химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

створе формальдегида (200 мл), приготовленного добавлением 2,5 мл 40%-ного формальдегида к 1 л воды.

4. Охлаждают до комнатной температуры 10 мин в воде (200 мл).

5. Встряхивают 10 мин при комнатной температуре в растворе комплекса серебра (200 мл).

6. Сливают раствор комплекса и быстро ополаскивают гель двумя объемами воды и проявителя (каждый раз по 100 мл).

7. Выдерживают гель в течение 30 мин в проявителе, сменяя раствор каждые 5 мин, до почернения фона в результате реакции «серебряного зеркала». Полосы белка постепенно (5—25 мин) становятся интенсивно окрашенными.

8. Промывают гель 10 и 20 мин двумя сменами холодной воды и вымачивают ночь в свежей порции воды.

Методика обесцвечивания. Смешивают реагенты Л и Б в пропорции 3 : 1 и разбавляют равным объемом воды. Инкубируют гель в этом растворе (100 мл) 1—4 мин, пока фон не пожелтеет. Быстро споласкивают водой и погружают на 30 мин в реагент В (100 мл). Промывают тремя объемами воды (выдерживая соответственно 10, 20 и 30 мин).

Замечание. В основу метода положены ранние работы [241, 244]. Метод дает высокую чувствительность (0,01 нг БСА/мм2) благодаря использованию низкой концентрации формальдегида и процедуре интенсивного окрашивания с последующим обесцвечиванием. Двумерным электрофорезом в сочетании с этим методом было разделено и обнаружено более 200 пептидов из 30 мкл мочи и более 150 — из одного отпечатка пальца. См. также работу [243], где применялось окрашивание комплексами серебра белков из слюны человека.

8.19.2.3. Крупнопористые ПААГ [295, 244]. Крупнопористые гели используются для электрофоретического фракционирования макромолекул с молекулярными массами >10й. Агарозные гели становятся темными при обработке комплексами серебра, поэтому описанная выше методика окрашивания не может быть к ним применена [35]. Ниже приводится методика окрашивания крупнопористых гелей, приготовленных на основе 2,55%-ного полиакриламида с 2,75% сшивок с метиленбисакриламидом. Методика.

1. После электрофоретического разделения белков гель вымачивают в течение 1 ч в смеси 37%-ный формальдегид (фирма Fluka) — этанол — вода (15:27:63) и затем оставляют на ночь в смеси другой концентрации указанных компонент (1 :25:75).

20*

308

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

2. Встряхивают гель при 60 °С в растворе метанол — уксусная кислота — вода (5:7:88) по крайней мере 4 ч со сменой раствора каждые 20— 30 мин.

3. Встряхивают гель при 60 °С 15 мин со свежим раствором 4%-ного масс./об.) параформальдегида (фирма Merck) в 1,43% -ном (масс./об.) ка-кодилате натрия (фирма Fluka), рН 7,3.

4. Промывают гель при 60 °С дистиллированной водой не менее 3 ч, сменяя воду каждые 20—30 мин.

5. Помещают гель в раствор комплекса серебра (разд. 8.19.2.2) на 10 мин при комнатной температуре.

6. Ополаскивают водой 2—3 мин.

7. Проявляют свежеприготовленным водным раствором лимонной кислоты (0,005%, масс./об.; фирма Merck) и формальдегида (0,019, масс/об.; фирма Merck), постоянно меняя раствор, до появления темных полос белка.

8. Прекращают окрашивание добавлением метанола (5%).

8.19.2.4. Агарозные гели после изоэлектрофокусирования. Метод окрашивания комплексами серебра в течение 10 мин в 20 раз более чувствителен, чем окрашивание кумасси R250, и может применяться после окрашивания красителем [211].

Фиксация и высушивание. После изоэлектрофокусирования белки в гелях фиксируют погружением на 10 мин в раствор 10%-ная трихлоруксусная кислота—1%-ная сульфосалициловая кислота. Промывают 10 мин 95%-ным этанолом. Сушат в потоке теплого воздуха.

Авторадиография. Для изотопов с низкой энергией используют пленку Ultrofilm [3Н] LKB 2208-190 с обработкой ее проявителем LX24 и закрепителем AL4 для рентгеновской пленки Kodak.

Окрашивание кумасси. Погружают гель на 5 мин в раствор, содержащий 35% этанола, 10% уксусной кислоты и 0,6% кумасси R250. Обесцвечивают 10 мин смесью 35%-ный этанол — 10%-ная уксусная кислота.

Окрашивание комплексами серебра.

1. После фиксации гель помещают на 5 мин в раствор, содержащий 50% метанола, 12% трихлороуксусной кислоты, 2% СиС12 и 1% ZnCl2 и высушивают.

2. Погружают гель в смесь (1 :2) 0,01%-пого КМп04 и гистологического красителя Харриса гематоксилина (фирма Chroma 2Е 0565). Состав красителя: 10 мл этанола+ 1 г гематоксили-на + 20 г калий-аммонийфосфата + 0,5 г желтого оксида ртути.

3. Ополаскивают гель в дистиллированной воде (несколько секунд), при этом оранжевая окраска бледнеет и переходит в розово-лиловую.

4. Приготовление растворов. Л. 8 г безводного карбоната натрия в 100 мл дистиллированной воды (готовится ежедневно). Б. Растворяют в 80 мл воды (в указанном порядке) 0,28 г нитрата аммония, 0,2 г нитрата серебра, 1 г кремневольфрамо-вой кислоты (Si0212W03*26H20) и 0,73 мл 35%-ного формаль-

8.19. ОКРАШИВАНИЕ В ГЕЛЯХ

309

дегида. Доводят объем до 100 мл (можно хранить в течение нескольких месяцев при комнатной температуре). Непосредственно перед использованием смешивают равные объемы растворов А н Б и погружают в эту смесь гель. В течение 1—3 мин полосы белка становятся красно-коричневыми, а затем черными.

5. Останавливают реакцию промыванием геля в дистиллированной воде в течение нескольких секунд.

Чувствительность метода 0,045 мкг белка в полосе геля. См. также в работе [380] окрашивание белков комплексами серебра в агарозных гелях.

8.19.2.5. Полиакриламидные и агарозные гели после обработки глутаровым альдегидом. Метод основан на одностадийном восстановлении серебра после обработки белка глутаровым альдегидом. Стадии промывки в описании опущены.

Реагенты. Раствор глутарового альдегида (фирма Merk-Schu-chardt). Аммиачный комплекс серебра (0,2 % -ный раствор, масс/об.): смешивают раствор NaOH (0,36 г в 21 мл воды), 1,4 мл NH4OH (28%, масс/об.) и 1 мл нитрата серебра (20%, масс./об.) и доводят общий объем до 100 мл водой. Надо соблюдать меры предосторожности; см. разд. 8.19.2.

Полиакриламидные гели. После электрофореза фиксируют белок 30 мин в растворе 45%-ный метанол — 10%-ная уксусная кислота. Промывают водой для удаления органических растворителей. Помещают гель в 200 мл (1%, масс./об.) раствора глутарового альдегида и выдерживают при интенсивном размешивании 15 ч при комнатной температуре.

Важно строгое соблюдение концентрации глутарового альдегида, 1%-ный раствор пригоден для гелей размером 120X140 мм и 0,5%-ный — для гелей 30x45 мм при толщине 0,75—1,5 мм.

Переносят гель в раствор комплекса серебра па 30 мин. Интенсивное перемешивание предупреждает осаждение серебра на геле. Окраска фона может быть снята селективно в течение нескольких минут обработкой 10%-ной уксусной кислотой.

Промывают гель водой (или забуференным физиологическим раствором с рН 7,2, если использовалась уксусная кислота). Фотографируют. Хранят пластинки геля в пластиковых емкостях. Чувствительность 0,03 нг/мм2 для БСА и 0,5 иг/мм2 для овальбумина, т. е. в 100 раз выше, чем при применении кумасси.

Агарозные гели. После иммуноэлектрофореза агарозный гель увлажняют дистиллированной водой или физиологическим раствором, промокают фильтровальной бумагой и высушивают в течение 15 мин. Переносят в 100 мл раствора комплекса серебра на 5—10 мин. Окраску фона снимают, как описано выше. На всех стадиях используют интенсивное перемешивание.

310

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендуемые концентрации глутарового альдегида

Антисыворотка в агаро- Глутаровый аль- Окрашивание зон

зе, содержание, % дегид,

(об./об.) % (масс/об.)

0,05—0,5 1 Негативное

>0,5—1 0,33

0,05—0,25 3 Позитивное

>0,25—1 5

8.19.2.6. Окрашивание комплексом серебра с последующим тонированием [231 Интенсивность окрашенных полос белка может быть увеличена в 7— 10 раз с помощью описываемой ниже обработки. Оценка методом денсито-метрии показала, что линейность зависимости интенсивности окраски от концентрации белка сохраняется в диапазоне 0,05—1,7 пмоль/мм2.

Реагенты.

Л. 5%-ный (масс/об.) раствор хлорида железа(II). Б. 3%-ная (масс./об.) щавелевая кислота. В. 3,5%-ный (масс/об.) раствор ферро(Ш)цианида калия. Эти растворы можно хранить в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.

Тонирующая ванна. Смешивают по 10 мл каждого из реагентов Л, Б и В и добавляют 70 мл воды. Готовят непосредственно перед употреблением. Раствор должен быть коричневым, при возникновении зелено-голубой окраски не пригоден к употреблению.

Методика. Полиакриламидные гели окрашивают комплексом серебра |269], промывают проточной водой (под краном) по крайней мере 30 мин и затем помещают на 0,5—3 мин в тонирующий раствор. Полосы белков при эгом становятся голубыми. После промывки в течение 10 мин водой (под краном) окраску стабилизируют вымачиванием 10 мин в смеси 20%-ный метанол — 5%-ная уксусная кислота; хранят гели в запаянных полиэтиленовых пакетах. Количественная оценка проводится при окрашивании солями серебра денситометрически при 550 нм и после тонирования спектрофотомет-рически при 660 нм на спектрофотометре Gilford Model 250. Фотографируют гели на пленку Panatomic film (фирма Kodak).

8.19.2.7. Двойное окрашивание кумасси и комплексом серебра [176]. Предварительная обработка кумасси с одновременной фиксацией формальдегидом повышает интенсивность окрашивания и облегчает идентификацию полос на геле.

Фиксация и обработка кумасси.

1. ПААГ после электрофореза погружают на 1 ч в раствор формальдегид— уксусная кислота — этанол — вода (5:10:25:60), содержащий кумасси R250 (0,05%, масс.об.), а затем на 3 ч или на ночь в раствор из тех же компонентов в соотношении 0,5:10:25:64, содержащий 0,05%-ный кумасси R250.

2. Сливают красящий раствор, промывают гель смесью уксусная кислота— изопропанол — вода (10:25:65), а затем смесью из тех же растворителей в соотношении 10 : 10 : 80 до осветления фона.

Окрашивание солями серебра (модифицированная методика) [252].

1. Промывают гель после фиксации 10%-ным водным раствором этанола для удаления уксусной кислоты.

2. Промывают в течение 30 мин смесью 4%-ный параформальдегйд — 1,43%-ный (масс, об.) какодилат натрия (подкисление до рН 7,6 с помощью НС1).

3. Промывают 10%-ным этанолом 4 раза по 5 мин.

4. Выдерживают 30 мин в растворе нитрат меди — нитрат серебра (растворяют 3,5 г нитрата серебра в 100 мл воды и прибавляют 1,5 мл 0,5%-ного

8.20. ОКРАШИВАНИЕ ПА ПИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БУМАГЕ

311

(масс/об.) раствора меди, содержащего 4 мл пиридина и 8 мл абсолютного этанола).

5. Промывают 5 мин в свежеприготовленном растворе комплекса: смешивают 30 мл 19,4%-ного (масс./об.) раствора нитрата серебра и 22,2 мл щелочно-аммиачного водно-этанольного раствора (100 мл 0,36%-ного водного раствора NaOH+ 45 мл концентрированного аммиака+ 55 мл 20%-ного этанола).

6. Обрабатывают дважды по 1 мин раствором восстановителя: 2,5 мл 10%-ного формальдегида (готовят разбавлением продажного формальдегида водой, 1 : 10)+6 мл 1%-ной лимонной кислоты + 100 мл этанола; доводят общий объем до 1 л водой. Затем ополаскивают несколько раз вторым раствором восстановителя; 5 мл 10%-ного формальдегида+5 мл 1%-ной лимонной кислоты+ 100 мл этанола; доводят общий объем до 1 л водой; обработку проводит до появления коричневых и черных полос белка на электро-фореграмме.

7. Останавливают проявление путем погружения геля в 1%-ную уксусную кислоту. В этом растворе гель можно хранить в течение по крайней мере 2 мес; можно также высушить пластинки в вакууме при 100 °С на фильтровальной бумаге. Чувствительность 0,02—0,2 нг/мм2 для нейтральных белков и —1,0 иг/мм2 для основных белков.

8.20. Окрашивание белков на нитроцеллюлозной бумаге

Процесс переноса электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозную подложку известен под названием «блот-тинг» [49]. Методы обнаружения основаны на применении ами-дочерного, индийских чернил и окрашивании комплексом серебра. Специфический иммуноанализ реактивных антигенов на нитроцеллюлозе впервые описан в 1979 г. [368] (см. также разд. 8.20.3).

8.20.1. Окрашивание амидочерным [405]

Окрашивают нитроцеллюлозные пластинки с иммобилизованным белком амидочерным (0,1%-ный раствор в смеси 45%-ного метанола и 10%-ной уксусной кислоты). Обесцвечивание проводят 2%-ной уксусной кислотой в 90%-ном метаноле. Чувствительность — 1 мкг белка.

8.20.2. Окрашивание с помощью индийских чернил [140]

Белки разделяются с помощью электрофореза в градиентных гелях (от 3,3 до 20%) и электрофоретически переносятся на нитроцеллюлозную бумагу (фирма Schleicher and Schuell) [373].

Нитроцеллюлозные полоски с белком промывают 4 раза по 10 мин в 250 мл 0,15 М NaCl в буфере 0,01 М Na2HP04/NaH2P04 (рН 7,2), содержащем 0,3% твина 20 (PSB-TW), при 37 °С в пластиковых водонепроницаемых боксах при легком перемешивании на водяной бане. После каждой промывки ополаскивают полоску деионизованной водой.

Для окрашивания используют чертежные чернила Pelikan Fount, India Ink и чернила для автоматических ручек (Pelikan AG, D-3000).

Добавляют к 200 мл исходного буфера чернила (1 мкл/мл) и погружают в раствор пластинку (180x200 мм) минимум на 2 ч, но лучше на ночь при перемешивании. Небольшое увеличение в интенсивности окрашивания дости-

312

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

гается добавлением 10% глутарового альдегида. Обесцвечивания не требуется, пластинку ополаскивают деионизованной водой 5 мин.

Чувствительность обнаружения зависит от природы белка и варьирует от 80 нг (^-галактозидаза) до 520 нг (овальбумин). Белки проявляются в виде светло-серых полос на желто-сером фоне. Гели можно хранить в указанном буфере в течение месяца без видимых изменений.

Индийские чернила дают лучшие результаты, чем другие красители (ами-дочерный, фаст-грин или кумасси) [250].

8.20.3. Обнаружение с помощью антител [405]

Перенесенные на нитроцеллюлозные пластинки белки обрабатывают 2,4-ди-нитрофторобензолом. Образующиеся производные белка могут быть обнаружены в количестве 10 нг при обработке антителами к динитрофен ильным (ДНФ) группам с помощью пероксидаза-антипероксидазного комплекса. Метод в 100 раз более чувствителен, чем окрашивание кумасси, и в то же время лишен осложнений, возникающих при использовании комплекса серебра. Реагенты.

A. 50 мМ NaHC03 в 50%-ном диметилсульфоксиде.

Б. 0,14 М NaCl, забуференный 10 мМ Na-фосфатом, рН 7,2.

b. 3%-ный БСА—Ш^/о-ный раствор инактивированной нагреванием сыворотки теленка в 0,14 М NaCl, забуференном 10 мМ Na-фосфатом рН 7,2.

Г. 50 мМ трис — HCl-буфер (рН 7,5), содержащий 0,3 мг/мл 3,3'-диами-нобензидина и 0,005% Н20<>. Методика.

1. Выдерживают нитроцеллюлозную пластинку 10 мин при комнатной температуре в реагенте Л, содержащем 0,00001—0,1% 2,4-динитрофторобен-зола. Более длительное время инкубации и более высокая концентрация реагента могут усложнить удаление его избытка. Промывают несколько раз реагентом А. Антигенные детерминанты определяются по методу [3681, как описано ниже.

2. Промывают реплику реагентом Б (пять раз по 5 мин).

3. Выдерживают при легком встряхивании в течение 1 ч при 40 °С в реагенте В.

4. Инкубируют в течение ночи в антисыворотке кролика к ДИФ-группам, разбавленной (1 : 200) реагентом В.

5. Промывают пла

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
классификация тяжелого несчастного случая на производстве.
Рекомендуем компанию Ренесанс - казань лестницы - оперативно, надежно и доступно!
Всегда выгодно в KNSneva.ru - Canon i-SENSYS MF416dw предоставив доставку по Санкт-Петербургу
верстаки столярные складные

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.01.2017)