химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

. 9.2. Разделение кислых аминокислот (группа 1) на энаитиомеры па колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральиая добавка (Сп-ДПА) в воде. Температура комнатная: скорость потока 0,1 мл/мин, через 30 мин---0,2 мл/мин.

L-Leu L-Ue

АА

РИС. 9.3. Разделение нейтральных аминокислот (группа 2) на энантиомеры па колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральная добавка (Си-ДПА) в поде и водном аиетопитриле (1 %-ный). Температура комнатная, скорость потока 0,25 мл/мин.

22*

340

9. ЭНАНТИОМЕРНЫИ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ВЭЖХ

то

0 10 20 30 40

Время, мин

РИС. 9.4. Разделение ароматических аминокислот (Туг, Phe и Тгр) на энан-тиомеры на колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральная добавка (Cu-ДПА) в воде и водном ацетонитриле (14%-ный). Температура комнатная, скорость потока 0,5 мл/мин.

Arg

о. о о

His

10 20 Время, мин

РИС. 9.5. Разделение основных аминокислот на энантиомеры на колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральная добавка (Cu-ДПА) в воде. Температура комнатная, скорость потока 0,2 мл/мин.

9.4. Заключение

В любой лаборатории, имеющей хроматограф высокого разрешения с соответствующим детектором, легко наладить двуста-дийную хроматографическую систему для разделения аминокислот на энантиомеры. Можно использовать обычные продажные колонки без модификации. Повысить эффективность разделения можно с помощью создания градиента концентрации ацетонитрила, позволяющего анализировать одновременно нейтральные и ароматические аминокислоты, и установкой крана на выходе с колонки, отводящего большую часть элюата в коллектор и только небольшую — в детектор для определения.

ЛИТЕРАТУРА

341

В альтернативном варианте энантиомерного анализа с ка-тионообменпой смолы собирают каждую из аминокислот по отдельности в летучем буфере (0,1 М пиридин — ацетат, рН 3,1; затем 0,4 М пиридин — ацетат, рН 5,3) с последующим разделением на изомеры на обращенной фазе с хиральной добавкой (Engel, 1981, частное сообщение). В тех случаях, когда смесь содержит не все белковые аминокислоты, стадия ионообменной хроматографии может быть опущена.

Изменение конфигурации компонента хиральной добавки приводит к изменению порядка выхода с колонки о- и l-изо-меров; результаты такого эксперимента могут дополнительно служить для подтверждения их соотношения. Изменение этого соотношения свидетельствует о наличии примесей в образце.

9.5. Благодарности

Авторы выражают искреннюю благодарность профессору Э. Гиль-Ав за его поддержку и ценные советы.

Литература

1. Bowman R. ?, Stroud Н. //„ J. Chem. Soc, 1342—1345 (1950).

2. Davankov V. Л, Semechkin А. V., J. Chromatogr, 141, 313—353 (1971).

3. Gil-Av ?, Tishbee A„ Hare P. ?, J. Am. Chem. Soc, 102, 5115—5117 (1950).

4. Gilon C, Leshem R.t Tapuhi У, Grushka ?, J. Am. Chem. Soc, 101, 7612— 7613 (1979).

5. Hare P. ?„ Gil-Av ?., Science, 204, 1226—1228 (1979).

6. Lefebvre B. L, Audebert R„ Quivoron C, Isr. J. Chem, 15, 69—73 (1977).

7. 5packman D. H.t Stein W. H./Moore S, Anal. Chem, 30, 1190—1206 (1958).

8. Tapuhi Y.t Miller N., Karger B. L.t J. Chromatogr, 205, 325—337 (1981).

9. Weinstein S, Angew. Chem, 94, 221—222 (1982).

10. Weinstein S, Engel M. H.} Hare P. ?, Anal. Biochem, 121, 370—377 (1982).

Г лава 10

ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ

Г. УИНТЕР (G. WINTER, MRC Laboratory of Molecular Biology, Hill Road, Cambridge, CB2 2QH, U.K.)

ЮЛ. Введение

В основе всех современных методов определения аминокислотной последовательности пептидов лежит реакция Эдмана [19, 21]. На первой стадии этой реакции происходит присоединение фепилизотиоцианата (ФИТЦ) к «-аминогруппе пептида, затем от фенилтиокарбамилыюго (ФТК) производного под действием безводной кислоты отщепляется N-концевой остаток в виде Б'-гиазолипопа и образуется укороченный пептид, содержащий в качестве N-концсвой последующую аминокислоту (рис. 10.1). Избыток реагентов и побочных продуктов на промежуточных стадиях удаляется экстракцией органическими растворителями. Повторение этого процесса с одновременной идентификацией образующегося из тиазолпиона феннлтиогидантоииа (ФТГ) отщепляемой аминокислоты или Х-копцевого остатка укороченного пептида позволяет устанавливать аминокислотную последовательность исходного соединения.

Длина определяемой таким образом последовательности ограничена по причине постепенного уменьшения выходов продуктов на стадиях присоединения, расщепления и экстракции, возможного блокирования вновь образованного Х-коннового остатка, протекания побочных реакций расщепления по остаткам аргинина и гистидина [58, 61] или по другим аминокислотным остаткам полипептидлоп цепи [39], а также по ряду других причин. Так, ФТК-производные пептидов в присутствии следов кислорода в реакционной среде десульфируются [33] и не расщепляются далее при обработке кисло г ой. Пептиды с Х-концс-выми остатками глутамина [4], триптофана [75] и различных производных цистеипа [53, 68, 76] могут образовывать циклические продукты, что, как и возможная перегруппировка в случае последовательности Asn-Gly [20, 35, 72], а также О—*Х-ацильпая миграция у остатков ацилсерина и ацилтреопипа [20, 34, 69], приводит к блокированию процесса расщепления. Дополнительные осложнения возникают в случае трудно растворимых гидрофобных пептидов, которые не полностью вступают в реакцию конденсации и способны переходить в органическую фазу при экстракциях.

10.1. ВВЕДЕНИЕ

343

Ri

г-

I

NH, СН CO NH СН CO

пептид ( n аминокислот)

-i-

C»,H5- NCS сренилизотиоцианат

-.юлденсация

иод ныл пиридин

К. СН

HN

С S

со

перегруппировка

v С \\ годный раствору h кислая среда, нагревание

фенилтиогидантион РИС. 10.1. Схема 1.

К1 СН

I

N

СО S

Ri

СН CO NH -СН CO-

I

NH

C-S

NH ChH,

фенилтиокарбам ил пептид

безводная , трифторо-уксусная кислота^ расщепление

R:

СН со

NH С\,Н5 гиазолинон

пептид (/7-1 аминокислот)

Выходы па стадиях классического («ручного») метода Эд-мапа обычно ниже, чем при использовании автоматических приборов, главным образом вследствие невозможности полного исключения кислорода из реакционной среды и менее эффективных промывок водной фазы. Поскольку реакция расщепления 1 рифтороуксусноп кислотой обратима [21] (рис. 10.1), присутствие тиазолипопов, неполностью экстрагированных па предыдущих стадиях, ингибирует процесс расщепления ФТК-пептида. В методике Хартли [26] в отличие от собственно метода Эдмапа и его варианта с ДАБИТЦ- и ФИТЦ-реагептами [9] (гл. 14) часть пептида отбирается для дансилирования и последующей идентификации N-копцевон аминокислоты (гл. 11), что ведет к дополнительному снижению постадийиых выходов. По мере увеличения числа отщепленных аминокислот возрастает уровень фоновых «шумов», что затрудняет достоверное определение аминокислоты. Обычно этими методами удается устанавливать относит ельно короткие последовательности, содержащие до 15 остатков. Таким образом, совершенно очевидно;" что расщепление па короткие пептиды — необходимая ступень структурного анализа белка при классическом подходе; оно осуществляется обычно с помощью ферментов и химических реагентов (в последнем случае образуются более крупные фрагменты).

344

10. ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

10.2. Выбор стратегии исследования

На рис. 10.2 представлена стратегическая схема анализа структуры белка в одно- и двухстадийном вариантах. Исходный образец белка должен быть очищен до гомогенного состояния (не менее 95% степени чистоты); липиды, углеводы и кофакторы должны быть удалены.

Выбор протеолитических ферментов для первоначальной фрагментации (в одностадийном варианте) определяется молекулярной массой и аминокислотным составом белка, поскольку эти данные позволяют предсказать среднестатистический размер пептидов, образующихся при гидролизе (например, трипсином по остаткам лизина и аргинина). Обычно используют наиболее специфичные ферменты — трипсин, химотрипсин, стафилококковую протеазу, протеазу из Л. mellea (табл. ГОЛ). Для того чтобы избежать трудностей, связанных с разделением гидролизата крупного белка, содержащего значительное число (>40) пептидов, применяют блокирование некоторых потенциальных точек расщепления полипептидной цепи или используют двухста-дийную схему анализа. Так, расщепление трипсином по остаткам лизина может быть предотвращено путем модификации последних малеиновым ангидридом [8]. После проведения триптиче-ского гидролиза модифицированные фрагменты перед их разделением (ионообменной хроматографией или электрофорезом) деблокируют обработкой кислотой. Соответственно пептидные связи, образованные остатками аргинина, могут быть защищены от действия трипсина предварительной обработкой белка цикло-гександионом в присутствии бората [48]. Необходимым условием успешного применения этого подхода является достижение полноты модификации и последующего удаления защитных групп. Техника блокирования в соединении с методами диагонального электрофореза [8, 48, 49] используется для селективного выделения триптических пептидов, содержащих внутренние остатки лизина или аргинина. Альтернативным вариантом для первичной фрагментации полипептидпой цепи только по остаткам аргинина или лизина служит применение специфических ферментов — клострипаина [43] и протеазы из A. mellea [65] соответственно.

В двухстадийной схеме анализа для получения крупных фрагментов белка используют либо химические методы расщепления (табл. 10.2) по таким сравнительно редко встречающимся в полипептидной цепи аминокислотам, как триптофан, метионин, цистеин, либо ограниченный протеолиз нативного белка [36, 40, 51, 52]. Повторная фрагментация каждого из образовавшихся крупных пептидов приводит к образованию значительно меньшего числа компонентов, чем в случае целой

Очистка полипептидной цепи белка (степень чистоты >95% ). Удаление кофакторов, липидов,углеводов_

Определение молекулярной массы и аминокислотного состава белка. Выбор одно-кли двустадийной схемы анализа_

двустадииныи анализ

Пробная фрагментация с помощью ограниченного протеолиза, расщепления по остаткам Met, Cys,Trp или связям Asp-Pro,Asn-Pro,Asn-6ly

одностадийный анализ

Анализ продуктов на полиакриламидном геле в присутствии ДСН

Выбор метода расщепления и оптимизация условий процесса___^__

Аналитическая модификация остатков

цистеина и разделение фрагментов гель-фильтрацией

Денатурация белка и модификация остатков цистеина_

Препаративная модификация остатков цистеина с последующим фракционированием пептидов гель-фильтрацией__

| Солюбилизация белка и гидролиз протеазой |

растворимые пептиды

нерастворимые пептиды растворимые пептиды

| Повторный гидролиз протеазой |

Обессоливание в случае необходимости. Приготовление аналитической пептидной карты, окрашивание специфическими реагентами %

3

нерастворимые пептиды

Гидролиз протеазой низкой специфичности Фракционирование пептидов электрофорезом или хроматографией на бумаге

Гель-фильтрация на сефадексе 6-25 или 6-50_

Элюирование пептидов с бумаги и определение аминокислотной последовательности

большие пептиды о 25 остатков)_

другие пептиды

'ценка степени чистоты пептидов по фракциям анализом N-концевых аминокислот и частичной последовательности

чистые пептиды

фракции,содержащие

несколько компонентов

фракции,содержащие один основной компонент с

-|Очистка на ДЭАЭ-целлюлозе

Очистка на ДЭАЭ-целлюлозе | "римесями Частичная, до 30%)

Определение аминокислотного состава и N-концевой последовательности основного компонента.Фрагментация на аналитическом уровне протеазой(ами) и приготовление пептидной карты (электрофорез при рН 6,5и2,1)

Определение аминокислотного состава и N-концевой последовательности. При недостаточности материала для препаративного гидролиза (ШОнмоль) проведение фрагментации на ана литическом уровне протеазой высокой специфичности.

Определение электрофоретической подвижности (при рН 6,5 и 2,1 j образовавшихся фрагментов

Препаративный гидролиз оставшегося негомогенного

пептида протеазой (зми). Фракционирование на бумаге

[в условиях,найденных в аналитическом эксперименте)и определение

аминокислотной последовательности фрагмемтов,соответствующия обнаруженным на карте

Преимущественно небольшие основные и нейтральные пептиды или смесь небольших нейтральных пептидов

[Хроматография надауэксе-50

Преимущественно кислые и нейтральные пептиды средней величины_

t Да

Разделение на ДЭАЭ-целлюлозе на 2-4 фракции, нанесение небольших пептидов непосредственно на бумагу

I Очистка пептидов (при необходимости) электрофорезом и хроматографией на бумаге!

Определение аминокислотного состава, электрофоретической подвижности ¦ при рН 2,1 и ь,Ь и концевых групп очищенных пептидов. Установление аминокислотной последовательности в дансильном варианте модификации ДА6ИТЦ-ФИТЦ или Метода Эдманг

Проведение дополнительных гидролизов с целью проверки С-концезой последовательности фрагментов, положения амидов дикарбоновых аминокислот и установления структуры пептидов с блокированными ot-аминогруппами. Фракционирование гидролизатов на бумаге, анализ N-концевых остатков,определение аминокислотного состава, электрофоретической подвижности и в случае необходимости частичной последовательности выделенных фрагментов__

РИС. 10.2. Стратегия определения аминокислотной последовательности (неавтоматическими методами).

346

10. ТРАДИЦИОННАЯ СТРАТЕГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ

Таблица 10.1. Специфичность действия протеаз

Остатки X, по которым в Фермент основном проянляеюя

действие протеазы

Примечания

Трипсин

Химотрипсин

Эластаза

Стафилококковая протеаза

Термолизин

Пепсин

Протеаза из Л г miliaria mellea

Остатки основных аминокислот: по С-концу Lys, Arg и амппоэтил-Cys [67]

Остатки ароматических аминокислот: по С-концу Тгр, Туг, Phe, Leu [67]

Остатки алифатических аминокислот: Ala, Val, Gly, Ser [27]

Остатки кислых аминокислот: по С-концу Glu п Asp [15, 16, 32]

N'-конец Не, Leu, Phe [29, 41, 42]

Val,

Остатки ароматических аминокислот: по N-koh-hv Тгр, Туг, Phe, Leu [67]

По N-концу Lys и амп-иоэтил-Cys [65]

Гидролиз не проходит по связям Х-Pro; менее эффективен, если перед или после X находится кислый остаток; более селективен к Аг? в щелочной области рН [22]; протекает в 2 М мочевине

Гидролиз не проходит по связям Х-Pro и окисленному Тгр; менее эффективен, если перед пли после X находится кислый остаток; протекает в 2 М мочевине

При условии частичного расщепления точки гидролиза непредсказуемы; гидролиз проходит в 2 М мочевине

Могут быть подобраны условия гидролиза только по Glu или по Glu н Asp; гидролиз проходит также по карбоксиметил-Cys; менее эффективен, если за К стоит остаток с разветвленной боковой цепью или если X находится в окружении кислых аминокислот; протекает в 4 М мочевине [15]

Гидролиз не проходит по связям Х-Pro; протекает при 60—80 СС, что может способствовать рас творению пептида

Расщепляет также многие другие связи; кислые условия гидролиза могут способствовать растворению пептида

Гидролизует также но другим остатк

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
объявление о сборе денежных средств
системные блоки
liebert gxt4 3000rt230e
канальный осушитель на 500 квт

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.08.2017)