компьютерная распечатка 5000 буферных систем для электрофоретического разделения катионов и анионов в диапазоне рН 2,5—11 [35]. На практике используются лишь немногие из этих систем с наиболее типичными рН [119]. Далее описана система, предложенная Девисом [43], несколько модифицированная путем введения 8 М мочевины.

Часто возникает задача определения молекулярных масс белков, которые удалось электрофоретически разделить по величине заряда. В этом случае проводят электрофорез в трубке в присутствии 8 М мочевины, а затем в перпендикулярном направлении в блоке в присутствии ДСН (двумерный электрофорез в геле обсуждается в разд. 7.3,2).

Электрофорез при рН 8,9 в присутствии 8 М мочевины. Методика эксперимента, аппаратура, реагенты, красители, а также способы фоторегистрации описаны в разд. 1.2.1.1 и 1.3.1.1. Далее остановимся на модифицированной системе Девиса [43].

Буфер рабочего геля: 3 М трис, оттитрованный НС1 до рН8,9.

Буфер формирующего геля: 0,5 трис, оттитрованный фосфорной кислотой до рН 6,8.

Буфер для приготовления образцов: 2 мл буфера формирующего геля, 6 г мочевины, 5 мл воды, 5 мг бромофенолового синего.

Электродный буфер: 0,005 М трис + 0,04 М глицин. Запасной раствор: 29,2% (масс/об.) акриламида, 0,8% (масс./об.) Ы^'-метилепбисакр ил амида.

Соотношение компонентов для приготовления 10 мл рабочего акриламидного геля различной концентрации

7,5% 10% 12,5%

30%-ный раствор акриламида 2,50 мл 3,33 мл 4,17 мл

Буфер для рабочего геля 1,25 мл 1,25 мл 1,25 мл

Мочевина 4,8 г 4,8 г 4,8 г

Вода 2,65 мл 1,82 мл 0,98 мл

ТЕМЕД 5 мкл 5 мкл 5 мкл

Персульфат аммония 5 мг 5 мг 5 мг

После прибавления к раствору персульфата аммония раствор деаэрируют под вакуумом водоструйного насоса и переносят в камеру для электрофореза (защищают от кислорода воздуха слоем воды или насыщенного водой изобутанола). По завершении полимеризации сливают защитный слой, поверхность промывают раствором формирующего геля и вносят пред-

].3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

45

варителыго деаэрированный раствор формирующего геля. Для приготовления 10 мл формирующего геля смешивают 1,3 мл запасного раствора, 1,25 мл формирующего геля, 4,8 г мочевины, 3,8 мл воды, 5 мкл ТЕМЕД,

страница 6
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обслуживание чиллеров york прайс
http://taxiru.ru/magnitnyie-nakladki/
привод звоздушной заслонки gca321/1e
купить кровать veda

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.10.2017)