химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

глутамина в пирролидонкарбоновую кислоту).

10. Пептид высушивают над гидроксидом натрия, в случае необходимости добавляют 50 мкл этанола и снова упаривают.

11. Добавляют 100 мкл деионизованной воды. На вибромешалке тщательно перемешивают с 1 мл бутилацетата и разделяют фазы на настольной центрифуге (5 мин). Органическую фазу удаляют, тщательно контролируя, чтобы не захватить возможный осадок нерастворимого пептида на границе двух фаз. Промывку бутилацетатом повторяют дважды.

12. Водную фазу высушивают и растворяют в 1%-ном триэтиламине. Часть раствора берут на дансилирование, остаток высушивают и проводят следующий цикл деградации по Эдману. Если необходимо прервать процесс, то делают это всегда после стадии расщепления.

Замечание. Для ускорения высушивания образцов можно использовать вакуумную центрифугу (Speed Vac Concentrator фирмы Savant Instruments).

Литература

1. Chang /. Y., Burner D., Witiman-Liebold В., FEBS Lett., 93, 205—214 (1978).

2. Edman P., Begg G., Eur. J. Biochem., 1, 80—91 (1967).

3. Edman P., Henschen A., In: Protein Sequence Determination, Needleman S. B. (Ed.), 2nd ed., Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1975, pp. 232—279.

4. Gray W. R., Ph. D. Thesis, Cambridge University, 1964.

5. Gray W. R., Methods Enzymol., 25, 121 — 138 (1972).

6. Gray W. R., Methods Enzymol., 25, 333—344 (1972).

7. Hartley B. S.t Biochem. J., 119, 805—822 (1970).

Глава 12

МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Б. ВИТТМАН-ЛИБОЛЬД (В. WITTMANN-LIE-BOLD, Max-Planck-Institut fur Molekulare Gene-tik, Abteilung Wittman, Ihnestrasse 63—73, D-10Q0' Berlin 33 (Dahlem)).

12.1. Введение

Впечатляющие успехи, достигнутые в последние десятилетия в определении первичной структуры белков, стали возможны благодаря, во-первых, введению в практику метода последовательного отщепления аминокислот от пептидов и белков при помощи фенилизотиоцианата (ФИТЦ) [14] и, во-вторых, разработке автоматического варианта этого метода [15]. Фенил-изотиоционат до сих пор сохранил свое значение для определения аминокислотной последовательности белков. Во многих лабораториях все еще пользуются ручными вариантами определения последовательности (например, методика, объединяющая отщепление по Эдману с идентификацией ДНС-амииокис-лот [19], полуавтоматический вариант определения с использованием ФИТЦ или недавно разработанный метод, основанный па совместном использовании 4-г>Ш'-диметиламиноазобензол-4/-изотиоцианата (ДАБИТЦ) и ФИТЦ [58]. Ручные модификации метода применяются по следующим причинам:

1) анализ аминокислотной последовательности часто проводится либо небольшими группами аналитиков-белковиков, либо лицами, не специалистами в химии белка. В обоих случаях трудно приобрести секвеиатор и обеспечить его техническое обслуживание;

2) при наличии квалифицированного персонала использование методик ручного анализа позволяет успешно проводить определение;

3) один человек может работать одновременно с 8—16 пептидами.

Хотя автоматический анализ требует больших затрат труда и средств для поддержания оборудования в работоспособном состоянии, он имеет преимущества перед ручными методами (абсолютная воспроизводимость условий для всех циклов отщепления, более эффективное удаление кислорода, каждый цикл отщепления проходит с более высоким выходом, возможна круглосуточная работа прибора). Кроме того, можно с успехом анализировать нерастворимые пептиды или те пептиды, которые

12.2. МАТЕРИАЛЫ

375

в ходе анализа становятся очень гидрофобными. Для реализации очевидных преимуществ автоматического метода были разработаны различные варианты секвенаторов: жидкофазного ¦(ЖФ) [15, 64], твердофазного (ТФ) [27, 35], газофазного (ГФ) [22] (см. в гл. 17 обсуждение последних достижений газофазного метода). В этой главе рассмотрен только ТФ-метод.

Принцип ТФ-анализа аминокислотной последовательности заключается в ковалеитном связывании пептида с нерастворимым носителем и последующим отщеплении (при помощи ФИТЦ) аминокислот от пептида, связанного с носителем. Разработан набор методов присоединения пептидов и белков к носителям, применяемым в виде шариков (производные полистирола или стекла, содержащие различные функциональные группы [33]). Носитель с ковалентно присоединенным пептидом (пептидил-носитель) можно упаковать в колонку и тщательно промыть реагентами и растворителями, используемыми в процессе анализа (при этом в отличие от ЖФ-метода нет опасности вымывания образца). После проведения полного цикла отщепления анилинотиазолинон АТЗ-аминокислоты вымывают из колонки, а пептид, укороченный на одну аминокислоту, остается присоединенным к носителю и доступным для проведения следующего цикла реакций.

ТФ-секвенатор легче обслуживать, чем жидкофазный, но новички часто затрудняются в выборе наилучшего метода присоединения конкретного пептида. Поэтому в данной главе в основном рассматриваются наиболее эффективные (с нашей точки зрения) методы синтеза носителей и присоединения пептидов. В настоящее время для анализа последовательности используют как большие, так и очень малые навески образца. Поэтому излагаемые в этой главе методы рассчитаны па работу с количествами от 500 пмоль до 20 нмоль пептида. Описываются только те методы, при использовании которых мы получали удовлетворительные результаты па пептидах, выделенных из реальных биологических объектов. Более подробную информацию можно найти в статьях, посвященных анализу на микроуровне [25, 52, 63], а также в обзорах по методам анализа последовательности [70, 71].

12.2. Материалы

12.2.1. Растворители

Для ТФ-анализа не обязательно использовать растворители высшей степени чистоты; в большинстве случаев достаточно, чтобы они имели квалификацию «ч. д. а.». Данные по определению аминокислотной последовательности, проведенные в раз-

376

12. MliГОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

ных лабораториях с использованием реактивов разных фирм,, дали сходные результаты. Однако для анализа на микроуровне необходимы растворители, свободные от примесей, присутствие которых может привести к образованию побочных продуктов, влияющих на результаты идентификации. Поэтому ниже приводятся методики очистки растворителей. Следует контролировать качество каждой очищенной партии, так как степень очистки может меняться от партии к партии.

Следует обязательно проверять наличие альдегидов и пер-оксидов в реактивах и растворителях; рекомендуется проводить (без добавления пептида) все этапы методики присоединения образца к носителю и использовать обработанный таким образом носитель для анализа на секвенаторе (холостой опыт).

Если на хроматограммах ГЖХ или ВЭЖХ отсутствуют пики примесей, а па пластинках ТСХ не обнаруживаются пятна при анализе тех же аликвот, что и при анализе структуры пептидов, то качество растворителей (реактивов) признается удовлетворительным. Кроме того, рекомендуется проводить пробные определения с использованием полипептидов известной структуры.

12.2.1J. Методики очистки [68, 72].

Ацетон (фирма Merck, марка «для анализа»). 2,5 л ацетона пропускают через колонку (внутренний диаметр 35 мм), заполненную силикагелем (высота слоя 80 мм) марки «SiIica 100—200, активный» и нейтральным оксидом алюминия (Alumina N активность I, фирма Woelm Pharma) и перегоняют в стеклянном приборе (/кип 56 °С). Растворитель хранят над молекулярными ситами типа 13х, фракция 1/16" (фирма Packard) или над ситами типа 3 А, диаметр частиц 2 мм (фирма Merck).

Ацетопитрил (фирма Merck, марка «для анализа»). Очищают так же, как ацетон. /кип 81—82°С. Хранят под азотом при 10 °С.

1,2-Дихлорэтан (фирма Merck, марка «для анализа»). Очищают и хранят, как ацетонитрил. *КиП 84 °С.

Диметилформамид (ДМФ А) (фирма Merck, марка «для анализа»). Перегоняют смесь 263 мл ДМФА+34 мл бензола+12 мл воды; первые 60 мл дистиллята, кипящего до 150 °С, отбрасывают; фракцию, кипящую выше 150 °С, собирают и перегоняют над Р205 при пониженном давлении (водоструйный насос). ДМФ А хранят над молекулярными ситами, как ацетон (см. выше).

Этаноламин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Перегоняют под вакуумом (15 мм рт. ст.) при 77°С. Молекулярная масса 61,08. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

N-Этилморфолин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Перегоняют дважды: сначала над борогидридом натрия, затем над нингидрином. Затем перегоняют на колонке, заполненной стеклянными кольцами. /кип 138— 139 °С. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

Метанол (фирма Merck, марка «Uvasob). Очищают и хранят, как ацетонитрил. /кип 64 °С.

А-Метилморфолин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Очищают, как N-этилморфолин. /кип 115—116 °С. Хранят в ампулах под азотом при -20 °С.

Пиридин (фирма Merck, марка «для анализа»). Перегоняют последовательно над едким кали, нингидрином и вновь над едким кали. гкип 114— 116°С. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

12.2. МАТЕРИАЛЫ

377

Толуол (фирма Merck, марка «для анализа»). Очищают, как ацетон, перегоняют над CaS04-0,5^0 (прокаленным при 500 °С непосредственно перед использованием). /Кип ПО—111 °С. Хранят над молекулярными ситами, как ацетон.

Триэтиламин (фирма Merck, марка «для синтеза»). Перегоняют над фталевым ангидридом. /кип 89 °С. Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

Триэтилентетрамин (фирма Fluka, марка «для практики»). Очищают, как триэтиламин, перегоняют при пониженном давлении (водоструйный насос). Хранят в ампулах под азотом при —20 °С.

Трифтороуксусная кислота (ТФУ) (фирма Fluka, марка «ч.»). Перегоняют над CaSO4*0,5H2O (прокаленным при 500 °С непосредственно перед использованием) с колонкой, заполненной стеклянными кольцами. tKlin 72—73 °С. Хранят порциями по 50 мл в колбах со стеклянными пробками под азотом при —20 °С.

Вода. Дважды перегоняют в стеклянном приборе. Используют свеже-перегнанной.

12.2.2. Реагенты

Метилизотиоцианат (МИТЦ) (фирма Fluka, марка «х. ч.») и фенилизотио-цианат (ФИТЦ) (фирма Fluka, марка «х. ч.»). Перегоняют в вакууме (масляный насос) под азотом, собирают фракцию, кипящую при 4 °С. Хранят в виде небольших порций в ампулах при —20 °С.

п-Фенилендиизотиоцианат (ДИТЦ) (фирма Eastman). Если реактив окрашен в желтый цвет, его перекристаллизовывают из кипящего ацетона: 2 г ДИТЦ растворяют в 10 мл ацетона и медленно охлаждают. Выход 1,55 г (игольчатые кристаллы, дающие прозрачный бесцветный раствор в ДМФА). *пл 129—131 °С.

4-М\Ы-Диметиламиноазобензол-4'f-изотиоцианат (ДАБИТЦ) (фирма Fluka или Pierce). Перекристаллизовывают из ацетона: 1 г ДАБИТЦ растворяют в 70 мл кипящего ацетона, фильтруют через бумажный фильтр и медленно охлаждают. Выход ~0,7 г оранжево-красных или коричневых игольчатых кристаллов. tnR 169—170 °С.

1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид • НС1 (ЭКД) фирма Serva). /„л 112—115 °С.

З-Аминопропилтриэтоксисилан (фирма Pierce)

№-$-Аминоэтил-(3-аминопропил) триметоксисилан (фирма Pierce).

12.2.3. Стеклянные шарики для разбавления навески полимеров

Шарики для кипячения с обратным холодильником (Kristall Dragon Werk, фирма Georg Wild, № 31/18) и стеклянные шарики 200—235 меш (Micro-beads фирма Division of Cataphote Corp.). Шарики промывают петролейным эфиром, затем ~2 ч нагревают в концентрированной соляной кислоте для удаления примесей ионов металлов; тщательно промывают на стеклянном фильтре водой и метанолом, сушат при 100 °С.

Коммерчески доступны отмытые кислотой, силанизированные триметил-хлоросиланом шарики (фирма Pierce). Считается, что их применение обеспечивает лучшие скорости потока жидкости через колонку. Однако часто используются и несиланизированные частицы.

12.2.4. Носители

Шарики полистирола (сополимер стирола с 1 % дивинилбензола) (марка Biobeads S-XI, minus 400 меш, фирма BioRad Laboratories). Непосредственно перед использованием их несколько раз промывают бензолом, хлоро-

378

12. МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНОГО АНАЛИЗА

формой, диоксаном, метанолом. Хранят при 4 °С. (Марка Biobeads S-XI,. 200—400 меш, хлорометированный, фирма BioRad Laboratories.)

Аминополистирол (АПС) и триэтилентетраминполистирол (ТЭТА-полисти-рол) (фирма Pierce). Поскольку качество коммерческих образцов носителей может меняться, а их устойчивость на воздухе ограниченна, рекомендуется синтезировать эти смолы из полистирола, как указано ниже, и хранить их под азотом в ампулах при —20 °С.

Стекло с контролируемым размером пор Corning CPG-10, 200—400 меш (фирмы Electronucleonics, Serva, Pierce, Machery-Nagel). Доступны стекла CPG с различными размерами частиц и пор. Чаще всего используют шарики с диаметром 40—80 мкм (200—400 меш) с номинальным диаметром пор 75 А. В последнее время стали использовать частицы с большим диаметром пор (85—240 А). Считается, что к частицам с большим диаметром пор лучше присоединяются объекты с большой длиной полипептидной цепи (белки) [41]. Однако наш опыт не подтверждает это мнение.

З-Аминопропильное стекло (АПС), 10/75, 200—400 меш (фирма Pierce) и $^-Аминоэтил-(3-аминопропил)стекло($-АПС), 200—400 меш (фирма Pierce). Следует использовать только бесцветные АПС или р-АПС. Образцы стекол нашего собственного изготовления (см. ниже) дают более воспроизводимые результаты и лучшие выходы присоединения полппептидов.

12.2.5, Буферы для присоединения

Буфер М 1. N-метилморфолин — ТФУ, рН 9,5. Смешать 5 мл N-метилмор-фолина и 5 мл воды; рН раствора 11,4. Добавить 4 капли ТФУ, доведя рН до 9,5. Использовать свежеприготовленный буфер, хранить под азотом.

Буфер М 2. Пиридин — соляная кислота, рН 5,0. К 80 мл воды добавить 8 мл пиридина, затем 5,3 мл 32%-ной соляной кислоты и довести водой до конечного объема 100 мл (рН 5,0). Хранить под азотом.

Буфер № 3 (безводный). ДМФА — триэтиламин. К 200 мл ДМФА добавить 2 мл триэтиламина. Присоединение проводят также в безводном ДМФА, но без добавления триэтиламина (см. присоединение по карбоксилу).

Буфер А5 4. Бикарбоиатный, рН 9,0- 0,1 М бикарбонат натрия доводят до рН 9,0 1 М едким натром; буфер содержит 10% (об./об.) 2-пропаиол-амина.

12.2.6. Растворы реагентов и буферов для секвенатора

Следует использовать реагенты и растворители, очищенные, как изложена выше.

Буфер № 1 для реакции конденсации: пиридин — N-метилморфолин — трифтороуксусная кислота. 28 мл N-метилморфолина растворяют в 190 мл воды, добавляют 3,75 мл ТФУ, доводят водой до объема 200 мл; рН полученного раствора 8,1. К этому буферу добавляют пиридин в соотношении (2:3), после чего рН конечного раствора 7,9. Следует использовать свежеприготовленный буфер, хранить под азотом.

Буфер Л§ 2 для реакции конденсации (безводный): ДМФА — триэтиламин. К 97,5 мл ДМФА добавить 2,5 мл триэтиламина.

Буфер А§ 3 для реакции конденсации (при анализе на микроуровне с использованием ДАБИТЦ — ФИТЦ): пиридин — N-этилморфолин — трифтороуксусная кислота— ДМФА. В 22,5 мл воды под азотом растворить 4,5" мл N-этилморфолпна. Добавить несколько капель ТФУ, затем воду до объема 30 мл (рН полученного раствора 9,1). К 10 мл этого буфера добавить 20 мл ДМФА и 20 мл пиридина, дегазировать. Хранить под азотом.

12.3. СИНТЕЗ СМОЛ

379

Раствор метилизотиоционата (МИТЦ) в ацето нитриле. Растворить 1 г М

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
москва можно ли взять ноутбук напрокат
купить табличку огнеопасно газ белгород
купить комплект звездное небо в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.02.2017)