химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

аствором.

Небольшие порции каждой из полученных фракций анализируют методом высоковольтного электрофореза на бумаге, у «условно чистых» пептидов определяют N-концевую аминокислоту и иногда частичную аминокислотную последовательность по методу Эдмана в дапсильном варианте (гл. 11). Из фракций, содержащих гомогенные по всем показателям пептиды, отбирают аликвоты на аминокислотный анализ, после чего их лиофилизуют. Крупные пептиды (20—50 остатков), даже чистые, часто проявляются на электрофореграммах в виде диффузных полос в отличие от небольших фрагментов, получающихся при их гидролизе, образующих четкие зоны при электрофорезе. Это позволяет при повторной фрагментации небольшой порции материала из «условно чистых» пиков хроматограммы обнаружить с помощью электрофореза наличие в них минорных компонент, не регистрируемых другим путем. Крупные пептиды, загрязненные примесями, могут быть успешно очищены па ДЭАЭ-целлюлозе, хотя выходы при этом бывают довольно низкими. Поскольку для установления или контроля аминокислотной последовательности крупного пептида, как правило, необходимо проведение дополнительного гидролиза, целесообразно две трети очищенного материала оставить для этих целей. Даже

23—703

Таблица 10.5. Ионообменные колонки

Общие указания

Дауэкс-50

ДЭАЭ-целлголоза

Приготов- Промывают in situ 1 М NaOH, лсние смолы 1 М НС1 и буфером с рН 5,0 (2 М пиридин: 645 мл пиридина 4- 573 мл ледяной уксусной кислоты -f- вода до общего объема 4 л). После проверки на отсутствие Na+ в элюенте (по окрашиванию пламени) промывают буфером рН 3,1 (0,2 М пиридин: 64,5 мл пиридина-}-1114 мл ледяной уксусной кислоты -ь вода до общего объема 4 л) до уравновешивания колонки

Обрабатывают на воронке Бюхпера по прописи изготовителя (промывают 0,2 М NaOH, дистиллированной водой, 0,2 М IIC1 и снова дистиллированной водой). Оставляют на несколько часов в 10%-ном бикарбонате аммония. Промывают 0,1 %-иым бикарбонат ом аммония (рН 8,3) и заполняют колонку. Уравновешивают нопообмепннк в течение ночи прокачиванием того же буфера со скоростью 100 мл/ч

Тип колонки и размеры

Колонка высокого давления с Стеклянная пипетка (объем

водянон

Х500 мм)

руоашкои

(9,0 X

25 мл) с прокладкой из стеклянной ваты снизу и резиновой пробкой сверху, через которую проходит игла шприца

Температура колонки

60 °С

Комнатная

Скорость 15 мл/ч (насос высокого давле- ~> мл/ч потока пия, например хроматогрлфи-

ческий мини-насос фирмы Milton Roy)

Объем 2 2

фракции, мл

Нанесение Обра кд растворяют в 1 мл Обессоленный образец раетио-

образца воды с добавлением нссколь- ряют в 2 мл 0,1%-ного би-

кнх капель конц. HCI до рН 2. карбоната аммония (рН 8.3).

Отделяют центрифугированием При необходимости добавляют

осадок (при помутнении), па- кристаллическую мочевину для

лосят па колонку продувают растворения осадка азотом и заполняют свободный объем буфером рН 3,1

Промывка 1 Промывают буфером рП 3,1 Промывают 0,1 %-ным бикарбо-до полного элюирования кис- и атом аммония (рН 8,3) до лих пептидов (один объем ко- полного элюирования основных лопкп). Контроль: высоко- пептидов. Контроль по изме-вольтный электрофорез па бу- рению оптической плотности маге при рН 6,5 "при 230 им

10.4. РАСТВОРИМЫЕ ПЕПТИДЫ

355

Продолжение табл 10.5

Общие ука- ^

зания Дауэкс-50 ДЭАЭ-целлюлоз а

Градиент рН 300 мл буфера рН 3,1+600 мл Первый градиент: 200 Мл буферных буфера рН 5,0 (т. е. в соот- 0,1-ного бикарбоната аммония растворов ношении 1 : 2, в градиентном (рН 8,3)4-200 мл 1%-иого би-смесителе) обеспечивают ли- карбоната аммония (рН 8,3); ней ный градиент по концент- элюируются основные и нейт-рации ионов пиридина ральные пептиды. Второй гра-

диент: 200 мл 1%-ного бикарбоната аммония (рН 8,3) + 4-200 мл 3%-ного бикарбоната аммония (рН 8,3); элюируются преимущественно кислые пептиды

50 мл 5%-ного бикарбоната аммония, затем 10 мл 6 М гуанидипгндрохлорида. По окончании процесса колонка должна быть приведена к исходным условиям

Промывка 2 Буфер рН 5,6 (8,5 М пиридин: 684 мл пиридина+ 180 мл ледяной уксусной кислоты+вода до общего объема 1 л)

при низком выходе пептида с ДЭАЭ-целлюлозы его количества обычно бывает достаточно для аминокислотного анализа, определения частичной аминокислотной последовательности и проведения дополнительного гидролиза на аналитическом уровне. Полученный гидролизат анализируют методом электрофореза и хроматографии, затем проводят препаративный гидролиз па неочищенном пептиде и фрагменты, принадлежащие главному компоненту, идентифицируют путем сопоставления с аналитической картой.

Остальные пептиды объединяют и наносят па колонку с дау-эксом-50 или несколькими порциями — на ДЭАЭ-целлюлозу.

10.4.2. Хроматография на колонке с дауэксом-50

Элюирование пептидов с колонки, заполненной смолой дауэкс-50 (сульфополистирол), осуществляется с помощью повышающегося градиента рН и концентрации пиридина [58, -60] (детали приведены в табл. 10.5). При рН 2 карбоксильные группы С-концевых остатков и боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислот протопированы, как и N-копцевые аминогруппы и боковые цепи аргинина, лизина, гистидина. В этих условиях пептиды сорбируются на сульфогруппах смолы. При повышении рН карбоксильные группы ионизируются и пептиды отделяются от смолы. Таким образом, фракционирование пептидов

23*

356 Ю- ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

происходит в соответствии с их суммарным зарядом и рК карбоксильных групп. Первыми элюируются кислые пептиды, затем нейтральные и основные. Нейтральные пептиды сходят с колонки обычно двумя группами: сначала «истинно» нейтральные, не содержащие внутренних основных или кислотных остатков, а затем пептиды, внутренние заряды которых компенсированы. Это деление обусловливается более высоким значением р/( карбоксильных групп боковых цепей по сравнению с карбоксильными группами С-концевых остатков. Крупные, гидрофобные и очень основные пептиды (с положительными зарядами от нескольких групп) обычно элюируются с низким выходом. Поскольку пиридин «непрозрачен» в ультрафиолете при 230 и 280 нм, кривые элюирования пептидов строятся по данным анализа небольших порций полученных фракций методом высоковольтного электрофореза на бумаге при рН 6,5; по результатам анализа фракции объединяют и концентрируют на роторном испарителе.

10.4.3. Хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Элюирование пептидов с ДЭАЭ-целлюлозы (диэтиламиноэтил-целлюлозы) проводят в повышающемся градиенте концентрации иона бикарбоната [55] (табл. 10.5). При рН 8,0 С-концевые карбоксильные группы и карбоксильные группы боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислот ионизированы, в то время как боковые группы аргинина и лизина протопироваиы. Имида-зольное кольцо гистидина полиостью депротопировано, а его N-концевая аминогруппа депротонирована на 50%. Пептиды разделяются в соответствии с их суммарным зарядом при рН8,0.

Первыми элюируются основные пептиды, затем нейтральные и кислые; при нанесении образца в растворе низкой ионной силы и последующем элюировапии таким же раствором можег быть достигнуто хорошее разделение основных пептидов. Такого рода «гидрофобные» взаимодействия с матрицей позволяют разделять структурно близкие пептиды, различающиеся только нейтральными аминокислотами.

Контролируют разделение пептидов по поглощению элюата при 280 и 230 им и с помощью метода аналитического электрофореза на бумаге. В соответствии с полученными данными фракции объединяют и высушивают па роторном испарителе.

10.4.4. Высоковольтный электрофорез и хроматография на бумаге

Электрофорез и хроматография на бумаге удобны как быстрые методы очистки средних и коротких пептидов (разд. 10.8.2). Электрофорез обычно проводят при рН 6,5, 3,5 и 2,1, При этих

10.5. НЕРАСТВОРИМЫЕ ПЕПТИДЫ

357

рН боковые цепи остатков лизина и аргинина, как и N-концевые аминогруппы, полностью протонированы. При рН 6,5 имидазоль-ное кольцо гистидина частично протонировано, а карбоксильные группы полиостью ионизированы. При рН 3,5 гистидин полностью протонирован, а карбоксильные группы протонированы частично. При рН 2,1 карбоксильные группы протонированы полностью, исключение составляет сульфогруппа боковой цепи цистеиновой кислоты. Подвижность пептидов в электрофорезе строго зависит от их суммарного заряда и размера [46J, их локализация на бумаге определяется окрашиванием боковой полоски листа нингидрином (в случае одномерных карт) или опрыскиванием раствором флуорескамина низкой концентрации (для одномерных и двумерных карт). Процесс электрофоретического разделения на бумаге очень чувствителен к наличию солей в образце и перегрузке носителя, а детекция пептидов с помощью указанных реактивов возможна лишь при наличии неблокированной N-концевой аминогруппы. Разделение пептидов при хроматографии на бумаге в системе БУВП [77] (табл. 10.4) происходит в соответствии с их коэффициентом распределения между водной и органической фазами: гидрофобные пептиды движутся быстрее, чем гидрофильные. Разрешающая способность хроматографии в БУВП ниже, чем электрофореза, однако для разделения пептидов одинакового размера и заряда ценность метода несомненна.

10.5. Фракционирование нерастворимых пептидов

Нерастворимые (кбровые) пептиды могут быть солюбилизиро-ваны и затем разделены в денатурирующих условиях, но, как правило, более выгодно проводить их предварительную фрагментацию. Для гидролиза смеси труднорастворимых алифатических пептидов используют эластазу или термолизин, для пептидов ароматического характера — химотрипсин или пепсин при кислых рН. Образовавшиеся фрагменты разделяют хроматографией на бумаге или, если кор составляет значительную часть молекулы белка, на колонке дауэкс-50 с окончательной очисткой полученных фракций на бумаге.

10.6. Контроль гомогенности и определение аминокислотной последовательности пептидов

Степень чистоты выделенных пептидов определяют с помощью электрофореза при двух рН — 2,1 и 6,5, а также аминокислотного анализа и определения N-концевого остатка. Характеристики электрофоретической подвижности пептида при рН 2,1 и 6;5 [46] в совокупности с данными аминокислотного состава

358

10. ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

позволяют оценить размер пептида и число содержащихся в нем амидных групп. Прежде чем начинать определение аминокислотной последовательности, целесообразно создать некоторый «фонд» чистых пептидов, поскольку одновременно параллельно можно анализировать до 20 образцов (подробно методики определения структуры в дансильном и ДАБИТЦ — ФИТЦ-вариан-тах приведены в гл, 11 и 14). Идентификация амидов дикарбоновых аминокислот в дансильной методике может быть осуществлена по электрофоретической подвижности небольшой порции исследуемого пептида до и после отщепления по Эдману остатков Asx и Glx. Альтернативный вариант заключается в определении электрофоретических характеристик (рН 6,5) коротких фрагментов исходного пептида, полученных при его ферментативном гидролизе (после установления структуры дансильным методом). Выбор фермента диктуется необходимостью идентификации конкретного остатка дикарбоновой аминокислоты в цепи, особенно удобно использовать для этой цели стафилококковую протеазу.

Поскольку надежность определения аминокислотной последовательности снижается при приближении к С-концу пептида, рекомендуется выделить С-концевой (ые) фрагмент(ы) исходного соединения, проверив еще раз его аминокислотный состав, подвижность в электрофорезе при рН 6,5 и полученные характеристики сравнить с ожидаемыми на основании имеющихся структурных данных. Погрешности в установлении С-концевой аминокислотной последовательности могут привести к неправильному соединению фрагментов и, таким образом, к значительным ошибкам при реконструкции полипептидной цепи. Разумно совместить в одном эксперименте контроль структуры С-концевой области пептида с идентификацией амидов дикарбоновых аминокислот.

Причины возможных ошибок в определении аминокислотной последовательности многообразны. Так, гистидин менее устойчив в условиях реакции, чем другие аминокислоты, и преждевременное расщепление связей по остатку гистидина может привести к его потере (пропуску) в полипептидной цепи или, что более обычно, к появлению гетерогенности в последовательности [59, 61]. Неполное отщепление аминокислоты при обработке безводной кислотой, неудовлетворительная экстракция тиазолииона или его частичная деструкция могут быть причинами ошибочной идентификации на данной стадии аминокислотного остатка, являющегося «остаточным» от предшествующего. Вероятность ошибки возрастает в тех случаях, когда N-концевыми становятся остатки пролина или триптофана, дан-снльные производные которых разрушаются в процессе гидролиза. Усложняет процесс идентификации возможная экстракция

10.7. РЕКОНСТРУКЦИЯ ПОЛИПЕПТИДНОН ЦЕПИ

359

в органическую фазу укороченных, особенно неполярных, пептидов.

В результате неполного расщепления некоторых связей при кислотном гидролизе дансилпептида (преимущественно с N-koh-цевыми остатками Не и Val) образуются дансильные производные дипептидов, которые могут быть ошибочно идентифицированы как дансиламинокислоты, поскольку положения их пятен при хроматографии на полиамидных пластинках совпадают, например дансил-Ile-Glu и дансил-Glu. Наконец, источником ошибок может быть «перекрестная» идентификация аминокислот при определении структуры негомогенного пептида. При небольшом содержании примесного пептида удается определить последовательность главного компонента смеси, но возможное блокирование основного пептида (по остаткам Gin, Тгр или связи Asn-Gly) или его предпочтительная экстракция в растворитель при промывках могут привести к тому, что минорная последовательность с определенного положения цепи будет принята за основную.

10.7. Реконструкция полипептидной цепи

Для установления общей последовательности белка пептиды одного типа гидролиза должны быть «перекрыты» пептидами, полученными из другого гидролизата. Некоторые комбинации протеолитических фрагментов, такие, как трипсин и химотрипсин или трипсин и стафилококковая протеаза, хорошо дополняют друг друга в этом отношении, в то время как комбинация трипсин Ч-протеаза из A. mellea или химиотрипсин +пепсин менее выгодны, поскольку они образуют значительное число фрагментов, отличающихся только на один аминокислотный остаток (табл. 10.1). Нет необходимости определять полную структур/ всех пептидов второго набора, обычно ограничиваются получением таких характеристик, как аминокислотный состав, N-коп-цевые аминокислоты, электрофоретическая подвижность, но, безусловно, должна быть установлена аминокислотная последовательность «перекрывающих» областей и тех участков цепи, корректность структуры которых вызывает сомнение. Перекрывающая последовательность должна захватывать .по крайней мере два С-концевых остатка одного пептида и два N-концевых другого. Если установление структуры белка не завершено в значительной степени, то более короткие перекрывающие последовательности, чем указанные, должны быть под

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
металлосайдинг купить в иркутске
neo vision dali extra violet где купить
набор посуды для сервировки стола
резиновые рамки для номерных знаков

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)