химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

еть в виду, однако, что не все гли-копротеины содержат гексозамин и значительное количество углеводов разрушается .в жестких условиях гидролиза, используемого при аминокислотном анализе.

Наиболее часто типичные гликопротеипы млекопитающих содержат следующие моносахариды: ь-фукозу (6-дезокси-ь-га-лактоза), D-маннозу, D-галактозу, Ы-ацетил-о-глюкозамии (2-ацетамид-2-дезокси-о-глюкоза) и сиаловые кислоты (различные производные нейраминовой кислоты). В состав некоторых гликопротеинов входят D-глюкоза или Ы-ацетил-Б-галактозамип (2-ацетамид-2-дезокси-о-галактоза). Наилучшие результаты для разделения, идентификации и количественного определения этих семи моносахаридов достигаются с помощью газожидкостной хроматографии. Существует два основных метода модификации Сахаров для последующего анализа газожидкостной хроматографией: альдит-ацетатный и метил гликозид-триметил сил ильный. Первый включает водный кислый гидролиз с последующим восстановлением образующихся альдоз до соответствующих аль-дитов и их ацетилирование; второй основан на применении метанолиза, приводящего к образованию метилгликозидов и метиловых эфиров сиаловых кислот, которые затем превращаются в триметилсилильпые производные.

Следует иметь в виду, что белки, для которых в качестве стадии очистки использовались колонки с сефадексом, могут содержать глюкозу в качестве примеси.

3.22.2. Метилгликозид-триметилсилильный метод

В сотрудничестве с Дж. Клампом (Z. Clamp)

Метод разработан в лаборатории автора и подробно описывается ниже.

Метанояиз. Используют 1,0 М НС1 в сухом метаноле, приготовленном перегонкой над реактивом Гриньяра. Сухой газообразный IIC1 из баллона (BDHLtd.) пропускают в 250 мл метанола, находящегося в ледяной бане. При умеренной скорости подачи газа за 15 мин достигается концентрация НС1>1,0 моль/л, поэтому раствор затем разбавляется сухим метанолом до концентрации 1 моль/л. Молярность обычно определяется титрованием алик-воты раствора гидроксидом натрия. Затем раствор НС1 в метаноле разливают в 10-мл ампулы, которые продувают азотом, запаивают и хранят при —20 °С.

Количество гликопротеина, необходимое для анализа, определяется содержанием в нем углеводов и в оптимальном варианте составляет 25—• 125 нмоль каждого моносахарида. При исследовании нового белка обычно

8.22. УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ

319

берутся пробы по 1—2 мг, что при обычном (среднем) содержании углеводов дает достоверные результаты. Пробу белка (гликопротеина) с введенными внутренними стандартами — маннитом (100 нмоль) и персеитом (100 нмоль) ¦—помещают в ампулу на 2 мл и высушивают. К сухому остатку приливают 0,5 мл НС1 в метаноле, продувают азотом, запаивают и нагревают 24 ч при 85 °С.

По окончании метанолиза смесь нейтрализуют карбонатом серебра, тон-корастертый порошок которого добавляют небольшими порциями, контролируя рН среды с помощью индикаторной бумаги с узкими интервалами значений рП.

N-Ацети.'Шрование. В процессе метанолиза происходит частичное деаце-тилирование N-ацетилгексозаминов. Для бокирования освободившихся групп требуется дополнительное ацетилирование, которое осуществляется добавлением 0,1 мл уксусного ангидрида к нейтрализованной реакционной смеси, что одновременно препятствует адсорбции Сахаров на частицах хлорид-карбоната серебра. Смесь оставляют стоять 6 ч и затем центрифугируют. Супернатант переносят в 5 мл грушевидную колбу. К остатку в ампуле добавляют 0,5 мл метанола, перемешивают, центрифугируют и надосадочную жидкость также переносят в ампулу. Процедуру повторяют дважды и объединенные растворы упаривают при 35 °С. Очень важно при этом тщательно удалить следы уксусного ангидрида, поэтому при сохранении характерного запаха к остатку еще раз приливают метанол и вновь высушивают. После добавления третьего внутреннего стандарта — арабита (50 нмоль в метаноле)—вновь упаривают смесь при нагревании. В реакционной колбе таким образом находятся метиловые эфиры метилгликозидов моносахаридов, внутренние стандарты — арабит, маннит и персеит в смеси с некоторыми аминокислотами и пептидами, образовавшимися в результате разрушения полипептидной цепи и не мешающими дальнейшему анализу. На этой стадии высушенный образец может храниться в вакуумном эксикаторе над пентаоксидом фосфора до ана тиза.

Триметилсилилирование. Свободные гидроксильные группы Сахаров должны быть защищены перед проведением газовой хроматографии и триметилсилилирование является для этого идеальной процедурой. Реакция протекает быстро и количественно, при комнатной температуре, а введение большого числа метильных групп приводит к повышению чувствительности определения с помощью пламенно-ионизационного детектора. В качестве реагента используют смесь триметилхлоросилан — гексаметилдисилазан — пиридин (1 : 1 :5). Готовят ее еженедельно и хранят в плотно закрытом сосуде. При стоянии возможно образование небольшого количества хлорида аммония, который удаляют центрифугированием перед использованием реагента. К сухому образцу прибавляют 0,05 мл смеси реагентов и оставляют на 30 мин при комнатной температуре без доступа влаги (можно использовать «сухую» камеру). Затем реакционную смесь центрифугируют и 1—5 мкл су-пернатанта вводят в газовый хроматограф.

Газожидкостная хроматография. Из практического опыта следует, что большинство проблем, встречающихся при использовании метода газовой хроматографии, связано с несоблюдением требований к набивке колонки. Здесь важно соблюдать каждое, даже пусть мелкое указание. Используют стеклянные колонки размером 2 мХ2—3 мм (внутренний диаметр). Упаковка— высококачественный диатомит, промытый кислотой и силанизированный, покрытый 3—4% фазы SE-30. Соответствующие материалы поставляют ряд фирм. После инжекции включают программу нагревания от 120 до 210 °С со скоростью 1 град/мин.

Для вычисления поправочных коэффициентов по внутренним стандартам через колонку по полной программе пропускают смесь моносахаридов. С нейтральными гексозами обычно не возникает проблем, но полярные сахара — N-ацетилгексозамины и сналовые кислоты — выступают прямо-таки как чув

320

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ствительные индикаторы эффективности работы колонки. Пики Сахаров должны быть строго симметричны, появление небольших или размытых пиков свидетельствует о плохом состоянии колонки.

Для приведения колонки в рабочий режим периодически по нескольку часов через нее пропускают смесь для триметилсилилирования в медленном потоке азота при 120°С. В зависимости от исходного состояния колонки для этого может потребоваться несколько дней или даже недель, процесс можно ускорить пропусканием через определенные интервалы времени смеси саха-ров-стандартов. Подробности метода описаны в работах [25, 52, 67, 68, 70, 711.

8.22.3. Определение уроновых кислот, гексозаминов и галактозы гликозаминогликанов метилгликозид-триметилсилильным методом [98]

Производные углеводов приготовлены по модифицированной методике [70] {см. также предыдущий раздел).

Газожидкостная хроматография. Колонка из плавленного кварца (25 мХ

tm

Х0,32 мм) с жидкой фазой CP-^Sil5 (фирма Chrompak); пламенно-ионизационный детектор; скорости потоков газа-носителя (N2) 0,7 мл/мин, газа-ускорителя к детектору 30 мл/мин; температура ввода 22°С, температура детектора 280 °С; температурная программа от 135 до 215 °С, 1 град/мин. Разделение всех пертриметилсилильных производных метилгликозидов, включая арабит, маннит, маннозу, глюкозу (2 пика) и галактозу (4 пика), достигается менее чем за 60 мин. Выходы производных моносахаридов для всех изученных гликозаминогликанов >87% (в расчете на гексозамин).

¦8.22.4, Чувствительный метилгликозид-триметилсилильный метод [53]

Образец гликопротеина (0,5—10 мкг) или стандарта-углевода (0,1 — 1 нмоль) высушивают над Р5О5 в вакууме в сосуде объемом 100 мкл типа PeactiviaL В качестве внутреннего стандарта может быть использован мезо-инозит. Добавляют сухой раствор НС1 в метаноле (40 мкл, 0,625 моль/л) и метилацетат (10 мкл). Закрывают сосуд пробкой с тефлоновой прокладкой, перемешивают на вибраторе и выдерживают 16 ч при 70 °С. Охлаждают. Добавляют трег-бутиловый спирт (10 мкл) и высушивают в потоке азота, не содержащего следов кислорода.

N-Ацетилирование. К остатку при перемешивании последовательно добавляют метанол (50 мкл), пиридин (5 мкл), уксусный ангидрид (5 мкл) и оставляют на 15 мин. Тщательно высушивают сначала в потоке азота, а затем в вакууме над Р205. Силилируют добавлением 20 мкл силилирующего агента ((Sylon НТР, фирма Supelco). Перемешивают на вибромешалке и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Высушивают. Остаток немедленно растворяют в 14 мкл гексана и наносят все количество образца на колонку газожидкостного хроматографа.

Газожидкостная хроматография. Капиллярная колонка из плавленного кварца WCOT (25 мХ0,32 мм) с жидкой фазой CP-Sil 5 (фирма Chrompak); температурная программа: нагревание 140 °С в течение 12 мин, затем повышение температуры со скоростью 8 град/мин до 260 °С; пламенно-ионизационный детектор.

Разделение 29 ТМС-производных простых Сахаров, аминосахаров и уроновых кислот достигнуто менее чем за 16 мин. Чувствительность <100 пмоль для каждого пккч.

8.22. УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ

321

8.22.5. Метод газовой хроматографии — масс-спектрометрии

[224]

Интактные гликопротеины метилируют, гидролизуют, восстанавливают и аце-тилируют. После разделения колоночной хроматографией полученные производные Сахаров анализируют методом масс-спектрометрии. См. обзор [250] по применению ГХ, ВЭЖХ и масс-спектрометрии в анализе углеводных комплексов.

8.22.6. Определение нейтральных Сахаров и аминосахаров в виде альдитацетатов методом ГЖХ [155]

Методика быстрая и простая в экспериментальном отношении. Аминосахара предварительно дезаминируют обработкой азотистой кислотой, в качестве главных продуктов при этом образуются 2,5-ангидроманноза (из глюкозами-па), 2,5-ангидроталоза (из галактозамина) и глюкоза (из маннозамина). Альдитацетаты, приготовленные непосредственно из аминосахаров, имеют значительно большие времена удерживания по сравнению с этими же величинами для производных нейтральных Сахаров на обычно используемых колонках.

Дезаминированис. К водному раствору образца (0,1 мл), содержащему до 2 мг аминосахара добавляют 100 мг твердого нитрита натрия. Охлаждают смесь во льду и прибавляют 0,1 мл 9 М серной кислоты, выдерживают 5 мин и затем оставляют постепенно нагреваться до комнатной температуры. Через 25 мин подщелачивают раствор 0,2 мл 15 М водного аммиака, затем восстанавливают и алкилируют по методу, описанному в работе [29].

Восстановление. К 0,1 мл раствора сахара в 1 М аммиаке добавляют 1 мл раствора борогндрида натрия (2%, масс./об.) в безводном диметил-сульфоксиде. Выдерживают 90 мин при 40 °С, избыток борогндрида разрушают добавлением 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.

Ацетилирование. К восстановленному моносахариду добавляют катализатор 1-метилнмпдазол (0,2 мл) и затем уксусный ангидрид (2 мл). Перемешивают. Оставляют при комнатной температуре на 10 мин и затем приливают 5 мл воды для разрушения избытка уксусного ангидрида. По охлаждении добавляют 1 мл днхлороэтана, перемешивают. После разделения фаз отделяют нижний слой для анализа методом ГЖХ. Вводят 2 мкл на колонку, остаток хранят при —20 °С.

Газожидкостная хроматография. Стеклянная капиллярная колонка SCOT (28,5 мХ0,5 мм) с жидкой фазой Silar ЮС. Температурная программа: нагревание до 190 °С за 4 мин, а затем до 250 °С со скоростью 4 град/мин.

Пятнадцать альдитацетатов дезаминированных аминосахаров были разделены менее чем за 20 мин. Метод применялся к анализу хитина и гликопротеинов.

8.22.7. Определение альдитов тонкослойной и газожидкостной хроматографией [387]

Восстановленные и перметнлированные олигосахариды (1—2 мг, содержащие до 15 остатков моносахаров) были разделены на пластинках с тонким слоем енликагеля 60 TLC (250 мкм, фирма Merck) без предварительной их активации в системе бензол — метанол (16:1 или 10:1). Нанесение образца в виде полосы и хроматография дважды в камерах, стенки которых изнутри (для полноты насыщения) обложены смоченной растворителями фильтровальной бумагой. Для обнаружения использовали опрыскивание 0,5%-ным

''1—703

322

S. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

раствором орцина в 2 М серной кислоте. Чувствительность 0,5 мкг сахара.

Определяющими факторами при разделении дпсахарпдов являются положение гликозидной связи, конфигурация аномера и природа сахара.

Газожидкостная хроматография. Капиллярная колонка из плавленого кварца (12 мХ0,25 мм), стенки которой покрыты химически связанной фазой DB-1 (слон 0,1 мкм, J. and \V. Scientific); газ-носитель — гелий, линейная скорость 0,37 см/с; температурная программа: нагревание от 150 СС до 330 °С со скоростью 5 грнд/мнп. Чувствительность 30 иг для софорозы (GIepi-2Gle).

3.22.8. Определение глюкозамина, галактозамина,

триптофана и лизиноаланина на аминокислотном анализаторе

[184]

Условия гидролиза аминос ахарпв. Гидролизуют в вакууме 4 М HCI при 100°С, 5 ч. Высушивают. Растворяют в 3 мл 2%-ного N-этнлморфолинацета-та (рН 9) п пропускают через колонку (50X9 мм) со смолой дауэкс 2-Х4-, уравновешенную 1%-пым N-этилморфолинацетатом (рИ 90) для удаления пептидов ,uiv[iix продчжтои гидролиза, мог\щпх помещать авали*v аминосахаров |Ю8|.' "

Собирают первые 2(1 мл ^люага с колонки, добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты н 100 мл 50%-ного глицерина в этаноле |93|; высушивают (глицерин снижает возможные потерн за счет адсорбции на поверхности стекла). Растворяют остаток в воде. Высушивают и снова растворяют в воде. Высушивают, для затру*кп на колонку растворяют в буфере Б (см. ниже), содержащем 0,4'о тнодшмиколм.

Условия гидролиза триптофана. Проводят щелочной ['ндролнз (4,8 УК ХаОП) с 25 мг крахмала в присутствии К) мкл 3 -ноги октанола 1 в тол\и ле (|lti8|; см. также ра„и. 8.7.1.1.) п 5 метплгрипго(|>ана в качесп»е nnwpen него стандарта. Исполыуют полипропиленовые нробиркп с завпнчпвающп мпся крышками \ ^плотиптел ьпые кольца удаляют) (фирма Vanguard International) в качестве вкладышей в стеклянные пробирки (150x18 мм). Пробирки запаивают в вакууме и naipcBaior 21 ч при 128°С в термостате. Охлаждают, пеГп ради\\ют добавлением 420 мкл охлажденной во льду 6 У\ 1ICI, разбавленной до 5,0 мл буфером /\ содержащим 0,1% тпоглпколята. Центрифугируют 4 мни при 20 000 ^ для удаления осадка перед нанесением на колонку.

Аминосахара могут быть разделены па коротких колонках со специальным буфером 1301| или па длинных колонках при малой скорое! и потока |108,1|. Часто '-л о бывает неудобным, и ниже описаны условия разделения на анализаторе Hec\mun 1I9CI с колонкой 0x260 мм, заполненной смолой W-3II и детекцией пипгндрпповой реакцией со стандартными буферами, используемыми в ?минокислотпых анализаторах.

Буфе pf-t.

А (готовят пз раствора с концентрацией, в [0 р-зд более высокой, р11 3.25). 0.2 УК цитрат натрия, содержащий 1% проналола-2, 0,25% тподн-гликоля и октановой кислоты, доведен до рН 3,33 10 ДА NaOH.

Б (готовит из раствора с концентрацией, в 5 раз более высокой, рП 4,

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
массаж простаты цена
ограждения для детских площадок
скорпионс афиша 2017
кому помог методжект?

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.10.2017)