химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

стинку реагентом Б (4 раза по 5 мин).

6. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре с антителами козы, к IgG кролика (фирма Serasource), разбавленными (1:40) реагентом В.

7. Промывают реагентом Б (4 раза по 5 мин).

8. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре с комплексом перок-сидаза-антипероксидаза (фирма Miles), разбавленным (1:40) реагентом В.

9. Промывают реагентом Б (3 раза по 5 мин).

10. Погружают в реагент Г для обнаружения пероксидазной активности.

8.20.4. Обнаружение с помощью комплекса серебра и антител

Полосы белков с гелей переносят на нитроцеллюлозную бумагу и окрашивают комплексом серебра. В этих условиях сохраняются антигенные детерминанты и индивидуальный белок может быть обнаружен но реакции со специфическими антителами с использованием блоттинга [416].

Электроперенос белков на нитроцеллюлозу. После разделения с помощью электрофореза по Леммли [207] перенос белков на нитроцеллюлозную бумагу осуществляется следующим образом. Нитроцеллюлозную бумагу смачивают в электрофоретическом буфере (24 мМ трис+192 мМ глицин + 20%-ный мер-

Ь.2\. БЕЛОК, ПРИСОЕДИНЕННЫЙ К ТВЕРДОМУ НОСИТЕЛЮ

313

каптоэтанол, рН 8,3) и затем кладут на гель. Образовавшийся «сандвич» гель — нитроцеллюлоза между двумя слоями бумаги ватман 3 ММ (также предварительно смоченной) помещают в электроблот (фирма ЕС Аррага-tur) так, чтобы гель располагался со стороны катода, а нитроцеллюлозная бумага — со стороны анода. Перенос проводят в течение 4 ч при 5,0 Вт и непрерывной циркуляции буфера.

Окрашивание солями серебра [281, 253].

1. Нитроцеллюлозную бумагу с белком промывают в течение ночи 0,01 М буфером трис-HCI, рН 7,4.

2. Промывают дважды по 5 мин дистиллированной водой.

3. Вымачивают в 100 мл ферро(П)-цианида калия (0,5%, масс./об.) 5 мин при встряхивании.

4. Ополаскивают дистиллированной водой.

5. Переносят в 100 мл раствора, содержащего 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония и 0,5 мл 37%-ного формальдегида. Встряхивают бумагу в этом растворе 20 мин.

6. Раствор нитратов сливают. Промывают бумагу дважды дистиллированной водой (10 с) и затем еще раз 3 мин свежеперегнанной водой.

7. Оставляют на ночь в 100 мл водного раствора, содержащего 3 г карбоната натрия и 0,25 мл 37%-ного формальдегида.

8. Промывают дважды (в сумме 15 мин) дистиллированной водой.

9. Помещают на 15 мин в 100 мл раствора, содержащего 1,4 мл концентрированного аммиака, 0,07 г NaOH и 0,2 г нитрата серебра.

10. Дважды ополаскивают дистиллированной водой.

11. Помещают в 100 мл раствора, содержащего 5,0 мг лимонной кислоты и 0,019% формальдегида. Белки проявляются в виде светлых полос на желто-коричневом фоне. В том случае, если исходный гель не содержал ДСН, полосы окрашиваются в желто-коричневый цвет и трудно отличимы от фона.

Обнаружение с помощью специфических антител. Буфер Л. i0 мМ трис —HCI (рН 7,5), содержащий 0,05 М NaCl, 2 мМЭДТА, 4% БСА (фракция V) и 0,1% азида натрия.

Буфер Б. 10 мМ трис — НС1 (рН 7,5), содержащий 0,05 М NaCl и 2 мМ ЭДТА.

1. Уравновешивают в течение ночи окрашенную комплексом серебра нитроцеллюлозную полоску в 0,01 М трис — НО (рН 7,4).

2. Переносят в буфер Л и оставляют на 24 ч при встряхивании.

3. Оставляют на 16 ч при встряхивании в свежем буфере Л, содержащем соответствующее количество антител.

4. Промывают буфером Б (5 раз по 10 мин).

5. Выдерживают в свежем буфере Л, содержащем 12ГТ-меченный белок А (фирма Sigma) (2-Ю5 имп./мин), в течение 3—4 ч.

6. Промывают буфером Б (6 раз по 10 мин).

7. Высушивают на воздухе.

8. Экспонируют с пленкой Kodak (X-Omat AR) с помощью усиливающего экрана при —70°С.

8.21. Определение белка, присоединенного к твердому носителю

В аффинной хроматографии и твердофазном секвенсировании часто бывает необходимо определить количество белка, связанного с инертной матрицей, такой, как агароза, декстраны и целлюлоза. В принципе это может быть сделано гидролизом образца с последующим определением общего азота, но в матрицу может быть включен небелковый азот, например когда исполь-

314

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

зуется активация с помощью BrCN или вводится N-содержащая «вставка». Количественный аминокислотный анализ образца белок — матрица часто бывает неудовлетворительным из-за наложения фона высокой концентрации отщепленных углеводов. В альтернативном варианте проводят дифференциальный количественный анализ белка, добавленного к матрице и оставшегося (после интенсивных промывок), не связавшегося белка. Однако существуют методы, позволяющие быстро проводить прямое количественное определение иммобилизованного белка. Они описываются ниже (см. также разд. 12.3.3).

8.21.1. Белок, связанный с матрицей

Современная модификация метода [240, 398]. К связанному с носителем белку добавляется известное количество Си2+. Количество ионов меди, образовавших комплекс с белком, адекватно количеству иммобилизованного белка. Определяется оно измерением свободных ионов меди по реакции с диэтнл-дитиокарбаматом. Реагенты.

A. 0,167 М NaOH, содержащий 3,4 г/л тетрагидрата KNa-тартрата. Б. К 590 мл реагента А добавляют 10 мл 0,2 М CuS04.

B. Диэтилдитиокарбамат натрия (0,1 г) растворяют в 100 мл 0,025%-ного раствора кристаллического БСА.

Г. Суспензия в деионизованной воде смолы AGI-X8 (фирмы Bio-Rad; 200—400 меш, в хлоридной форме) (200 мг/мл).

Методика, Смолу с иммобилизованным белком тщательно промывают для удаления солей и свободного белка. Пробу смолы центрифугируют 3 мин при 300 g и измеряют объем осадка. Добавляют деионизованную воду в соотношении 1:1 до 1 :4 в зависимости от количества связанного белка до получения тестообразной массы. Берут часть этой массы (0,01—0,10 мл) и переносят в пробирку. Разбавляют дистиллированной водой до 1,5 мл. Добавляют 1 мл смеси реагентов (3—6 мл реагента Б, разбавленного до 10 мл реагентом А). Перемешивают. После 15 мин стояния при комнатной температуре приливают 5 мл реагента В. Перемешивают и центрифугируют при низкой скорости. Измеряют поглощение при 446 или 486 нм окрашенной в темно-желтый цвет жидкости над осадком против кюветы с водой. С образцом необработанной смолы проводят контрольные измерения.

Градуировочный график, К 0,5 мл серии растворов, содержащих 50— 800 мкг белка-стандарта, добавляют 1 мл реагента Б. Смешивают и через 15 мин добавляют 1 мл смолы и 5 мл реагента В. Центрифугируют и измеряют поглощение, как описано выше.

8.21.2. Белок, связанный с сефарозой [127]

Реагент. Растворяют 50 г полиэтиленгликоля (М 20 000) в 50 мл воды.

Методика. Помещают суспензию сефароза — связанный белок (0,2 мл — 1 мл) в кварцевую кювету (с длиной пути луча 1 см). Добавляют раствор полиэтиленгликоля шприцем до конечного объема 3 мл. Перемешивают аккуратно, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Измеряют поглощение при 280 нм против образца смолы без белка.

Строят линейный график зависимости поглощения от концентрации белка. Чувствительность 20 мкг белка/0,5 мл сефарозы. Градуировочный график

&.2I. ЬЕЛОК, ПРИСОЕДИНЕННЫЙ К ТВЕРДОМУ НОСИТЕЛЮ

315

может быть построен по данным, полученным путем добавления увеличивающихся количеств белка к суспензии геля (использовалась апоглицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназа).

8.21.3. Определение аминогрупп на твердом носителе [214]

8.21.3.1. Пикратный метод. Реагенты.

Пикриновая кислота 0,1 М в метиленхлориде. ^М-диизопропилэтиленамин, перегнанный над СаН2.

Методика. Обрабатывают смолу ( — 50 мг) на стеклянной воронке (внутренний диаметр 1 см) дважды 2 мл раствора пикриновой кислоты, а затем промывают 40 мл чистого метиленхлорида. Добавляют г^Ы-диизопропилэти-ленамин (2 мл), затем метанол (2 мл) и вновь амин (2 мл), удаляя жидкость каждый раз путем отсасывания. Фракции промывок объединяют и разбавляют 95%-ным этанолом до 250 мл. Измеряют поглощение при 358 им. Для комплекса амин — пикрат е= 14500.

8.21.3.2. Метод титрования. Реагенты.

1 М НС1.

10%-ный триэтиламин в диметилформамиде (ДМФ).

Раствор нитрата ртути, оттитрованный по КО.

Бромофеноловый синий, 1%-ный раствор (масс/об.) в этаноле.

Днфенилкарбазон, 1%-ный (масс/об.) раствор в этаноле.

Методика. Промывают смолу ( — 50 мг) 20 мл 1 М НО, затем 40 мл деионизованной воды и 5 мл метанола.

Последовательно промывают 4 мл 10%-ного триэтиламина в ДМФ, 2 мл ДМФ и 4 мл метанола. Разбавляют объединенные промывки 20 мл воды и 80 мл этанола. Добавляют 5 капель бромофенолового синего и подкисляют смесь до образования желтой окраски осторожным прибавлением разбавленной (0,5 Л1) азотной кислоты. Добавляют 5 капель 1%-ного дифенилкарба-зона (индикатор) и титруют стандартным раствором нитрата ртути до появления розового окрашивания, свидетельствующего об избытке ионов ртути.

Замечание. Согласно работе [214], эти две методики оказались наиболее удобными (исследовались 4 методики) для определения аминогрупп на стеклянных шариках с определенным размером пор.

Определение аминогрупп с использованием реакции образования основания Шиффа с салициловым альдегидом с последующим измерением поглощения при 315 нм [62] дает лучшие результаты, чем с помощью 2-гидрокси-1-нафтальдегида [331J.

8.21.4. Определение аминогрупп на гидрофильных матрицах

Этот модифицированный вариант [4] метода [257] предназначен для гидрофильных матриц, поскольку реакция идет только в водной среде.

Определенный объем геля, содержащий не более 4—5 мкмоль аминогруппы разбавляют водой до 9 мл 0,1 М К2В4О7 и добавляют 1 мл 0,01 М тринитробензойной кислоты. Одновременно готовят раствор для сравнения из тех же объемов реагентов, но без геля. Позволяют гелю осесть или центрифугируют. I мл супернатанта разбавляют 5 мл 0,1 М К2В4О7 и добавляют 0,5 мл 0,03 М глицина. В «глухом» опыте вместо раствора глицина добавля-

316

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ют 0,5 мл воды. После 25 мин стояния при 25 °С приливают 10 мл холодного метанола и измеряют поглощение при 340 нм.

Концентрацию аминогрупп на геле определяют по разности поглощения исследуемого образца и контрольного раствора (е= 12400). Ошибка определения <10%.

3.21.5. Определение аминогрупп реакцией с хлоранилом [64, 65]

Это быстрый метод обнаружения свободных аминов и первичных или вторичных аминогрупп на смоле может быть использован для контроля полноты протекания реакции конденсации в твердофазном синтезе пептидов или при блокировании аминогрупп. Реагенты.

Насыщенный раствор хлоранила (2,3,5,6-тетрахлоро-1,4-бензохинон) в толуоле.

Методика.

1. Помещают в небольшую пробирку 1 мг смолы с пептидом.

2. Для обнаружения первичных аминогрупп добавляют 200 мкл ацет-альдегида, для вторичных — 200 мкл ацетона.

3. Приливают 50 мкл раствора хлоранила и размешивают 5 мин при комнатной температуре.

В присутствии свободных аминогрупп на поверхности смолы образуется зеленая или голубая окраска. Чувствительность 5 мкмоль/г смолы, т. е. приблизительно такая же, как у нингидриновой реакции.

8.21.6. Определение природы заместителя на смоле по окрашиванию [84]

Приливают 1 мл насыщенного раствора бората натрия к набухшим в воде (0,2—0,5 мл) агарозе или полиакриламиду. Добавляют 3 капли 3%-ного (масс./об.) водного раствора 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты и оставляют на 2 ч при комнатной температуре для завершения реакции. Незамещенные полимеры и смолы, содержащие карбоксильные и бромоацетильные группы, дают желтое окрашивание; производные, содержащие первичные алифатические амины, — оранжевое, ароматические амины — красно-оранжевое, гидра-зиды — темно-красное.

S.21.7. Колориметрическое определение карбодиимидов [181]

Реагенты.

2 М солянокислый пиридин и 1 М солянокислый 1,2-диаминоэтан (рН 7,0) для водорастворимых карбодиимидов (измерение при 400 нм). 2 М солянокислый пиридин и 1 М солянокислый пиперазин (рН 7,0) для водонерастворимых карбодиимидов (измерение при 420 нм).

Методика. Добавляют 0,1 мл водорастворимого карбодиимида к 1 мл раствора реагента. Через 20 мин измеряют поглощение при 400 нм. Водо-нерастворимый карбодиимид анализируют в диметилформиде с измерением поглощения при 420 нм.

Замечание. Реакция специфична для карбодиимидов, побочных продуктов при конденсации не образуется. Поглощение увеличивается линейно (в зависимости от концентрации карбодиимида) в течение 6 ч, в этих же ус-

8.22. УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ

317

ловиях строится градуировочный график. Диапазон определяемых концентраций 50 мкмоль/л — 50 ммоль/л, при меньших количествах для увеличения интенсивности окраски инкубируют смесь при 45 °С.

8.21.8. Флуорометрическое определение карбодиимида [60]

В пробирке со стеклянной пробкой смешивают 100 мкл исследуемого раствора и 100 мкл 20 мМ раствора тралс-аконитовой кислоты в безводном диоксане (высушенном и перегнанном над металлическим натрием). Нагревают 10 мин при 50 °С. Затем прибавляют 50 мкл 0,2 М пиридина в безводном диоксане и разбавляют 2,5 мл метанола. Измеряют флуоресценцию сразу же при длине волны возбуждающего света 400 нм и эмиссионного света — 490 нм против контрольного раствора. Зависимость интенсивности флуоресценции от количества карбодиимида линейна вплоть до 50 нмоль.

rpawc-Аконитовая кислота может быть использована при обнаружении карбодиимидов в качестве опрыскивающего реагента пластин в методе тонкослойной хроматографии.

8.22. Углеводсодержащие белки

8.22.1. Введение

В сотрудничестве с Дж. Клампом (7. Clamp)

Гликопротеины относятся к биополимерным молекулам, широко распространенным в живых организмах. Они могут быть внутри-и внеклеточными, присутствовать в качестве мембранных компонентов или в растворе, существовать в форме фибриллярных структур или типичных глобулярных белков. Более половины всех изученных детально белков содержат ковалентно присоединенные сахара, поэтому при исследовании нового белка всегда нужно иметь в виду, что это может быть гликопротеин.

Влияние присутствия углеводных компонентов на свойства белковой молекулы зависит от их содержания, которое варьирует в широких пределах от <1% до >80%. Присоединение к пептидной цепи среднего размера одной или двух небольших оли-госахаридных цепей, почти никак не сказывается на типично «белковых» свойствах соединений. В то же время гликопротеины с высоким содержанием Сахаров фактически ведут себя как полисахариды. Большинство гликопротеинов, однако, характеризуется содержанием углеводов, средним между этими двумя экстремальными случаями. Любой белок может быть «заподозрен» в своей принадлежности к гликопротеинам, особенно в случае аномального поведения при гель-фильтрации, ультра-центрифугировании, окрашивании, измерении ультрафиолетового поглощения и т. д.

Простейший способ подтверждения возникающего предположения, применяемый многими исследователями в этой обла-

318

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

сти,— поиск в образце с помощью аминокислотного анализа гексозаминов, наиболее распространенные из которых глюкоз-амии и галактозамии. Для большинства аминокислотных анализаторов прилагаемые руководства включают данные о поведении этих двух гексозаминов в применяемой системе, если же эти данные не приводятся, то нетрудно сделать это экспериментальным путем. Следует им

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Кликни, получи скидку по промокоду "Галактика" в KNS - HP 22kd - кредит онлайн по всей России и не выходя из дома!
стекляный журнальный столик купить
дизайн большого торгового зала ринка
купить потребительский уголок в москве недорого

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.03.2017)