химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

, Biochem. J., 159, 177—180 (1976).

55. Roy D., Konigsberg W., Methods Enzvmol, 25, 221—231 (1972).

56. Savige W. E., Fontana A., Methods Enzymol, 47, 459—469 (1977).

57. Schaffer AL H.f Stark G, Biochem. Biophvs. Res. Commun., 71, 1040— 1047 (1976).

58. Schroeder W. A., Methods Enzymol, 11, 351—361 (1967).

59. Schroeder W. A, Methods Enzvmol, 11, 445—461 (1967).

60. Schroeder W. A., Methods Enzvmol, 25, 203—213 (1972).

61. Schroeder W. A\, Methods Enzymol, 25, 298—313 (1972).

62. Schroeder W. A., Shelton F В.. Shelton /. R.y Arch. Biochem. Biophys., 130, 551—556 (1964).

63. Shechter Y., Burstein Y., Patchomik Л., Biochemistry, 14, 4497—4503 (1975).

64. Shechter Y., Patchomik A., Burstein K, Biochemistry, 15, 5057—5075 (1976).

65. Shipolini R. A., Callewaert G. L., Cottrell R. C., Vernon С. Л., Eur. J. Biochem., 48, 465—476 (1974).

66. Shotton D. AL, Hartley B. S., Biochem. J., 131, 643—675 (1973).

67. Smyth D. C, Methods Enzymol, 11, 214—231 (1967).

68. Smyth D. S., Utsumi 5., Nature (Lond.), 216, 332—335 (1967).

69. Smyth F). G., Stein W. H., Moore S., J. Biol. Chem., 238, 227—234 (1963).

70. Stark G. R., Methods Enzymol, 47, 129—132 (1977).

71. Steinman IF AL, Naik V. R., Aberneiht; F F., Hill R. L.t J. Biol Chem., 249, 7326—7338 (1974).

72. Swallow D. L., Abraham E. P., Biochem. J„ 70, 364—373 (19o8).

73. Tang F, Hartley B. S.y Biochem. J., 102, 593—599 (1967).

74. Udenfriend S., Stein S.r Bohlen P., Dairman W.t Feimgruber W.f Weigele M., Science, 178, 871—872 (1972).

75. Uphaus R. A., Grossveiner L. F, Kaiz F /., Science, 129, 641—643 (1959).

76. Wade Af., Laursen R. A., Miller D. L, FEBS Lett., 53, 37—39 (1975).

77. Waley S. G., Watson Biochem. J., 55, 328—337 (1953).

78. Weeds A. G„ Hartley B. S., J. Mol. Biol, 24, 307—311 (1967).

79. Weeds A. G., Hartley B. S., Biochem. J., 107, 531—548 (1968).

Глава 11

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПЕПТИДОВ ПО МЕТОДУ ЭДМАНА С ИДЕНТИФИКАЦИЕЙ ДАНСИЛАМИНОКИСЛОТ

Г. УИИТЕР (G. WINTER, MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge, CB2 2QH, U.K.)

11.1. Введение

Да пси л хлорид (1-дн мстила мшю-5-иафталинсульфохл op ид) реагирует с а-аминогрупиоп пептида (и с боковыми группами остатков цистеина, тирозина, лизина и гистидина) с образованием дапсильпого производного пептида (Д НС-пептид а). При кислотном гидролизе модифицированного таким образом пен-1пда его N-копцевоп остаток отщепляется в виде флуоресцирующей дансиламипокислоты, которая легко может быть идентифицирована хроматографией на полиамидных пластинках [5]. В условиях гидролиза полностью разрушаются дансильные производные триптофана и амидов дикарбоновых аминокислот и частично дансилпролин и дансилсерин; из производных, образующихся по боковым группам, сохраняются лишь е-дансиллп-зип и О-дапсил i ирозип.

При определении аминокислотной последовательности по дапсилыюй методике [6, 7] после каждого цикла отщепления по Эдману N-копцевой остаток укороченного пептида анализируется с помощью дапсилировапия небольшой пробы образца. Эта методика выгодно отличается от собственно метода Эдмана и его ДАБИТЦ — ФИТЦ-модификации [1] отсутствием промывок фенилтиокарбамилнептндов после стадии конденсации, что исключает возможные потери пептидов (особенно неполярных) за счет растворения в органической фазе. Постепенное уменьшение количества анализируемого материала (в результате отбора па дапсилировапие) компенсируется более высокой чувствительностью определения флуоресцирующих производных аминокислот.

11.2. Дансилирование

Введение даненльной метки в непротонироваиную а-аминогруп-пу пептида (рис. 11.1) проводят в щелочной среде в смешанном водно-органическом растворителе (органический компонент для растворения дансилхлорида). В этих условиях конкурируют два процесса — дансилирование и гидролиз дансилхлорида —

11.2. дансилирование

367

NMe: NMc,

«>-+г I1 : цля > |! R

¦Г г

SO.fl SO.NH (Г

II Хтдролиз

Г 4 А

' О f

so;

PI 1С, 11.1. Дансилирование аминокислоты и конкурирующий гидролиз дансилхлорида до дансиловой кислоты.

и степень модификации пептида определяется соотношением скоростей протекания этих процессов. Гидролиз дансилхлорида катализируется пиридином [4], в то время как триэтиламин ускоряет и реакцию конденсации, и гидролиз, поэтому из среды рекомендуется полностью удалять соли пиридина (образующиеся после реакции Эдмаиа или элюирования пептидов с бумаги) тщательным высушиванием образца в присутствии триэтилами-па. Таким же образом освобождаются от следовых количеств солей аммония (привносимых с соответствующими буферами), которые реагируют с дансилхлоридом с образованием дансил-амида. Использование триэтиламипа сопровождается образованием еще одного дансилыюго производного (возможно, из-за присутствия в триэтиламиие первичных и вторичных аминов), но на полиамидных пластинках пятна этих соединений мигрируют в растворителе 2 выше дапсилпролииа (рис. 11.2).

Модифицированные пептиды гидролизуют 6 М НО при 100°С (5—15 ч) или смесью равных объемов копц. НС1 и про-пионовой кислоты при 165°С (12 мин) (G. Winter, неопубликованные данные). При гидролизе под действием 6 М НС1 в течение 5 ч минимальны потери дапсилпролииа и дансилсерина, по не полностью расщепляются пептидные связи остатков дан-силвалина и дансилизолейцина с другими аминокислотами (особенно с валипом и изоленципом). Образующиеся при этом дансилдипептпды на хроматограмме могут быть ошибочно приняты за даисиламииокислоты. Положения пятен "некоторых из таких производных показаны па рис. 11.2.

На хроматограмме дапсилдипептиды располагаются приблизительно па линии, соединяющей положения дапсильных производных, входящих в состав дипептида аминокислот. Правильность идентификации аномального пятна как дансилыюго производного дипептида может быть проверена с помощью более продолжительного гидролиза (>24 ч). При гидролизе смесью

-Q

с:

CX О CD

>V-P

I

I-L,V-IVV-L,F V-FI-F©(

l8 *

T-I.T-L

V-V

>flHC-NH2

V-A

6 -v-G

1-Е

дно oh

nh,

+ 4

c; CL О cC f-

o

«3 CL

I-L .V-LV-L

растворитель 1

V-G

e9

V-D

дне- он

растворитель 1

РИС. 11.2. Ориентировочное расположение пятен некоторых дансилдипептидов (заштрихованные пятна) относительно пятен ДНС-аминокислот-маркеров (темные пятна). Обозначения аминокислот даны в од-нобуквенпом коде, а — после растворителей / и 2; б—после растворителей /, 2 и 3. ДНС-011 — дан-силовая кислота, ДНС-NHq—амид дансиловой кислош.

11.2. ДАНСИЛИРОВАНИЕ

369

HCI — пропиоповая кислота возрастают степень расщепления дансилпролина и дансилсерина и вероятность обнаружения на хроматограмме дансилдипептидов, однако при этом практически не происходит окисления дансилметионина, как при гидролизе в 6 М HCI (G. Winter, неопубликованные данные).

Деструкция дансилтриптофана в условиях кислотного гидролиза может быть сведена к минимуму добавлением к 6 М НС1 1% триптамина; дансилтриптофан может быть отщеплен также с помощью химотрипсина, однако это применимо лишь в частных случаях и требует для идентификации до 5 нмоля вещества. Различия между амидными и карбоксильными группами боковых цепей могут быть установлены электрофоретическим анализом пептида при рН 6,5 до и после отщепления по Эдману остатков Asx и GIx.

П.2.1. Методика дансилирования

1. Растворяют пептид в небольшом объеме 1%-ного водного триэтиламина (фирма Pierce, «для секвенирования»). Небольшую аликвоту (—1 мкл, 0,5 нмоль) с помощью калиброванной микропипетки (1—5 мкл) переносят на дно ампулы (при необходимости центрифугируют, чтобы жидкость стекла со стенок). Ампулы для дансилирования (4x50 мм) вытягивают из стеклянных трубок, так чтобы дно их было коническим, и перед употреблением прокаливают в течение ночи при 500—600 °С (гл. 8).

2. Высушивают образец, добавляют 3 мкл раствора бикарбоната натрия (0,2 М) и 3 мкл раствора дансилхлорида (5 мг в 1 мл сухого ацетона), закрывают ампулу парафильмом.

3. Инкубируют 30 мин при 50 °С; контроль по исчезновению желтой окраски дансилхлорида.

4. Высушивают на масляном насосе над гидроксидом натрия.

5. Добавляют 5 мкл 6 М НС1. Пептиды с ожидаемыми N-концевыми остатками карбоксиметилцистеина запаивают в вакууме, а триптофана — в присутствии 1%-ного триптамина и инкубируют при 100°С в течение 6 ч. В альтернативном варианте добавляют 10 мкл смеси конц. НС1 — пропионовая кислота (1:1) и выдерживают при 165°С 12 мин.

6. Открывают ампулу (если необходимо, центрифугируют, чтобы капли раствора опустились на дно) и высушивают в вакууме масляного насоса над гидроксидом натрия.

7. Проверяют гомогенность полиамидных пластинок (75 X Х75 мм или 50X50 мм, Cheng Chin Trading Co., Taiwan) при УФ-облучении.

8. Добавляют 3 мкл 95%-ного этанола к осадку гидролизата и с помощью капилляра наносят раствор на обе стороны пла-

24-7СЗ

370 И МЕТОД ЭДМАНА С ИДЕНТИФИКАЦИЕЙ ДАНСИЛАМИНОКИСЛОТ

стинки (максимальный диаметр пятна 1 мм). Пятна должны располагаться строго напротив друг друга на расстоянии 6 мм от двух краев. На одну сторону пластинки наносят 0,2 мкл растворов маркеров (0,1 мг/мл ДНС-Phe, ДНС-Рго, ДНС-Gly, ДНС-Glu, ДНС-Ser, ДНС-Arg).

9. Хроматографируют в двух направлениях, в каждом так, чтобы растворитель проходил 70% длины пластинки (10— 30 мин): в первом направлении в системе 1 (1,5%-пая муравьиная кислота) и после высушивания в токе теплого воздуха во втором направлении (перпендикулярно первому в системе 2 (бензол — уксусная кислота, 9:1). Высушивают и исследуют обе стороны хроматограммы при УФ-облучении. В этой системе растворителей разрешаются пятна всех даисиламинокислот, за исключением пар ДНС-Glu — ДНС-Asp, ДНС-Ser —ДНС-Thr, а также а-ДНС-Lys — е-ДНС-Lys — ДНС-Arg — ДНС-His. Пятно ДНС-Ala иногда перекрывается пятном дансиламида. Для разделения указанных даисиламинокислот используют системы растворителей 3 и 4. Систему 3 (этилацетат — метанол — уксусная кислота, 20:1:1) применяют в том же направлении, что и растворитель 2, для разделения ДНС-Glu — ДНС-Asp; ДНС-Ser — ДНС-Thr и улучшения разрешения ДНС-Ala и ДНС-1ЧН2 (рис. 11.3). Система 4 (0,05 М тринатрийфосфат — этанол, 3:1; хроматография в том же направлении, как и в системах 2 и 3) служит для разрешения пятен монозамещепных дансильных производных основных аминокислот. Однако четкая идентификация в этом случае не всегда возможна и требуется сравнение с соответствующими маркерами, нанесенными рядом.

10. Полиамидные пластинки могут быть использованы повторно после промывки смесью аммиак — ацетон (75 мл конц. аммиака+ 925 мл воды+ 10 мл ацетона) в течение 1 ч. Металлические держатели для пластинок не должны оставаться в промывном растворе, поскольку возможно образование продуктов коррозии, отлагающихся па пластинках и гасящих флуоресценцию дансильных производных. Перед употреблением качество промытых пластинок надо проверять под УФ-облучепием и пластинки, содержащие флуоресцирующие пятна, забраковывать.

11.3. Конденсация и расщепление по Эдману

Для успешного протекания реакции Эдмаиа (рис. 10.1) необходимо: использование чистых реагентов, исключение кислорода из реакционной среды, полное высушивание пептидов после стадий конденсации и расщепления. Реагенты должны быть свеже-перегнаиными [2], а реакционная смесь для конденсации — насыщена азотом. Образцы пептидов предварительно тщательно высушивают в нагреваемых в металлических блоках вакуумных эксикаторах.

CL О

ca h-u

a5 CL

Hse

+

ДНО ON

+

см

CD I-

CL О *й (-

о

03 CL

растворитель /

рте

Hse

P ^ ф • ДНОМИ2

vv

CMC

дне-OH

к

растворитель /

РИС. 11.3. Ориентировочное расположение пятен даисиламинокислот (заштрихованные пятна) относительно пятен маркеров (темные пятна). Hse — ДНС-гомосерин, У° — ДНС-Tyr, Ya0 — ди-ДНС-Tyr, К? — е-ДНС-Lys, Ка — а-ДНС-Lys, Кае — ди-ДНС-Lys, Картс — а-ДНС е-ФТК-Lys, CMC — ДНС-CMCys, ДНС-ОН-дансиловая кислота, ДНС-ЫН2 — амид дансиловой кислоты. Для других ДНС-аминокислот обозначения даны в однобуквенном коде.

372

11. МЕТОД ЭДМАНА С ИДЕНТИФИКАЦИЕЙ ДЛНСИЛАМИНОКИСЛОТ

Описываемая ниже методика безусловно уступает автоматическим методам как в скорости анализа (не более двух циклов расщепления в день для одного пептида), так и в выходах на стадиях, но она очень удобна для одновременного определения структуры нескольких коротких пептидов. В этом случае трудоемкий процесс насыщения азотом каждого образца в отдельности перед стадией конденсации можно усовершенствовать. Так, автор для этой цели использовал простую конструкцию— трубку с 20 ответвлениями-иглами от шприца (защищенными от коррозии тефлоновыми трубочками). Иглы расположены таким образом, что при опускании в латунный блок для нагревания входят в пробирки с образцами. Вместо завинчивающихся крышек пробирки плотно заклеивают липкой лентой, причем делают это одновременно, используя лист пленки (Perspex) с 20 лунками. Коммерчески доступно устройство, в котором осуществляется и температурный контроль за нагревом образцов в блоке (N-Evap фирмы Organomation).

Для процесса деградации по Эдману необходимы следующие реагенты (перегнанные или марки «для секвепирования») и оборудование: фенилизотиоционат (10%-ный раствор в пиридине, хранят в темноте при —20°С не более одной недели); водный пиридин (1:1, хранят в темноте); трифтороуксуспая кислота; этанол (95%-иый); «-бутилацетат, газообразный азот (в баллоне); пробирки (из пирекса), прокаленные при 500— 600°С; термостат с контролируемым нагревом, вакуум-эксикаторы и вакуумная линия к масляному насосу; эксикаторы с пеп-таоксидом фосфора и гидроксидом натрия (для сушки ФТК-пеп-тидов после стадии конденсации); еще один эксикатор с гидроксидом натрия (предназначен для сушки пептидов после стадии расщепления).

11.3.1. Деградация по Эдману. Методика

1. Фенилизотиоцианат, пиридин и трифтороуксусную кислоту хранят в плот-нозакрытых сосудах под азотом (насыщение азотом надо повторять до и после использования этих реактивов).

2. 20—50 нмоль пептида высушивают досуха (образец не должен содержать солей).

3. Добавляют 100 мкл 50%-ного пиридина п «продувают» азотом (1 мин).

4. Добавляют 50 мкл 10%-ного ФИТЦ в пиридине и вновь «продувают» азотом (1 мин).

5. Ампулу закрывают и инкубируют в блоке для нагревания при 50 °С (30 мин).

6. Вакуум-эксикатор с пентаоксидом фосфора и гидроксидом натрия помещают в термостат (60 °С).

7. Эксикатор вынимают из термостата и подключают к вакуумной линии для высушивания пептидов.

11.3. КОНДЕНСАЦИЯ И РАСЩЕПЛЕНИЕ

373

8. Через 10 мин проверяют, образовался ли твердый осадок (из смеси ФТК-пептида и дифенилтиомочевины) розоватого цвета, если в остатке масло, то добавляют 50 мкл 95%-ного этанола и повторяют операцию высушивания.

9. Осадок растворяют в 50 мкл безводной трифтороуксусной кислоты, закрывают пробирку и инкубируют 15 мин при 50 °С. Если ожидается после расщепления образование N-концевого остатка глутамина, то инкубацию ведут 5 мин (при этом уменьшается вероятность циклизации

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
цены на гироскутеры
переворачивающая рамка на номер
световые короба со светодиодной подсветкой
аренда ячеек для вещей

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.03.2017)