химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ИТЦ в 1 мл ацетонитрила.

Раствор фенилизотиоционата (ФИТЦ): 10%-ный раствор ФИТЦ в аце-тонитриле. К 50 мл ацетонитрила добавить под азотом 5 мл ФИТЦ.

Раствор ФИТЦ № 2 (для анализа на микроуровне с ДАБИТЦ — ФИТЦ): 5%-ный ФИТЦ в ДМФА. К 19 мл ДМФА под азотом добавить 1 мл ФИТЦ.

Раствор ДАБИТЦ (для анализа на микроуровне): 0,5 %-ный ДАБИТЦ в ДМФА. К 20 мл ДМФА под азотом добавить 100 мг ДАБИТЦ. Готовить свежий раствор каждые 24 ч.

Растворитель для анализа на микроуровне: 0,2%-ный триэтиламин в метаноле. К 500 мл метанола под азотом добавить 1 мл триэтиламииа.

12.3. Синтез смол

12.3.1. Смолы на основе полистирола

Исходным материалом для синтеза модифицированных смол на основе полистирола служит сополимер стирола с 1% диви-нилбензола (Biobeads S-XI, фирма Biorad). На рис. 12.1 приведены схемы синтеза некоторых смол.

Полимеры, предназначенные для твердофазного анализа последовательности, должны обладать двумя существенными особенностями:

1) функциональные группы полимера должны быть доступны для пептидов и реагентов;

2) смола должна быть химически и механически устойчива в условиях реакции Эдмана.

12.3.1.1. Способность к набуханию. Для определения степени набухаемости смолы измеряют высоту слоя смолы (в небольшой плоскодонной пробирке) до и через 1 ч после добавления растворителя [27]. Отношение объемов набухшей и сухой смолы (Vs/Vd) должно составлять по крайней мере 3-ь5 для того, чтобы реагенты могли проникать внутрь частиц гидрофобного полимера. После синтеза смол на основе полистирола следует сравнить их способность к набуханию со значениями, представленными в табл. 12.1. Шарики идеального носителя для анализа последовательности должны быть небольшими по размеру, иметь малый разброс по диаметру частиц, что существенно для упаковки хроматографической колонки; сохранять постоянный объем набухания и устойчивость ко всем реагентам и растворителям, используемым в процессе определения последовательности. Однако смолы, наиболее пригодные для анализа структуры по-липептидов, сильно набухают в пиридине, ДМФА, 1,2-дихлоро-этане, ТФУ. Поскольку эти смолы лишь частично удовлетворяют вышеуказанным идеальным требованиям и изменение их объема в процессе определения структуры ведет к закупорке колонки

330 12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

2 7

I 1

J &

РИС 12.1. Синтез носителей на основе поперечно-сшитого полистирола. / — сшитый полистирол, 2 — нитрополистирол, 3— аминополистирол, 4 — хлороме-тилированный полистирол, 5 — этилендиаминополистирол, 6—¦ трнэтилентетр-аминополистирол, 7 — нитрохлорометилполистирол, 8 — аминоэтилендиамино-полистирол. Метод получения соединений 3 и 8 описан в тексте. Синтез остальных носителей см. в работе [29].

или же к неэффективному проникновению реагентов и растворителей в поры носителя, то перед заполнением колонки смолы «разбавляют» стеклянными шариками (30-кратиое «разбавление» по массе) (см. разд. 12.5.2).

12.3.1.2. Синтез аминополистирола. В исходную методику [28, 30] внесены некоторые изменения.

Синтез нитрополистирола. 5 г полистирола (Biobeads S-XI, minus 400 меш) тщательно промывают последовательно бензолом, хлороформом, диоксаном, метанолом, расходуя по 200 мл каждого растворителя; продолжительность каждой промывки

12.3. СИНТЕЗ СМОЛ 381

Таблица 12.1. Способность к набуханию смол на основе полистирола2

Метанол Пиридин ДМФА ТФУ Смола ч ч ч ч

S S S а? ¦—. s

С) <о """to <0 <о <о to со

Полистирол (Bio- 140 200 1,4 750 5,4 400 2,3 200 1,4

beads S-XI Minus

400 меш)

Хлорометилиро- 150 170 1,1 600 4,0 550 3,7 300 2,0

ванный полисти-

рол (Biobeads)

5-XI200—400 меш)

Аминополисти- 155 200 1,3 250 1,6 700 4,5 850 5,5

рол6

ТЭТА-полисти- 180 500 2,8 600 3,3 500 2,8 650 3,6

рола

а Объпм cyxort (VD) и набухшей смолы (Vs) и отношение V$Wd определяли по Ларсену [27J: после центрифугирования измеряли объем 100 мг смолы, обрабатывали се 2 мл каждого растворителя, перемешивали, выдерживали 60 мин при комнатной температуре, центрифугировали, измеряли объем набухания.

^ Синтез описан в разд. 12.3.1.2.

в Синтез описан в разд. 12.3.1.3.

30 мин. Затем промывают метанолом на металлическом сите (60 мкм) для удаления больших частиц, сушат шарики в вакууме. Выход —4 г. В охлажденную до — 3°С дымящую (90%-ную) азотную кислоту (55 мл) небольшими порциями в течение 15 мин при перемешивании добавляют смолу, поддерживая температуру не выше — 3°С. Перемешивают смесь 1 ч при 0°С. Смесь выливают на 500 мл льда и собирают смолу на пористом стеклянном фильтре. Промывают попеременно диок-саном (4 раза по 200 мл) и водой (4 раза по 200 мл), затем метанолом (2 раза по 200 мл). Просеивают через сито (60 мкм) для удаления крупных частиц смолы и высушивают нитрополи-стирол в вакууме. Выход 6—7 г.

Синтез аминополистирола. Перемешивают суспензию 6,3 г питрополистирола в 115 мл ДМФА при 140°С (маслялая баня). Медленно добавляют 48 г SnCl2-2H20 в 40 мл ДМФА (экзотермическая реакция), затем выдерживают реакционную массу 30 мин при 140°С. Охлаждают смесь до 100°С и добавляют 41 мл концентрированной соляной кислоты. Термостатируют при 95 °С в течение 1 ч, собирают смолу на пористом стеклянном фильтре. Промывают 2 М НС1 (2 раза по 200 мл), водой (2 раза по 200 мл), просеивают через сито (100 мкм) для отделения грубы< частиц смолы. Повторяют промывку 2 М НС1

382

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

и водой, затем смесью ДМФА — триэтиламин (3:1, 2 раза по 200 мл) до отсутствия ионов хлора в промывках. Продукт (смола темно-зеленого цвета) промывают водой и еще раз просеивают через сито (100 мкм). Промывают метанолом (2 раза по 200 мл) и вновь просеивают через сито (60 мкм). Желто-коричневую смолу сушат в вакууме при 60°С. Выход 5,5 г.

Хранение смолы. Аминополистирол при комнатной температуре сохраняет свои свойства и характеристики всего один месяц. Небольшие количества можно хранить под азотом в запаянных ампулах при — 20°С. В таких условиях смола сохраняет свои свойства до одного года.

Способность к набуханию. Полимер легко набухает в ДМФА и ТФУ, хуже — в пиридине и метаноле (табл. 12.1).

12.3.1.3. Синтез триэтилентетраминополистирола (ТЭТА-поли-стирола). ТЭТА-полистирол получают по методике, описанной в работах [24, 30]. Промывают частицы хлорометилировапного полистирола (Biobeads S-XI) бензолом, хлороформом, диоксаном и метанолом; сушат в вакууме. Перемешивают 1 г свежеприготовленной смолы с 15 мл триэтилентетрамина (ТЭТА) в течение 30 мин при комнатной температуре, затем нагревают на масляной бане при 115 °С еще 90 мин. Собирают смолу на пористом стеклянном фильтре, тщательно промывают 20 мл триэтиламина в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтруют. Промывают попеременно метанолом, водой (каждым растворителем 3 раза по 200 мл), промывают еще раз водой, центрифугируют. Кипятят смолу в 50 мл 1 М соляной кислоты в течение 2 ч для удаления следов несвязанного ТЭТА, фильтруют. Промывают водой, триэтиламином, водой, метанолом (каждым растворителем 2 раза по 1 мл). Сушат в вакууме в течение ночи. Выход ~ 1 г.

Хранить, как аминополистирол. По стабильности ТЭТА-полистирол уступает аминополистиролу. После нескольких месяцев хранения при использовании в реакции Эдмаиа возрастает фон загрязнений.

Способность к набуханию хорошая (табл. 12.1). Следует промывать смолу непосредственно перед использованием, для чего используют растворители: ДМФА (2 раза по 1 мл), метанол (2 раза по 1 мл), триэтиламин (15 мл в течение 20 мин), воду, метанол; сушат в вакууме.

12.3.2. Носители на основе стекла

Пористые стеклянные шарики были предложены в качестве носителей для твердофазного анализа в 1973 г. [42, 61, 62].

12.3. СИНТЕЗ СМОЛ

12.3.2.1. Свойства стекла с контролируемым размером пор (фирма Corning). Стекла марки CPG содержат 96% кремнезема, 3—4% В203, 0,5—1% Na20 и следовые количества оксидов некоторых металлов. Выпускаются в виде пористых шариков, как необработанных, так и модифицированных разными химическими методами, что делает стекла пригодными для многих целей.

Скорость разрушения стекла CPG. Шарики очень устойчивы к механическим повреждениям; скорость разрушения этих носителей зависит от температуры, времени, рН, состава и объема раствора, площади поверхности частиц (чем меньше размер пор, тем больше площадь поверхности). Устойчивость стекла заметно снижается во времени в присутствии ТФУ; эти носители чувствительны к фтороводороду.

Преимущества использования пористых стекол для анализа аминокислотной последовательности. Шарики CPG сохраняют постоянный объем в ходе всего цикла отщепления, не подвержены набуханию — сжатию, поэтому в отличие от носителей на основе органических полимеров ими можно заполнять колонки без разбавления другими материалами. Стекла нечувствительны к давлению в колонке, поэтому жидкости можно прокачивать через колонку с высокой скоростью. Они химически устойчивы во всех средах, за исключением сильных оснований, особенно при высоких температурах, поэтому присоединение пептидов к носителям следует проводить при рН<10.

Современная методика использования стекол CPG описана в работе [32]. Белок присоединяют за N-концевую аминокислоту к носителю, частично расщепляют бромоцианом. Смесь пептидов смывают со стекла и анализируют их структуру дансиль-иым методом с двойной радиоактивной меткой. Можно использовать и другие методы расщепления белка.

12.3.2.2. Получение носителей, содержащих аминогруппы. Для получения амипопропилстекла (АПС) и [i-N-аминоэтил-(3-ами-попропил) стекла (р-АПС) пористые шарики (CPG, 10/75, 200—400 меш) обрабатывают З-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) и р-аминоэтил- (З-аминопропил)триметоксисилапом (АЭАПТМС) [6, 17, 51, 61]. Такая модификация шариков с поминальным диаметром пор 75 А позволяет получить носители с емкостью связывания пептидов 150—170 нмоль/мг стекла [61]. Схема синтеза приведена на рис. 12.2.

Методика. 4 г шариков (CPG, 10/75, 200—400 меш, фирма Serva) деаэрируют 2 ч при 180°С в вакууме (водоструйный насос). Добавляют 30мл сухого толуола и 3 мл АПТЭС (или АЭАПТМС). Деаэрируют и нагревают в закрытой колбе при 75 °С в течение 24 ч с легким перемешиванием (предпочтительно под а ютом). Носитель отделяют от раствора на стеклянном фильтре, промывают последовательно толуолом, ацетоном, метанолом

to

QO

он -Ami

он

(4f^OH t (СНзОь-S.-K H:) -NH- (CH2);-NH2 —" OH

аминопропилстекло

О

(Cl^(^Si-K,H,|,-NH--|CH:):-NH; /у-аминоэтил -СЗ-аминопропил) стекло

SCN-

-NC S

~" " S ОИТЦ-стекло

РИС. 12.2. Получение аминопропилстекла (АПС), р-Ы-аминоэтил-(3-аминопропил)стекла (р-АПС) и изотиоцианатстекла (ДИТЦ-стекло).

3: m

О Ja

н

ГО

го

§

>

W

Д О

д >

S ы >

12.3. СИНТЕЗ СМОЛ

385

(каждым растворителем 2 раза по 50 мл). Сушат в вакууме над Р2О5 при комнатной температуре. Хранят под азотом при 4 °С.

12.3.2.3. Получение изотиоцианатного стекла. Для синтеза изо-тиоцианатаминопропильного носителя (ИТЦ-АПС), к которому можно присоединять пептиды, содержащие остатки лизина и аминоэтилцистеина, аминогруппы аминопропильного стекла активируют л-фенилендиизотиоцианатом (ДИТЦ) (рис. 12.2) [43, 61].

Методика. Для проведения реакции рекомендуется использовать 25 моль ДИТЦ на каждую аминогруппу носителя и 2—3 объема ДМФА на объем стекла. 1 г ДИТЦ растворяют в 13 мл ДМФА. При легком перемешивании порциями в течение 1 ч добавляют 2 г аминопропилстекла. Смесь выдерживают при комнатной температуре 2 ч. Шарики промывают на стеклянном фильтре ацетоном и ДМФА (2 раза по 50 мл), метанолом (2 раза по 10 мл). Носитель сушат в вакууме.

Хранят, как АПС.

12.3.3. Определение содержания аминогрупп в носителях на основе органических полимеров или пористых стекол

Определив число аминогрупп, можно оценить изменение свойств носителя при храпении и провести сравнение свойств различных партий одного и того же носителя. См. также разд. 8.2.1.

12.3.3.1. Методики.

Методика 1 [33]. Аминогруппы носителя алкилируют тринитробензол-сульфокислотой. Гидролиз едким кали расщепляет связи Si—О стекла и превращает тринитрофенильные группы в пикриновую кислоту, содержание которой можно измерить фотометрически. Воспроизводимость метода — несколько процентов.

Смешивают в небольшой пробирке 50 мг 3-аминопропилстскла с 15 мг тринитробензолсульфокислоты в 1 мл 0,1 М NaB02 (рН 9,07). Перемешивают в течение 1,5 ч вращением пробирки в горизонтальной плоскости. Промывают водой (3 раза но 8 мл), центрифугируют. К влажному носителю прибавляют 1 мл 2 М КОН, перемешивают 60 мин при 45 °С. Разбавляют водой и измеряют поглощение при 358 нм. Рассчитывают содержание аминогрупп, учитывая, что в щелочной среде пикриновая кислота имеет ?358= 14 1 00. Для аминопропилстекла содержание аминогрупп обычно составляет 25—150 мкм/г носителя [29].

Методика 2 [18]. Набухший полимер реагирует с пикриновой кислотой, образующей соль с аминогруппами носителя. Полимер обрабатывают избытком сильного основания, переводя связанный пикрат в раствор, где и измеряют его содержание.

50 мг носителя замачивают в 1,2-дихлороэтане на 5 мин. Нейтрализуют 5%-ным (об./об.) раствором диизопропилэтиламином в дихлоромета-не в течение 3 мин. Обрабатывают 0,1 М пикриновой кислотой в дихлоро-метане (3 мин). Промывают носитель дихлорометаиом (5 раз по 2 мл). Элюируют пикрат 5%-ным диизопропилэтиламином в дихлорометане (2 порции по 3 мл), промывают смолу дихлорометаиом (3 раза по 2 мл). Разбавляют раствор 95%-ным этанолом и измеряют поглощение. Для пи-крата диизопропилэтиламина в диапазоне концентраций 1 -г-20-10~5 моль/л {в этаноле, содержащем ^20% дихлорометана) е358= 14 500.

25 703

386

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

Методика 3 [56]. Аминогруппы носителя превращают в связанное основание Шиффа реакцией с 2-гидрокси-1-нафтальдегидом, которое затем переводят в раствор обработкой бензиламипом. Концентрацию основания Шиффа в растворе определяют спектрофотометрически.

1—5 мг носителя смешивают с 2 мл 0,2 М 2-гидрокси-1-нафтальдегида в ДМФА и оставляют на 15 ч при комнатной температуре. Промывают смолу ДМФА (4 раза по 3 мл), затем этанолом до полного отсутствия поглощения при 270 нм в промывных фракциях. Добавляют 2 мл 0,4 М бензиламина в этаноле, выдерживают 45 мин при комнатной температуре. Центрифугируют, измеряют поглощение при 420 нм. Для основания Шиффа Е42э=Ю900 (в этаноле). Для твердофазных носителей емкость по связыванию определяется числом аминогрупп, приходящихся на единицу массы носителя и доступных для присоединения.

12.4. Методы присоединения

12.4.1. Присоединение лизилсодержащих пептидов с помощью ДИТЦ [28, 61]

Пептиды, содержащие остатки лизина, расположенные как внутри цепи, так и на С-конце полипептида, а также пептиды, содержащие амипоэтилцистеин, могут быть эффективно присоединены своими свободными амин

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы 3д макса в москве
курсы флористики для начинающих в москве лубянка
заказать информационную доску для документов
курсы завивки волос в москве обучение

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)