химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

тверждены дополнительными данными. Если же структура установлена почти полностью, то вероятность конкурирующей последовательности для «неубедительного» перекрытия снижается и пептиды могут быть ориентировочно размещены по цепи. Стратегия

10.8. МЕТОДИКИ

361

и выбора рациональной схемы фракционирования пептидов. Например, по данным аминокислотного анализа белок содержит 15 остатков аргинина, однако при фракционировании триптического гидролизата на двумерной карте после обработки фенантренхиноном [80] обнаружено только 5 флуоресцентных пятен. Это свидетельствует или о том, что в нерастворимом коре остались нерасщепленными 10 остатков аргинина, или о том, что при гидролизе образовалось 10 крупных нерастворимых пептидов которые задержались на старте. Одна пептидная карта может быть последовательно окрашена флуорескамином [7, 74] фенантренхиноном (остатки аргинина) [80] и, наконец, реагентом Паули (остатки гистидина и тирозина) [17]. Если белок предварительно окислен надмуравьиной кислотой, то трипто-фансодержащие пептиды обнаруживаются по флуоресценции при осмотре хроматограммы под ультрафиолетовой лампой до опрыскивания флуорескамином (разд. 8.14).

Оптимальные условия для разделения растворимых пептидов конкретного белка могут быть определены только экспериментально. Однако чаще всего и успешно используется следующая последовательность операций: электрофорез при рН 6,5, а затем хроматография в БУВП с последующим разделением полосы нейтральных пептидов при рН 2,1 или 3,5 [7]. Гидролизуют 10—20 нмоль белка, лиофилизуют для удаления солей. Растворяют в небольшом объеме 98%-ной муравьиной кислоты, разбавляют до 50%-ной концентрации и наносят в виде полосы шириной 1 см на бумагу ватман 3 ММ для электрофореза при рН 6,5 (табл. 10.4). Полосу нейтральных пептидов вырезают и подшивают к старту листа бумаги ватман 3 ММ для хроматографии в системе БУВП. Подобным же образом поступают с полосами кислых и основных пептидов. После хроматографии вновь вырезают нейтральную полосу и подшивают ее к листу бумаги ватман 3 ММ для заключительного электрофореза при рН 2,1 или 3,5.

Аналитические пептидные карты служат также для контроля процесса элюирования пептидов с колонки и последующего объединения фракций. Для этого небольшие порции (5 нмоль пептида) чередующихся фракций высушивают досуха, вновь растворяют в 50 мкл электрофоретического буфера (рН 6,5), наносят в виде прилегающих друг к другу полосок (1 см) на лист бумаги ватман № 1. После электрофореза полосу нейтральных пептидов вырезают, пришивают к другому листу бумаги и проводят электрофорез при рН 2,1. Кислые, основные и нейтральные пептиды окрашивают на картах флуорескамином, фенантренхиноном и реактивом Паули.

10.8.2. Препаративные электрофорез и хроматография на бумаге

Разделение относительно простой смеси пептидов, такой, например, как объединенная фракция кислых пептидов с ДЭАЭ-целлюлозы, может быть осуществлено однократной хроматографией на бумаге. Для фракционирования более сложных смесей («хвостовые» фракции с колонки с сефадексом G-50) может потребоваться применение нескольких методов, последовательность которых лучше всего выбирать после проведения аналитического электрофореза при рН 6,5 с последующим фракционированием нейтральной полосы при рН 2,1. Сложная смесь нейтральных пептидов, как правило, лучше разделяется в условиях хроматографии в системе БУВП, тем не менее часто предпочитают электрофорез из-за большей компактности образующихся полос. Кроме того, примеси, элюирующиеся с бумаги после хроматографии в БУВП, могут катализировать деструкцию остатков тирозина во время кислотного гидролиза пептида (во избежание которой добавляют 0,1% фенола к 6 М HCI) и препятствовать полноте протекания реакции дансилнрования (для удаления примесей пептиды экстрагируются бутила-цетатом). Эти осложнения можно устранить, применяя хроматографию на первой стадии разделения. Заключительную стадию очистки пептида реко-

362 10. ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

Таблица 10.6. Маркеры для электрофореза

Маркеры

Способ приготовления

Ксилолцианол FF и оранжевый G (красители)

Дансил-Arg-Arg, дан-сил-Arg и дансиловая кислота (флуорохромы)

Смесь аминокислот

Растворяют 500 мг красителя в 10 мл воды

Растворяют 17,4 мг аргинина и 47,4 мг аргинил-аргинина в 10 мл 0,5 М NaHC03; добавляют 80 мг дансилхлорида в 10 мл ацетона и инкубируют в запаянной пробирке 2 ч при 37°С; хранят при 4 °С

Готовят смесь следующих аминокислот (по 1 мг): Суа, Leu, Phe, Pro, Туг, Val, Arg, Lys; 2) Asp, Gin, Ala, Gly, lie, Ser, Thr, His; каждый набор аминокислот доводят до 1 мл раствором 1 мМ НС1; раствор хранят при 4°С

мепдуется проводить на бумаге ватман № 1, поскольку уровень свободных аминокислот на ней ннже, чем на бумаге ватман 3 ММ-

Пептиды растворяют в буфере рН 6,5 (табл. 10.4) и наносят вдоль липни старта (полосой). Нерастворимые пептиды после высушивания растворяют в небольшом объеме 98%-ной муравьиной или уксусной кислоты, затем разбавляют водой до 50%-ной концентрации и наносят на бумагу. В процессе нанесения раствор высушивают теплым воздухом (с помощью фена), при этом надо соблюдать осторожность, поскольку при перегревании возможно окисление остатков метионина, приводящее к образованию нескольких форм одного пептида (с разными значениями Rf при хроматографии). При электрофорезе между образцами пептидов наносят флуоресцентные маркеры (табл. 10.6), а в углы листа бумаги — красители. Полезно использовать в качестве «свидетелей» смесь аминокислот, особенно если для проявления электрофореграммы используется окрашивание нингидрином. В хроматографии маркером служит положение фронта растворителя.

10.8.2.1. Одномерное разделение. Смесь нескольких пептидов (каждого < 1 мкмоль) растворяют в 0,5 мл буфера (рН 6,5) и наносят в виде полосы 15 см на лист бумаги ватман № 1. Опрыскивают электрофоре-грамму флуорескамином и окрашивают боковую полосу нингидрином.

10.8.2.2. Двумерное разделение. Смесь пептидов (каждого <1 мкмоль) растворяют в 1 мл буфера (рН 6,5) и наносят в виде полосы в 15 см на бумагу ватман 3 ММ. Проведя электрофорез или хроматографию в первом направлении, опрыскивают флуорескамином, боковую полосу бумаги окрашивают нингидрином и фенантренхиноном. Вырезают пептидные и промежуточные полосы и «пришивают» их к бумаге ватман № 1. Промежуточные полосы также анализируют, поскольку они могут содержать уникальные пептиды, образовавшиеся с низким выходом, которые замаскированы другими пептидами в основной полосе.

Проводят электрофорез во втором направлении и проявляют электро-фореграмму. Если в первом направлении использовалась хроматография, то перед электрофорезом во втором направлении широкие пептидные полосы можно сконцентрировать осторожным смачиванием листа бумаги.

Если в смеси находится <500 нмоль каждого пептида, то ее растворяют в 0,5 мл буфера (рН 6.5) и наносят на бумагу ватман 3 ММ полосой в 5 см. Дальнейшие процедуры аналогичны вышеописанным.

10.8. МЕТОДИКИ

363

10.8.2.3. Двумерное разделение, дополненное трехмерным разделением нейтральных пептидов. Смесь пептидов (каждого <500 нмоль) растворяют в 0,5 мл буфера (рН 6,5), наносят полосой в 5 см на бумагу ватман 3 ММ. После электрофореза при рН 6,5 вырезают полосу нейтральных пептидов, «подшивают» ее к листу бумаги ватман 3 ММ и хроматографи-руют в системе БУВП. Вновь вырезают с хроматограммы нейтральную полосу, «пришивают» ее к листу бумаги ватман № 1 и проводят заключительный электрофорез. Полосы кислых и основных пептидов «подшивают» к бумаге ватман Л» 1 для электрофореза во втором направлении.

10.8.3. Окрашивание пептидов

Высушенный после электрофореза или хроматографии лист бумаги исследуют в ультрафиолетовом свете для локализации флуоресцентных пятен (окисленные остатки триптофана). Пептиды затем проявляют обработкой флуорескамином [74] и/или реагентом нингидрпн — ацетат кадмия [28].

Окрашивание флуорескамином делает возможным последующее препаративное элюирование пептидов с двумерных карт на бумаге и позволяет контролировать правильность вырезания полос после одномерного разделения (обычно хроматографией в БУВП). Проявление нингидрином (боковой полосы) уступает по чувствительности флуорескамину и иногда не обнаруживает пептидов с N-концевыми остатками 11с и Val, но оно более достоверно, поскольку интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству пептида. В отличие от флуорескамина нингидрин окрашивает пептиды с N-концевыми остатками пролина. С помощью этого реагента можно до известной степени даже дифференцировать N-концевые аминокислотные остатки по образующемуся цвету пятна: красному для большинства аминокислот, желтому для Gly и Ser и оранжевому, переходящему постепенно в красный, для Asn и Суа. Совместное применение флуорескамина, нингидрина и цветных реакций на определенные аминокислоты помогает точно локализовать пептид в сложных смесях при одномерном разделении.

10.8.3.1. Окрашивание флуорескамином. Флуорескамин хранят в виде раствора в безводном ацетоне с концентрацией 0,1 мг/мл. Перед употреблением 1 мл этого раствора добавляют к 100 мл 1%-ного (об./об.) пиридина в ацетоне. Бумагу погружают в раствор и затем высушивают в потоке теплого (или комнатной температуры) воздуха. Если после осмотра хроматограммы под ультрафиолетовой лампой не появились флуоресцирующие пятна, процедуру повторяют, увеличив концентрацию флуорескамина (2 мл исходного раствора на 100 мл пиридина).

10.2.3.2, Окрашивание реагентом нингидрин — ацетат кадмия. Нингидрин хранят в виде 0,25% -ного (масс/об) раствора в ацетоне, а ацетат кадмия — в водной уксусной кислоте (1 г Cd(CH3C00)2-2H20— 50 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл воды). Бумагу погружают в смесь, приготовленную из 100 мл раствора нингидрина и 15 мл раствора ацетата кадмия, сушат при комнатной температуре и затем нагревают при 100 °С в течение 3 мин. После проявления окраски оставляют хроматограмму на ночь под тягой для развития окраски и проявления медленно реагирующих пептидов.

10.8.4. Элюирование пептидов

Каждую из вырезанных полос обрезают с одной стороны для придания остроконечной формы. Прямоугольный конец бумаги опускают в камеру, заполненную элюирующим буфером (прижимают полосу покровным стек-

364 Ю- ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

лом от микроскопа). Заостренный конец полосы подводят к пробирке, всю систему покрывают колпаком для насыщения атмосферы буферным раствором. Движение буфера вниз по полосе происходит за счет капиллярных сил. Для элюирования основных пептидов используют 25—50%-ную уксусную кислоту, все остальные пептиды элюируют 10—20%-ным пиридином; с каждой полосы собирают ~200 мкл раствора. Высушивают фракции в вакууме масляного насоса над NaOH (для уксусной кислоты) или Р205 (для водного пиридина). Процесс проходит очень быстро, если пробирку поместить в нагреваемый (40 °С) металлический блок.

Литература

1. Adelstein R. S., Kuehl W. AL, Biochemistry, 9, 1355—1364 (1970).

2. Ambler R. P., Biochem. J., 96, 32P (1965).

3. Artavanis S., TIM from B. stearothermophiltts. Ph. D. Thesis, University of Cambridge, 1974.

4. Blomback B.y Methods Enzymol., 11, 398—411 (1967).

5. Bornstein P., Biochemistry, 9, 2408—2421 (1970).

6. Bornstein P., Balian G\, J. Biol. Chem., 245, 4854—4856 (1970).

7. Bruton C. A, Biochem. J., 147, 191 — 192 (1975).

8. Butler P. J. G„ Hartley B. S., Methods Enzymol., 25, 191 — 199 (1972).

9 Chang /. Y.f Brauer D., Wittmann-Liebold 5., FEBS Lett., 93, 205—214 (1978).

10. Corradin G.f Harbury H. A., Biochim. Biophys. Acta, 221, 489—496 (1970).

11. Degani Y.t Patchornik A., Biochemistry, 13, 1 — 11 (1974).

12. Doolittle R. F.t Methods Enzymol., 25, 231—244 (1972).

13. Doonan S,, Doonan H. F, Hanford R., Vernon C. A., Walker F AL, Airol-di L. P. da S., Bossa F., Barra D.} Carloni Af., Fasella P., Riva F.y Biochem. J., 149, 497—506 (1975).

14. Doyen N., Lapresle C, Biochem. J., 177, 251—254 (1979).

15. Drapeau G. R.t Methods Enzvmol., 47, 189—191 (1977).

16. Drapeau G. R., Boily "Houmard J. Biol. Chem., 247, 6720—6726 (1972).

17. Haslet/ C. W„ Zegers B. F Af., Vijlder M. D. de., Biochim. Biophys. Acta, 175, 211-213 (1969).

18. Edelman G. AL, Gall W. E.t Wuxdal AL Konigsberg W. H.y Biochemistry, 7, 1950—1958 (1968).

19. Edman P., Arch. Biochem. Biophys., 22, 475—476 (1949).

20. Edman P.y In: Protein Sequence Determination, Needieman S. B. (Ed.), Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1970, pp. 211—255.

21. Edman P., Begg G.y Eur. J. Biochem., 1, 80—91 (1967),

22. Greene L. Barteit D. C, Methods Enzymol., 47, 170—174 (1977).

23. Gross Methods Enzymol, 11, 238—255 (1967).

24. Harris J. /., Nature (Lond.). 177, 471—473 (1956).

25. Hartley B. S., In: Structure and Activity of Enzymes, Goodwin T. W., Harris J. I., Hartley B. S. (Eds.), Academic Press, New York, 1964, p. 47.

26. Hartley B. 5., Biochem. J., 119, 805—822 (1970).

27. Hartley B. S„ Shotton D. Af., I in: The Enzymes, Boyer P. D. (Ed.), 3rd edn,

vol. 3, Academic Press, New York, 1971, p. 323.

28. Heilmann J.t Barrollier J., Waizke E., Hoppe-Seyl. Z. Physiol. Chem., 309,

219—220 (1957).

29. Heinrikson R. L., Methods Enzymol., 47, 175—189 (1977).

30. Hirs С. #. W.y Methods Enzvmol, 11, 197—199 (1967).

31. Hirs С. tf. IF., Methods Enzymol, 11, 199—203 (1967).

32. Houmard J.t Drapeau G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 3506—3509 (1972).

33. Use D.} Edman A, Aust. J. Chem., 16, 411—416 (1963).

34. Jornvall H.} Eur. J. Biochem., 16, 25—40 (1970).

ЛИТЕРАТУРА

365

35. Jornvall Н., Abstr. Int. Cong. Biochem. 9th, Colloquium D, Abstract Db, 13, 1973, p. 454.

36. Karlsson F. A., Peterson P. A., Berggard /., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,

64, 1257—1263 (1969).

37. Konigsberg W., Methods Enzymol,, 25, 185—188 (1972).

38. Konigsberg 1Г. //., Steinman IF AL, In: The Proteins, Neurath II, Hill R. L. (Eds.), 3rd edn., vol. 3, Academic Press, New York, London, 1977, p. 54.

39. Kopple K. D., Bdchli J. Org. Chem., 24, 2053—2055 (1959).

40. Lowey S., Slm/ter IF S., Weeds A. G., Baker H., J. Mol. Biol, 42, 1—29 (1969).

41. Matsubara /¦/., Methods Enzvmol, 19, 642—651 (1970).

42. Matsubara IF, Feder /., In: The Enzymes, Boyer P. D. (Ed.), 3rd edn., vol 3, Academic Press, London, 1971, p. 721.

43. Mitchell W. AL, Methods Enzvmol, 47, 165—170 (1977).

44. Morris IF R., Williams D. IF, Ambler R. P.y Biochem. J., 125, 189 (1971).

45. Mutt V.t Said S. /., Eur. J. Biochem., 42, 581—589 (1974).

46. Offord R. Nature (Loud.), 211, 591—593 (1966).

47. Ozols I., Gerard C, J. Biol. Chem., 252, 5986—5989 (1977).

48. Patthy L.t Smith E. F., J. Biol Chem., 250, 565—569 (1975).

49. Perham R. A., Biochem. J., 105, 1203—1207 (1967).

50. Piszkiewicz D,, Landon, AL, Smith E. F., Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 1173—1178 (1970).

51. Piatt Т., Files F G.. Weber K., J. Biol Chem., 248, 110—121 (1973).

52. Porter R. Nature (Loud.), 182, 670—671 (1958).

53. Press E. AL, Biochem. J., 104, 30c—33c (1967).

54. Price A. C

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
2MT24ES
благотворительные учреждения
наклейка на авто видео старушки
ремонт мелких вмятин на авто в смоленске

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2017)