химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

78, 554—556 (1977).

362. Tanford C, Roberts G. L, J. Am. Chem. Soc, 74, 2509—2515 (1952).

363. Tapuhi Y.t Schmidt D. E., Lindner W., Karger B. L.t Anal. Biochem, 115, 123—129 (1981).

364. Tasheva В., Dessev G„ Anal. Biochem, 129, 98—102 (1983).

365. Thannhauser T. W.f Konishi Y.r Scheraga H. A, Anal. Biochem, 138, 181 — 188 (1984).

366. Tomlinson G.t Viswanatha Т., Anal. Biochem, 60, 15—24 (1974).

367. Torres A. R., Peterson E. Л, Anal. Biochem, 98, 353—357 (1979).

368. Towbin tf, Staehetin Т., Gordon F, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76 4350— 4355 (1979).

369. Tower D. В., Methods Enzvmol, 11, 76—93 (1967).

370. Trah T. /, Schteyer AL, Anal. Biochem, 127, 326—329 (1982).

371. Trezl L, Ruszndk L, Tyihdk E.t Szarvas Т., Szende В., Biochem. J., 214, 289_292 (1983)

372. Tristram G. R., Smith R. //, Adv. Protein Chem, 18, 227—318 (1963).

373. Tsang V. C. W.t Peralta J. M., Simons A. R., Methods Enzymol, 92, Part E, 377—391 (1983).

374. Tumelt D. C., Cooper J. D. //, Clin, Chem, 28, 527—531 (1982).

375. Udenfriend S., Stein 5, Bohlen P., Dairman W.t Leimgruber WWeigele Af, Science, 178, 871—872 (1972).

376. Umagat H.f Kucera P.s Wen L.-F., J. Chromatogr, 239, 463—474 (1982).

377. Van Kley H.t Hale S. AL, Anal Biochem, 81, 485—487 (1977).

378. Van Sumere C, Geiger H., Bred D.f Folckenier G.f Vande Casteele K., Martens AL, Hanselaer R., Gevaert L, Anal. Biochem, 131, 530—532 (1983).

379. Varghese G., Diwan A. AL, Anal. Biochem., 132, 481—483 (1983).

380. Vesterberg O, Gramsirup-Chrlstensen В., Electrophoresis 5 282—285 (1984).

381. Vitt S, V.f Vorob'eu M. M., Paskonova E. A, Saporovskaifa Af. Й, J. High Resol. Chromatogr. Chromatogr. Commun, 6, 158—160 (1983).

382. Wachslicht H.t Chrambach A, Anal. Biochem, 84, 533—538 (1978)

383. Waddell W. /, J. Lab. Clin. Med., 48, 311—314 (1956).

384. Wagner A. P, Psarrou E., Wagner L. P., Anal. Biochem, 129, 326—328

(1983) .

385. Wagner A. P., Psarrou E., Wagner L. P, Anal. Biochem, 137, 248—255

(1984) .

386. Wang C.-S, Smith R. L., Anal. Biochem, 63, 414—417 (1975).

387. Wang W.-T., Matsuura F., Sweeley С. C, Anal. Biochem, 134, 398—405 -(1983).

388. Warburg O., Christian W., Biochemische Z, 310, 384—421 (1941/42).

389. Ward D. A, Coffey F A, Biochemistry, 3, 1575—1577 (1964).

390. Ward D. N., Coffey J. A., Ray D. В., Lamkin W. AL, Anal. Biochem 14 243—252 (1966).

ЛИТЕРАТУРА

333

391. Watanabo Y„ Imai К., Anal. Chem., 55, 1786—1791 (1983).

392. Waierfleld AL D., Scrace G. 7, In: Biological/Biomedical Applications of Liquid Chromatography, Hawk G. L. (Ed.), Chromatographic Science Scries, vol. 18, Marcel Dekker, New York, Basel, 1981, pp. 135—158.

393. Waiters C„ Anal. Biochem., 88, 699—701 (1978).

394. Weiner S., Tishbee Л, J. Chromatogr., 213, 501—506 (1981).

395. Weinstein В., Methods Biochem., Anal., 14, 203—323 (1966).

396. Wessel D., Flugge U. /., Anal. Biochem, 138, 141 — 143 (1984).

397. Westall F„ Hesser //., Anal. Biochem., 61, 610—613 (1974).

398. Westley J., Lambeth /., Biochem. Biophys. Acta, 40, 364—366 (1960).

399. Whitaker /. R., Granum P. Anal. Biochem, 109, 156—159 (1980).

400. Whitaker /. R., Granum P. E.t Aasen G, Anal. Biochem, 108, 72—75 (1980).

401. Wilcox P. ?, Methods Enzvmol, 11, 63—76 (1967).

402. Williams R. /., Siggia S, Anal. Chem., 49, 2337—2342 (1977).

403. Wilkinson J. AL, J. Chrom. Sci, 16, 574—552 (1978).

404. Wilkinson AL, laccolucci G. A., Myers D. V.t Anal. Biochem, 70, 470— 478 (1976).

405. Wojtkowiak Z., Briggs R. C., Hnilica L. S, Anal. Biochem., 129, 486—489 (1983).

406. Wold F, Trends Biochem. Sci, 9, 256—257 (1984).

407. Wolj P., Maguire AL, Anal. Biochem, 129, 145—155 (1983).

408. Wray Д, Boulikas Т., Wray V. P.. Hancock Rt Anal. Biochem, 118, 197— 203 (1981).

409. Yamada S.t Itano H. Л., Biochem. Biophys. Acta, 130, 538—540 (1966).

410. Yamasaki R. В., Shinier D. Л, Feeney R. Anal Biochem, 111, 220— 226 (1981).

411. Yamasaki R. В., Osuga O. 7, Feeney R. Anal. Biochem, 126, 183— 189 (1982).

412. Yang C.-Y., Wakil S. /, Anal. Biochem, 137, 54—57 (1984).

413. Yang F C, Fujitaki J. AL, Smith R. Л, Anal. Biochem, 122, 360—363 (1982).

414. Yoshida Л., Anal. Biochem., 49, 320—325 (1972).

415. Yoshida H., Sumida Т., Masujima Т., Imai H., J. High Resol. Chromatogr. Chromatogr. Commun, 5, 509—511 (1982).

416. Yuen К. C. L, Johnson Т. K.. Denell R. E.t Consigli R. Л, Anal. Biochem, 126, 398—402 (1982).

417. Zamenhoff 5, Methods Enzvmol, 3, 696—704 (1957).

418. Zanetta J. P, Vincendon G, J. Chromatogr, 76, 91—99 (1973).

419. Ziegler KL, Melchert /, Lurken G, Nature (Lond.), 214, 404—405 (1967).

420. Zimmerman C. L.t Appella P, Pisano J. Anal. Biochem 75, 77—85 (1976).

421. Zinder O, Nikodijevic O., Hoffman P. G, Pollard H. В., J Biol Chem 251 2179—2181 (1976).

422. Zumwalt R. W., Kuo К. С. Т., Gehrke C. W. (Eds.), Amino Acid Analysis by Gas Chromatography, CRC Press, Cleveland, Ohio, 1986.

Глава 9

ЭНЛНТИОМЕРНЫЙ АНАЛИЗ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

С. ВАЙНШТЕЙН (S. WEINSTEIN, Department of Organic Chemistry, The Wcizmann Institute of Science. Rchovei, Israel), M X. ЭНГЕЛ (M. II. EN-GEL, School of Geology and Geophysics, The Uni-eersiiij of Oklahoma, Norman, OK 73019, U.S.A.), II. Э.ХАРЕ (P. E. HARE, Geophysical Laboratory. Carnegie Institution of Washington D.C, U.S.A.)

9.1. Введение

Разделение аминокислот на оптические изомеры методами хроматографии высокого разрешения представляет большой интерес во многих областях исследования. Развивалось это направление энаптиомерпого анализа в нескольких лабораториях параллельно с совершенствованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Было предложено проводить разделение аминокислот на энаптиомеры на полистирольпых |2| и полиакриламидпых |6] матрицах с ковалептно присоединенными к ним хиральиыми лигаидами, образующими комплексы с ионами двухвалепшон меди. Тот же принцип — попы металла в комплексе с хиральиыми лигаидами, но в подвижной фазе — был использован позднее в обращенно-фазовой хроматографии [4]. Описан эффек г и ни ы и и высокочувст вительиып метод анализа изомеров аминокислот в системе, где подвижной фазой служит водный раствор, содержащий комплекс Си (II)-ь-пролип, а стационарной фазой — катиопообмсииая смола или силика-гель с обращенной фазой. Однако таким способом осуществить полное разделе!]не па энаптиомеры всех аминокислот не удалось [3, 5], оно было достигнуто на их дапсильпых производных в двухколоиочной системе [8].

Дальнейший прогресс в этой области связан с синтезом серии N,N-:uia л к ил аминокислот и их применении в комплексах с ионами Си (II) в качестве хиральпых фаз [9, 10]. В приведенной ниже методике методом ОФ-ВЭЖХ на хиральпом комплексе Ы,Ь[-ди-АЫ]рош1Л-ь-алапипацетат меди (Cu-ДПА) удалось раздели ib па энаптиомеры все белковые аминокислоты. Для улучшения разрешения хроматографию проводят в две стадии. Па первой стадии смесь аминокислот предварительно разделяется на группы па катионообменной колонке в условиях, аналогичных используемым в обычном аминокислотном анализаторе, по в летучих буферах. Затем после упаривания растворителя к а ж-

9 2. РЕАГЕНТЫ

335

дая группа подвергается эпаптиомерному анализу на ОФ-колоп-ке с хиральной подвижной фазой. Обработка компонентов смеси после выхода с колонки о-фталевым альдегидом в присутствии меркаптоэтапола (ОФА-реагепт) позволяет обнаруживать по флуоресценции субианомолярпые количества аминокислот. Про-лип не реагирует с ОФА и можег быть идентифицирован по реакции с пингндрипом [7]. Анализ цистеипа и цистииа проводится после их окисления до цисгеиповой кислоты, которая в описываемой методике хороню разрешается с другими аминокислотами.

9.2. Реагенты

Для анализа используют коммерчески доступные реагенты, растворители перегоняют, воду очищают двойной перегонкой. Ы,1^-Ди-я-пропил-ь-алаини синтезируют по несколько видоизмененной методике [1].

9.2.1. Синтез N, Ы-ди-«-пропил-ь-аланина

Суспендируют 0,2 моль (17,8 г) L-алашша (Sigma) в 200 мл этанола. Добавляют 3 г катализатора — палладии (10%) па акIнвироваииом угле (Fluka) и 43 мл пропиопового альдегида (Flnka). Смесь гидрируют 48 ч при 40—50°С под исходным давлением водорода —3,5 атм. Катализатор удаляют па стеклянном фильтре и фильтрат упаривают досуха. Продукт реакции ХЛт-ди-«-иропил-ь-а.та1шп перскристаллизовывают из хлороформа. Степень чистоты ¦ реагента контролируют методом тонкослойной хроматографии, ядерного магнитного резонанса п элементного анализа.

9.2.2. Растворы для ВЭЖХ

Буфер I. К 0,2 М раствору пиридина добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 3,4.

Буфер II. К 0,4 М раствору пиридина добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 5,3.

Реагент ОФА. 30 г борной кислоты растворяют в 1 л воды и добавляют КОМ до рН 9,5—10 и затем 2,5 г ЭДТА. Растворяют 1,0 г о-фталевого альдегида и 0,5 мл меркаптоэтапола в 10 мл метанола и медленно приливают этот раствор к первому при размешивании. Полученную смесь фптьтргюг через фильтр МППроге (0,22 мкм).

Хиральная мобильная фаза. 8 мМ (1,384 г) Г\Ш-ди-н-про-пил-ь-алапипа и 4 мМ (0,8 г) ацетата меди растворяют в 1 л воды (рН 5,3—5,5), раствор фильтруют через тот же фильтр и деаэрируют в вакууме.

336

9. ЭПАНТИОМЕРНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Таблица 9.1. Разделение аминокислот методом ВЭЖХ. Колонка: Spherisorb LC-18, 5 мкм, 150X4,6 мм, хиральная добавка: Си(.\,Ы-ди-я-пронил-Ь-аланин)2

Аминокислота

Время удерживании3, мин

Аминокислота

Время удерживания, мин

Подвижная фаза: вода; скорость потока 0,2 мл/мин6

D-Lys 3,4

L-Lys 4,4

n-Arg 5,2

L-Arg 8,4

Gly 6,4

o-Ser 6,8

L-Ser 8,4

D-Ala 7,0

L-Ala 10,0

D-Thr 7,8

L-Thr 9,6

n-His 10,4

L-His 13,8

o-Cya 12,3

L-Cya 13,6

D-Asp 21,0

L-Asp 24,6

D-Val 22,6

L-Val 54,2

D-Glu 40,0

L-Glu 70,2

D-Met 49,0

L-Met 86,6

Подвижная фаза: 1 %-ный водный ацетопитрил; скорость потока 0,2 мл/мин6

Glv 3,8

п-А1а 4,2

L-Ala 6,2

и -Val 15,4

L-Val 38,6

о-Met 34,6

L-Met 62,6

n-Ile 45,4

l.-Ilc 121 ,4

n-Leu 49,0

L-Leu 112,6

Подвижная фаза: 14%-ный водный ацетопитрил; скорость потока 0,5 мл/мин"

D-Tyr 2,7

L-Tvr 3,5

D-Phc 14,7

L-Phe 20,3

п-Тгр 29,1

L-Trp 32,7

Подвижная фаза: 5%-ный водный ацетонитрил; скорость потока 0,25 мл/минг

п-А1а 2,5

L-Ala 3,1

D-Pro 4,5

L-Pro 10,5

Время удерживания определялось отдельно для каждой аминокислоты с момента выхода свободного объема колонки V0.

б Время выхода 5 мин, определялось по появлению сигнала растворителя на хроматограмме.

в Время выхода Vo 3,7 мин.

гА1а и Pro каждый в отдельности разделены на колонке (150X4,6 мм) LC-18 (фирмы Supelco), для обнаружения использовалась реакция с нингидрином, а также измерение оптической плотности при 570 нм (Ala) и 440 нм (Pro). Время выхода V0 5 мин.

9.3. ВЭЖХ

Смесь (по ~2 мг) каждой из рацемических аминокислот (табл. 9.1) растворяют в 10,0 мл воды. Вместо цистеина и цистина в смеси находится только цистеиновая кислота (Суа); пролин и гидроксипролин отсутствуют.

9.3. ВЭЖХ

Ala, Val, Gly, Met

337

Thr,Ser,6tu

CO

Q. О

n

О)

CI

с; о» x

О

10

20

30

40 Время, мин

J L

кислые нейтральные аминокислоты аминокислоты (группа 1) (группа 2)

нейтральные аминокислоты

(группа 3)

РИС. 9.1. Разделение кислых и нейтральных аминокислот на три группы на катионообменной колонке гз 0,2 М пиридин-ацетатном буфере, рН 3,4. Через 45 мин 0,4 М буфером, рН 5,3, элюируются Trp, Lys, His, Arg. Температура 50 °С; скорость потока 0,17 мл/мин [9]. (С разрешения Academic Press.)

9.3.1. Разделение на группы

Аминокислоты делят на 4 группы:

1) кислые: Суа, Asp, Thr, Ser, Glu;

2) нейтральные: Gly, Ala, Val, Met, Leu, He;

3) ароматические: Phe, Туг, Trp;

4) основные: Lys, His, Arg.

Вносят 20 мкл раствора аминокислот на колонку из нержавеющей стали (50x4,6 мм) с катионообменной смолой (5 мкм) типа полистиролдивинилбензолсульфокислота, уравновешенную буфером I. Первые три группы аминокислот, за исключением Trp, элюируют этим же буфером. На рис. 9.1 приведена хрома-тограмма и условия разделения. Буфер II используют для элюирования Trp, Lys, His и Arg. Элюат с колонки смешивается с ОФА-реагеитом, поступающим со скоростью 0,6 мл/мин, и попадает в реакционную ячейку в виде спирали (для завершения реакции достаточно времени прохождения спирали), а затем в флуоресцентный детектор (Waters, 420 АС). Первый прогон позволяет установить точные времена удерживания аминокислот. Затем процедуру повторяют в идентичных условиях, но без

22-703

338

9. ЭНЛНТИОМЕРНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ВЭЖХ

обработки компонентов реагентом и детектирования полученных производных. Аминокислоты собирают непосредственно на выходе с колонки в определенные временные интервалы, например кислые аминокислоты между 1 и 9 мин, нейтральные—10— 15 мин, другие аминокислоты — по отдельности, чтобы избежать больших объе мов буферов (Phe 20—24 мин; Туг 34—38 мин; Trp 62—66 мин, Lys 75—81 мин, His 84—89 мин, Arg 175— 188 мин). Фракции Trp, Туг и Phe объединяют; также поступают с фракциями His, Lys и Arg.

Для сокращения времени разделения исходная смесь аминокислот может быть разделена па колонке (50x2,0 мм) с использованием только буфера II (сразу от старта). Это приводит к более быстрому элюированию Trp, Lys, His и Arg. Все остальные аминокислоты элюируются совместно и далее могут быть разделены в буфере I.

Фракции элюата по группам аминокислот упаривают в токе азота и затем в течение 20 мин сушат в вакууме. Остаток растворяют в 200 мкл хиралыюй подвижной фазы для следующей стадии разделения.

9.3.2. Энантиомерный анализ

Аликвоту каждой фракции (20 мкл) вносят в колонку из нержавеющей стали (150X4,6 мм) с обращенной фазой Сфсри-сорб ЛС-18 и хиралыюй подвижной фазой, где индивидуальные аминокислогы разделяются па d- и L-изомеры. В случае необходимости к элюенту добавляют ацетопитрил для уменьшения времени удерживания. Определение аминокислот в элюате осуществляется так же, как па стадии катионообменной хроматографии. Времена удерживания приведены в табл. 9.1.

Хроматограммы и условия разделения энантномеров четырех групп аминокислот приведены па рис. 9.2—9.5. На специальных образцах, обогащенных ь- и о-формами, показано, что во всех случаях без исключения d-изомер сходит с колонки раньше L-изомера.

Кислая (Ser, Thr, Суа, Asp, Glu) и основная (Lys, Arg, His) группы элюируются водным раствором, содержащим хиральную добавку. Для группы, состоящей из нейтральных аминокислот (Gly, Ala, Val, Met, Leu, He), к подвижной фазе добавляют ацетопитрил (1%) для уменьшения времени удерживания. Третья группа (Phe, Туг, Trp) элюируется с добавлением 14% ацетонитрила.

Внутри каждой группы достигается полное разрешение эпаи-тиомеров всех аминокислот.

D- Ser

L-Ser

Asp D

11

D-Thr

L-Thr

' Cya 1 / / |

и

D-Glu

L-6lu

20 30 40 50

Время,мин

60

70

РИС

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
прокат проектора с экраном
Рекомендуем компанию Ренесанс - металлическая винтовая лестница - цена ниже, качество выше!
кресло ch v
В магазине KNSneva.ru 00MJ145 - доставка по Санкт-Петербургу и онлайн кредит "не выходя из дома" во всех городах северо-запада России!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2016)