химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ам, например N-концу Arg, Phe, Trp (G. Winter, неопубликованные данные) и С-концу Arg [13]

молекулы белка, что значительно упрощает дальнейшее фракционирование. Однако достижение полного и специфического расщепления белка химическим реагентом, успешное осуществление разделения крупных фрагментов и, наконец, нахождение порядка их расположения в цепи в свою очередь может вызывать заметные затруднения. Например, бромоциаи расщепляет

Таблица 10.2. Химические методы расщепления, применяемые в двустадийной схеме анализа

Реагент

Часiнчное расщепление

Побочные расщепления

Бромоциан [23]

2-Нитро-5-тиоцианобен-зойная кислота с последующим щелочным расщеплением [11]

Гидробромид димстил-сульфоксида [56] или N-хлорсукцинимид [64]

BrCN в муравьиной и гептафторомасляной кислоте [47]

Гидроксиламии [5]

По Met с образованием С-кон-цевых остатков гомосерина и гомосеринлактопа; последний устойчив к действию карбоксипептидаз

По Cys с образованием N-кон-цевого 4-карбоксиминотиазо-лидииа, блокирующего реакцию Эдмана и действие амино-пептндаз; возможно деблоки-эование каталитическим восстановлением [57]

По Тгр с образованием С-кон-цевого лактопа; Cys и Met окисляются

По Тгр при условии предварительного фотокисленпя Met

По Asn-Glv

Не расщепляется связь Mct-оксид; частично расщепляются связи Met-Ser, Mct-Thr [62], Met-(Cys-Cys) [14] и Met-Glu [10]

Образование смешанных

дисульфидов [54] и р-эли-

мннирование S-цианопроиз-водного [70]

Разбавленная кислота По Asp-Pro и Asn-Pro [50]

Степень расщепления зависит от предварительного пребывания пептида в кислых или щелочных условиях [38]

Кислотное расщепление по связям Asp-Pro и Asn-Pro [50] и окислительное расщепление по Тгр [3]

Связи Phe-Thr и Phe-Ser при использовании каталитического восстановления для деблокирования N-концевого остатка [57]

Связи Asn-Lcu [6] Asn-Ala [71]

348 10. ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

пептидную цепь по остаткам метионина с превращением их в остатки гомосерина, при этом окисленная форма метионина — метионинсульфоксид устойчива к действию реагента, а связи Met-Ser и Met-Thr расщепляются лишь частично. В условиях кислотного гидролиза лабильных связей Asp-Pro триптофан подвергается окислительной деструкции и частично разрушаются амиды дикарбоновых аминокислот. Получаемые химическими методами крупные денатурированные полипептиды часто плохо растворимы и не элюируются с ионообменных колонок. Многообразие заряженных форм каждого пептида, возникающее в результате частичного деамидировапия или образования смесей пептидов с С-копцевыми остатками гомосерина и гомо-серинлактона, усложняет их разделение по зарядам. Для реконструкции полипептидной цепи из бромоциановых фрагментов необходимо выделение всех метионинсодержащих пептидов из другого гидролизата исходного белка.

Многих из затруднений можно предусмотрительно избежать. Так, до проведения гидролиза остатки метионинсульфоксида могут быть восстановлены до метионина обработкой белка 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитом в денатурирующих условиях. Следует иметь в виду, что метионинсульфоксид не обнаруживается в белке аминокислотным анализом, поскольку в условиях кислотного гидролиза восстанавливается до метионина, однако он может быть определен непрямыми методами [63]. Смесь пептидов с С-копцевыми остатками гомосерина и гомосеринлактона может быть превращена в любую из этих форм [2, 45].

Для растворения и разделения крупных пептидов могут быть использованы 8 М мочевина с последующей ионообменной хроматографией в этом же растворе [25] или 100%-ная муравьиная кислота с гель-фильтрацией на биогелях в 20—70%-ной муравьиной кислоте [1]. Солюбилизация достигается также модификацией остатков лизина в пептидах цитракоповым ангидридом; фракционирование проводится на колонках с биогелем или сефадексом при нейтральных рН.

На заключительных стадиях анализа может быть осуществлен целенаправленный поиск пептидов, необходимых для соединения крупных фрагментов, так называемых «перекрывающих» пептидов. Например, метионинсодержащие пептиды могут быть селективно выделены с помощью диагонального электрофореза [73]. Наилучший способ идентификации цистеинсодер-жащих пептидов заключается в предварительном мечении остатков цистеина [14С] иодоуксусной кислотой с последующим целенаправленным выделением радиоактивных фрагментов [78, 79]. Пептиды, содержащие триптофан, обнаруживают в пиках хро-матограмм по наибольшему поглощению при Л2зо и по присущей

10.3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ

349

ему флуоресценции или специфическому окрашиванию при хроматографии на бумаге.

Поскольку гель-фильтрация дает безусловно лучшие выходы при разделении крупных пептидов, чем ионообменная хроматография, оптимальный метод расщепления белка в двухстадий-ном анализе (рис. 10.2) удобно выбирать па основе результатов аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС). При четком разделении полос в геле целесообразно для препаративного фракционирования пептидов применять гель-фильтрацию. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН используется также для контроля полноты процесса расщепления белка химическими реагентами.

10.3. Ферментативный гидролиз

До проведения ферментативного гидролиза образец белка должен быть денатурирован и остатки цистеина в нем превращены в гидрофильные производные. С этой целью дисульфидные связи в белке предварительно восстанавливают дитиотреитом [37] и цистеипы модифицируют иодоуксусной кислотой (для введения радиоактивной метки используют [14С] иодоуксусную кислоту), иодоацетамидом [31], этиленимином [66] или окисляют надмуравьиной кислотой [30]. Выбор реагента определяется общей стратегией исследования. Более подробно реакции модификации рассмотрены в гл. 2.

Обработка падмуравьиной кислотой приводит к окислению кроме остатков цистеина также остатков метионина и триптофана и обычно дает более растворимые продукты, чем восстановительное алкилирование. Для создания в белке дополнительных связей, подвергающихся гидролизу трипсином или протеазой A. mellea, применяют аминоэтилирование остатков цистеина.

В идеальном случае в результате протсолитического расщепления каждый участок полипептидной цепи будет представлен в гидролизате одним единственным пептидом, образовавшимся с максимально возможным выходом. Реально такое положение не достигается, поскольку каждая протеаза в отдельных участках полипептидной цепи проявляет различную степень сродства и гидролизует связи с различной скоростью. Однако можно ограничить процесс протеолиза точками наибольшего сродства. В общем случае это достигается путем уменьшения соотношения фермент:субстрат или путем увеличения объема добавленного буферного раствора; сокращение времени гидролиза также приводит к увеличению выхода фрагментов, образующихся в результате быстрого расщепления по наиболее «активным» точ-

350 Ю. ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

Таблица 10.3. Условия гидролиза белков некоторыми протеазами (37°С)а

Фермент

Соотношение фермент : субсграг (масс./масс.)

Время, ч

Трипсин Химотрипсин

Эластаза

Стафилококковая протеаза

Протеаза из Almiliaria mellea

1/100

1/504-1/100 ингибитор трипсина (из бобов сон) 1/100 1/30

1/100

а Концентрация белка-субстрата 1 мг/мл п 0.5% (по несу) аммоний бикарбонате, рП М). Аналогичные условии могут быть использованы для гидролиза очищенных пептидов {{ мкч/мл). Услония фрагментации пептидов термолизином: t/100 GO °С, 2 ч; пененном — 1/100, 37 ЭС 4 ч в 5%-нои мурапьшюй кислого.

кам. «Мягкие» условия гидролиза белков для нескольких протеолитических ферментов приведены в табл. 10.3. Протеоли-тическое расщепление может проводиться под контролем с помощью рН-стата [18]: прекращение поглощения киелсмы пли основания свидетельствует о завершении процесса.

Причиной «неспецифичности» расщепления данным ферментом может быть наличие в нем примесей других протеаз. Например, трипсин может содержать примесь химотрипсина, от которой освобождаются с помощью аффинной хроматографии, а триптическая активность в химотрипсипс подавляется добавлением ингибитора трипсина перед проведением гидролиза.

Обычно денатурированный белок нерастворим в аммоиий-бикарбоиатном буфере, применяемом для протеолиза, и должен предварительно солюбилизироваться или по крайней мере превращаться в топкую суспензию. Для этого лиофилизованиый препарат белка растворяют в минимальном объеме денатурирующего агента (6 М гуанидипхлорид, 8 М мочевина, 100%-пая муравьиная кислота или концентрированный водный аммиак) и разбавляют значительно большим объемом буферного раствора. Гидролиз трипсином, химотрипсином, эластазой можно проводить в 2 М растворе мочевины [24], а стафилококковой протеазой в 4 М мочевине [15]. Если для растворения белка использовались муравьиная кислота или аммиак, то буферный раствор соответственно подщелачивают аммиаком или подкисляют муравьиной кислотой до рН 8 (поскольку формиат аммония летучее соединение, то в последующем обессоливании пет необходимости). Применение мочевины и особенно гуанидии-хлорида требует проведения обессоливания па одной из заключительных стадий.

10.4. РАСТВОРИМЫЕ ПЕПТИДЫ

351

Контроль за ходом процесса протеолиза в суспензии может осуществляться измерением поглощения образовавшихся пептидов в небольшой пробе супернатаита (после отделения осадка) при 280 нм или определением радиоактивности [14С]карбокси-метилцистеипа. О завершении гидролиза судят по исчезновению полосы исходного белка в полиакриламидном геле. Во время проведения анализа основную массу гидролизата храпят при — 20 °С, и в случае, если процесс прошел неполно, образец размораживают и протеолиз продолжают. На конечной стадии нерастворимые пептиды отделяют центрифугированием и обе части гидролизата лиофилизуют. Целесообразно нерастворимые пептиды подвергнуть повторному гидролизу с большей нагрузкой фермента и присоединить образовавшиеся пептиды к основной массе (см. также гл. 3).

10.4. Фракционирование растворимых пептидов

Выбор онгималыюй схемы фракционирования смеси пептидов основан на предварительной информации об их общем числе, размерах, величине зарядов и растворимости. Как правило, крупные фрагменты менее растворимы, чем короткие, а размер пептидов, как и заряд, определяются природой использованной для гидролиза протеазы. Например, триптичеекпе пептиды обычно бывают кислыми, а не основными, поскольку вероятность содержания в них по крайней мере двух кислых аминокислот больше, чем внутренних остатков лизина и аргинина или двух гистидинов. В планировании схемы фракционирования, однако, гораздо более полезным, чем свод общих правил, оказывается проведение аналитического картирования на бумаге исследуемой смеси с окрашиванием пептидов нингидрином и селективными реагентами. Получение обычной пептидной карты включает электрофорез при р11 6,5 в одном направлении и хроматографию в системе бутанол — уксусная кислота — вода —пиридин (БУВП) в перпендикулярном направлении (табл. 10.4). Поскольку при гидролизе возможно образование значительного числа нейтральных пептидов, полосу при рН 6,5 вырездют и подвергают электрофорезу при рН 2,1. Если по результатам картирования в смеси преобладают крупные кислые пептиды, то па первой стадии разделения целесообразно использовать такую смолу, как ДЭАЭ-целлюлоза, при наличии значительного числа нейтральных и основных пептидов рекомендуется применять дауэкс-50. Хорошая пептидная карта на этой стадии очень полезна и для оценки общего числа компонентов в гидролизате, позволяющей контролировать возможные потери пептидов при дальнейшей очистке.

352 Ю- ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

Таблица 10.4. Условия высоковольтного электрофореза и хроматографии на бумаге. Нагрузка смеси пептидов <50 нмоль/см каждого пептида для ватмана № 1 или 200 нмоль/см для ватмана 3 ММ

Состав буфер а, мл ?

.Метод бутанол уксусная кислота муравьиная кислота X Jk к га Р. < Охлаждающий агент Положен ие линии старта, см <У к X Время, мин ^ к с с га

2 ° С ю X

Электрофорез при различных РН

6,5 — 0,3 —

3,5 — 5 — 2,1 — 4 —

Хроматогра- 15 3 — фия в системе БУВП

10 89,7 Толуол 30,

0,5 94,5 Уайтспирит 20,

— 45 » 10,

10 12 — 10,

от анода 45 3 от анода 90 3

от анода 45 3

сверху В течение ночи

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-цел-люлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекулярной массы (до 40 000). Крупные фрагменты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракционирования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко не ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембранные белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза; гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях па полиакриламидпых гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые

10.4. РАСТВОРИМЫЕ ПЕПТИДЫ

353

затем разделяют па дауэксе-50, структура пептидов, содержащихся в негомогенных фракциях, может быть установлена с помощью масс-спектрометрического анализа [44]. В последние годы широкое применение для быстрого разделения пептидов нашел метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (гл. 6).

10.4.1. Гель-фильтрация

Метод гель-фильтрации широко используют на первой стадии разделения, поскольку при этом обычно достигаются высокие выходы, а крупные пептиды часто получаются в состоянии, не требующем дальнейшей очистки. Растворимые пептиды наносят на колонки с сефадексом G-50 или G-25 в аммоиийбикарбоиат-пом буфере и элюируют этим же буфером, контролируя процесс фракционирования спектрофотометрически при 280 им (максимум поглощения остатков триптофана и тирозина) и 230 нм (максимум поглощения пептидной связи). Для полного растворения исходной смеси в небольшом объеме (для нанесения па колонку) иногда следует добавить небольшое количество кристаллической мочевины. Пептиды, полученные при гидролизе пепсином, плохо растворяются при нейтральном рН, их солю-билизируют в небольшом объеме 100%-ной муравьиной кислоты, разбавляют до 5%-ной концентрации и наносят на колонки с сефадексом или биогелем, уравновешенные тем же р

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Кникните, вся техника со скидкой в KNS по промокоду "Галактика" - купить экран для проектора в москве - мегамаркет компьютерной техники.
купить кроссовки для зала
обучение вентиляция и кондиционирование челябинск
защита от камер гибдд наклейки на номер авто отзывы

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.02.2017)