химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

тического анализа [148].

1.3.1.3. Гель-фильтрация. Общие принципы гель-фильтрации нативных белков рассмотрены в разд. 1.2.2; хроматография в денатурирующих условиях не имеет существенных особенностей. В присутствии денатурирующих агентов (гуанидингидрохлорид, мочевина, ДСН) меняется конформация белковых молекул, что часто приводит к увеличению гидродинамического объема. Поскольку разделение идет по размерам молекул, меняются диапазон молекулярных масс, а также градуировочный график для конкретного геля. Например, в неденатурирующих условиях на сефарозе CL-6B можно разделить белки с М 104—4-Ю6; в денатурирующих условиях в присутствии гуанидингидрохлорида диапазон молекулярных масс составляет 3000—80 000 [8].

Показано, что при высокой концентрации гуанидин-HCl восстановленные белки приобретают конформацию статистического клубка. В качестве эмпирического метода определения молекулярных масс денатурированных белков рекомендуется использовать хроматографию в 6 М гуанидин-HCl на гелях агарозы,

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

33

ire сшитых поперечными связями (сефарозе, ультрогеле, биогеле А) [60, 111]. Главными недостатками этого метода являются продолжительность процесса (3—5 дней) и плохая устойчивость несшитой агарозы в присутствии 6 М гуанидин-HCl [ПО]. Сшитые агарозные гели (например, сефароза CL-6B) более устойчивы; в присутствии гуанидин-HCl свойства таких гелей остаются неизменными по крайней мере в течение года, а скорость элюирования может быть увеличена в 3—4 раза [8, 25, ПО]. Гель-фильтрация в присутствии гуанидин-HCl особенно важна при анализе гликопротеинов, поскольку в случае высокого содержания в белке углеводов электрофорез в ПААГ-ДСН дает ненадежные результаты. Хроматография на сефакриле S-200— эффективный метод определения молекулярных масс небольших полипептидов с М<30 000 [18]. К качеству гуанидин-HCl предъявляются высокие требования; рекомендуется использовать препарат квалификации «ос. ч.» фирмы Schwarz-Mann. В случае необходимости гуапидип-HCl очищают перекристаллизацией или готовят из гуанидипкарбопата [127].

При работе на большинстве гелей в качестве компонентов элюирующего буфера используется также 8 М мочевина или 0,1% ДСН. Показано, однако, что несшитые агарозные гели медленно разрушаются при высоких концентрациях мочевины. Элюирующий буфер (0,05 М фосфатный или 0,1 М аммоиийби-карбонатный) обычно имеет рН 7—8. При использовании мочевины в буфер добавляют 0,1 М хлорида натрия с целью уменьшить электростатическое взаимодействие между матрицей геля и заряженными группами полипептидиой цепи. Обнаружено [47], что в водных растворах мочевины самопроизвольно образуется циапат:

(NIbhCO NH4NCO

Накопление цианата идет с максимальной скоростью при рН>6, однако заметные количества цианата образуются и в кислой среде, даже при 0°С [71]. Кинетические исследования реакции цианата с аминогруппой белка показывают, что цианат и аминогруппа вступают в реакцию в иепротонировапной форме согласно уравнению

Н NH Н NH2

I II Hl° 'II II

НО но

Это согласуется с различиями в скорости реакции а-аминогруп-пы (р/(л~ 8) и е-аминогруппы (р/(л~10,7): при рН 7 скорость реакции а-аминогруппы в 100 раз выше [166]. в области рН<4 и рН>10 карбамилирование аминогрупп не

NH,

-N Н

с + н2о

II

о

3-703

34

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

идет [174]. Помимо аминогрупп цнанат вступает в реакцию с тиольпыми, карбонильными, имидазольпыми, фосфатными и реакциопиоспособпыми гидроксильиыми группами белков [166].

Здесь уместно напомнить, что иитактные дисульфидиые связи могут продолжать удерживать полипептидную цепь в свернутом состоянии даже при денатурации в 6 М гуанидип-HCl. В результате гидродинамический объем полипептидной цепи оказывается уменьшенным по сравнению с состоянием полной денатурации (с разрывом S—S-связей). Этот эффект становится более заметным по мере удлинения полипепгидиой цепи, увеличения числа дисульфидпых групп и размеров петель. В таких случаях следует проявлять известную осторожность в оценке результатов определения молекулярных масс. С целью контроля проводят хроматографнческий анализ после восстановления и ал-килировапня дисульфидпых мостиков. Сумма молекулярных масс отдельных подписитндпых цепей должна соогветсч вовать общей молекулярной массе исследуемого белка. Нсли после восстановления S—S-связей стадию алкилпроваппя опускают, хроматография должна проводиться при рН 3 (в условиях, когда SH-содержащие цени достаточно устойчивы при комнатной температуре) пли в присутствии восстановителя, например 2-меркаптоэтапола (0,1 моль/л). Присутствие восстанавливающего агента часю мешает определению белков в элюате при 280 им, поскольку в этой области поглощает окисленная форма 2-меркапгоэгаиола. В таком случае применяют другие методы анализа, например перед хроматографией в белок вводят радиоактивную метку (разд. 1.4.5.1).

Получение суанидингидрохлорида [127], 1 кг гуанидннкарбоната растворяют при 40 0С в 2 л воды, прибавляют 3 л этанола и выдерживают на холоду в течение нескольких часов. Кристаллическую массу отделяют фильтрованием, дважды промывают водным этанолом (этанол : вода =-2 : 1), затем этанолом. Перекристаллнзованный гуанидинкарбонат (выход 880 г) растворяют в 500 мл воды, раствор охлаждают на ледяной бане и при перемешивании медленно прибавляют к суспензии 6 М НС1 до достижения в растворе рН 4 (эта величина рН должна сохраняться в течение 12 ч). Полученный гуанидингндрохлорид очищают путем дробной кристаллизации. Часть раствора упаривают при 40 °С до начала кристаллизации, выдерживают на холоду, кристаллы отделяют фильтрованием, маточный раствор объединяют с очередной порцией основного раствора и повторяют указанную последовательность операций. Конечный продукт — 780 г гуанпдиигидрохлорида — может быть вторично нерекристаллизован из воды по описанной методике пли из метанола. В случае необходимости для удаления окрашенных примесей используют активированный уголь. Оптическая плотность 6 М раствора гуанпдиигидрохлорида при 225 им должна составлять 0,1.

Приготовление растворов мочевины. Как уже отмечалось, при хранении растворов мочевины образуется циаиат, причем скорость образования циана-та зависит от рН раствора [71]. Поэтому непосредственно перед использованием растворы мочевины обязательно надо пропускать через колонку со смешанным нонообменником (например, через колонку с элгалитом). Контроль раствора мочевины осуществляют путем измерений электропроводности,

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

35

которая должна иметь величину ^2 мкСм. Для связывания цианата в растворы мочевины иногда добавляют амины, например трис [75] пли этанол-амин [41].

1.3 .1 А. Количественный анализ N-концевых аминокислот. Определение N-копцевых аминокислот используется для доказательства высокой степени очистки олигомера (мономера) или отдельных полипеитидных цепей. По данным количественного анализа N-копцевых аминокислот можно получить представление о молекулярной массе исходного белка или рассчитать число полипептидпых цепей. Например, если содержание N-концевой аминокислоты окажется в 2 раза выше теоретического или будут обнаружены две различные аминокислоты в эквимолярном соотношении, можно сделать вывод, что олигомер состоит из двух различных пептидов. При этом предполагают, что N-концевые аминокислоты не заблокированы, например из-за карбамиди-рования в растворах мочевины. Некоторые аминокислоты, например аспарагии, глутамии, серии, неустойчивы в условиях деградации по Эдману; в этом случае при интерпретации результатов вводят поправки.

Обычно используют прямой вариант метода Эдмана, ФТГ-амипокислоты определяют количественно по поглощению при 269 нм в этаноле [55]. При количественном определении ФТГ-аминокислот рекомендуется провести предварительную очистку модифицированного белка, а затем гидролиз и экстракцию.

Разработана методика, где метод изотопного разбавления используется в сочетании с деградацией по Эдману [15]. Согласно одному из вариантов этого метода, проводят одну стадию деградации по Эдману, в ходе которой блокируются е-ами-ногруппы остатков лизина, а затем конденсируют второй N-кои-певой остаток с реагентом, содержащим радиоактивную метку [94]. В этом случае пет необходимости экстрагировать производное N-копцезой аминокислоты. Для количественного определения белка в образце используют аминокислотный анализ, а в аликвотных пробах гидролизата определяют радиоактивность. Для определения удельной радиоактивности [14С]ФИТЦ образец очищенного пептида модифицируют аналогичным образом.

С целью повышения растворимости белка на первой стадии можно использовать сульфофенилизотиоциаиат [23] или на второй стадии ввести в буфер ДСН (1%). В случае пенообразова-ния из-за присутствия ДСН на стадии экстракции бензолом добавляют каплю «-октаиола.

Количественное определение N-концевых аминокислот [15]. Количество белка в образце определяют с помощью аминокислотного анализа. Точную навеску (W в миллиграммах) лио-

36

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

фильно высушенного обессоленного белка конденсируют с ФИТЦ с известной удельной радиоактивностью, удаляют избыток реагента, проводят стадии отщепления и циклизации. Полученную таким путем меченую ФТГ-амипокислоту смешивают с известным количеством (iV, в молях) немеченой ФТГ-аминокислотой и определяют удельную радиоактивность. Молекулярную массу Мг субъединицы рассчитывают по формуле

Si и S2 (Ки-моль-1)—удельная радиоактивность ФИТЦ и ФТГ-амипокислоты соответственно.

Деградация по Эдману. К аликвотпой части (400 мкл) раствора белка (~10 мг/мл) известной концентрации прибавляют 600 мкл пиридина, 47 мкл N-днметилаллиламнна и ~3 мкл безводной трифтороуксусной кислоты, рН реакционной смеси 9,5. Затем добавляют 10 мкл фсппл-г'С-изотиоцианата известной удельной радиоактивности и смесь инкубируют в атмосфере азота при 40 X в течение 1,5 ч. Избыток реагента экстрагируют бензолом (2 млХЗ), водную фазу высушивают лпофильно. К сухому остатку прибавляют 1 мл воды и ледяную уксусную кислоту, насыщенную сухим HCI, инкубируют при 40 °С в течение 2 ч. (Методику проведения деградации по Эдману см. также в гл. 12.)

Выделение и идентификация ФТГ-аминокислоты. К полученной реакционной смеси прибавляют известное количество немеченого производного N-коп-цевой аминокислоты, экстрагируют этилацетатом (2 млХ2), экстракты объединяют и высушивают досуха. ФТГ-аминокислоту выделяют с помощью хроматографии на бумаге ватман SG81 в двух системах растворителей. Вначале используют систему хлороформ — метанол (9:1); зону, соответствующую положению ФТГ-аминокислоты, элюируют этилацетатом. Вторично хроматографируют в хлороформе, зону экстрагируют этанолом. Выделять ФТГ-аминокислоты можно также с помощью ВЭЖХ (гл. 13). Концентрацию ФТГ-аминокислоты в этаноле определяют, измеряя оптическую плотность /I при 269 нм (е = 16 000 М-1-см-1) против этанола. Степень чистоты определяют по отношению Л24з/Л2б9 (для эталона это отношение равно 0,39). Для определения радиоактивности отбирают алпквотные части (~3 мкл).

Определение удельной радиоактивности фенилизотиоцианата. Меченый ФИТЦ (0,5 мКи) разбавляют немеченым реагентом до удельной радиоактивности 0,4 Ки/моль. Лликвотную часть (2 мкл) реагента прибавляют к образцу N-концевой аминокислоты (2 мг) в 1 мл водного пиридина (1:1) п инкубируют в атмосфере азота при 50 °С в течение 35 мин. Избыток ФИТЦ экстрагируют бензолом (2 млХ4), водную фазу высушивают лиофильно. Циклизацию и перегруппировку в фенилтиогидантоин проводят путем инкубации в 1 М НС1 (500 мкл) при 80 °С в течение 10 мин. ФТГ-аминокислоту экстрагируют этилацетатом (2 млХ2), а затем очищают хроматографией на бумаге ватман SG81 или с помощью ВЭЖХ. Содержание ФТГ-аминокислоты определяют по оптической плотности при 269 нм, затем измеряют число импульсов в аликвотной части и рассчитывают удельную радиоактивность. Среднюю удельную радиоактивность рассчитывают на основании анализа четырех образцов ФТГ-аминокислоты.

Сцинтилляционные жидкости. Для приготовления жидкого сцинтиллятора 5 г 2-(4-грег-бутилфенил)-5-(4-бифенил)окса-3,4-диазола (бутил-ФБД) растворяют в 5 л толуола (высушенного над натриевой проволокой). Образцы ФТГ-аминокислоты в 3 мл этанола смешивают с 15 мл жидкого сцинтплля-

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

37

тора н регистрируют на счетчике радиоактивности до накопления 40 ООО имп. Радиоактивность образца рассчитывают по формуле Dn=NH/E, где NH — наблюдаемое число импульсов, а — эффективность счета (для данного сцин-тиллятора и счетчика радиоактивности). Е находят по градуировочному графику, E^NcjDc, где Nc имп./мин (регистрируется прибором), a Dc — расп./мин эталона. Эффективность счета р-излучения радиоактивного атома углерода составляет 92—95%.

1.3.2. Методы выделения мономеров

Выделение и очистку мономеров с целью определения аминокислотного состава, получения пептидных карт или секвениро-ваиия осуществляют с помощью препаративных методов химии белка.

При работе с микроколичествами материала в белок вводят радиоактивную метку и пользуются аналитическими методами. Метка может быть внутренней (т. е. введенной in vivo) [14, 161] или присоединена химическими методами по функциональным группам аминокислот (как указано в разд. 1.4.5.1).

У.3.2.1. Разделение субъединиц по размерам. Если субъединицы заметно различаются по молекулярной массе, их выделяют с помощью гель-фильтрации в присутствии денатурирующих агентов. Основы и методика гель-фильтрации на аналитическом уровне рассмотрены в разд. 1.3.1.3; при фракционировании на препаративном уровне они существенно не меняются. Хроматографию, как правило, проводят на препаративных колонках диаметром 2,5ч-5 см и длиной 100 см, рассчитанных на нагрузку от 500 мг до нескольких граммов белка.

Для разделения используют легколетучие буферные системы, в частности разбавленные растворы аммиака, уксусную и муравьиную кислоты, что позволяет выделять белки из элюатов с помощью лиофильного высушивания. Препараты для аминокислотного анализа рекомендуется получать гель-фильтрацией в 50—75%-ной муравьиной кислоте. Муравьиная кислота, сильный денатурирующий и солюбилизирующий агент, вызывает разрушение носителей на основе полисахаридной матрицы; в частности, не рекомендуется оставлять сефадексы в контакте с 75%-ной муравьиной кислотой на срок более трех недель.

Колонки изготовляют из стекла, соединительные шланги — из тефлона (рис. 1.3). Белки выделяют из элюата с помощью лиофильного высушивания в вакуумной системе с ловушками, предварительно фракции разбавляют до концентрации муравьиной кислоты —10%. Принято считать, что муравьиная кислота не гидролизует пептидные связи, за исключением лабильной связи Asp-Pro.

При работе с количествами 2—3 мг и, возможно, до 100 мг определенным преимуществом перед традиционной гель-филь-

38

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

стеклянные шарики

мертвый объем

капилляр для соединения с тефлоновой трубкой

пористая

стеклянная

пластинка(№1)

сферический шлиф

РИС. 1.3. Стеклянная хроматографическая колонка, предназнач

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
футболки в томске
где купить креповую бумагу
мультимедиа для авто с навигацией тв тюнером
курсы визажиста метро курская

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)