химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

е.

8.18.8.3. Сравнение поглощения при 235 и 280 нм [399]. Концентрация белка (мг/мл) = (Л235—Л28о)/2,51

Замечание. Нуклеиновые кислоты не дают вклада в результаты, поскольку имеют одинаковое поглощение при 235 и 280 нм. На основе данных аминокислотного состава 208 белков была найдена средняя суммарная величина поглощения остатков Тгр, Туг, Phe, His, Met, Cys-Cys и Cys, она составила 0,853, а для 8 изученных белков — 0,849.

Чувствительность определения концентрации белка при Л235 в 2,82 раза выше, чем при A2so- Чувствительность метода в целом составляет 45% таковой для метода Лоури.

Еще один метод определения основан на измерении величины отношения Л2зз/Л24о [133].

8.18.8.4. Сравнение поглощения при 215 и 225 нм [383]. Делают серию разбавлений раствора белка и измеряют поглощение образцов.

Концентрация белка (мкг/мл) = (Л215— Л225)- 144

Замечание. NaCl и (NH4)2S04 не мешают определению [271], некоторые буферы, например ацетатный, нитратный, бар-битуратный, сукцинатный, фталатпый, сильно поглощают при 215 нм, но могут быть использованы в низкой концентрации (0,005 моль/л), если при этом делается поправка на контрольный опыт. Критическая оценка метода дана в работе [407]; он

302

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

рекомендован к использованию как для чистых белков, так и для смесей в диапазоне концентраций 1,5—45 мкг/мл, где сохраняется линейная зависимость.

8.18.8.5. Сравнение поглощения при 280 и 205 нм [335]. Раствор белка разбавляют 0,1 М K2SO4, содержащим 5 мМ КН2Р04, с рН 7,0 (добавление КОН). Поглощение этого буфера при 205 нм составляет 0,08 ед. опт. пл./см и зависит от содержания С02. Адсорбционные потери белков сводятся к минимуму при приготовлении растворов в полиэтиленовых сосудах. Кварцевые кюветы должны быть очищены концентрированной азотной кислотой и сделана соответствующая поправка на светорассеяние в дальнем ультрафиолете.

Наибольший вклад в поглощение при 205 нм дают боковые цепи остатков Trp, Туг, Phe, His и в меньшей степени остатки Arg, Met и Cys. Поправка для Trp и Туг (для других аминокислот в большинстве случаев этого не делают) определяется путем измерений (па образце с большей концентрацией) поглощения при 280 им.

«205 = 27,0+ 120-(Л280/^2о5)

Замечание. При количественном определении 12 белков спектрофотомегрическим методом найдено г28о = 0,50-^2,65 и f205 = 29,0-г-36,4. Лишь в случае необычно высокого содержания Phe в образце ошибка измерения достигала более ±2% [335].

Для анализа белков при 205 нм требуется спектрофотометр высокого класса и следует иметь в виду, что из раствора должны быть исключены даже следовые количества соединений, поглощающих в этой области (НСООН, СП3СООН, СН3СОСН3 и др.).

8.19. Методы окрашивания белков в гелях

Впервые окрашивание комплексами серебра разделенных в электрофоретических гелях белков было применено в 1972 г. [197], но потенциальные возможности этого метода были открыты позднее [359]. Методы окрашивания белков комплексами серебра в 100—200 раз более чувствительны, чем основанные на применении кумасси бриллиантового голубого. Из шести предложенных методик с этим реагентом наилучшие характеризовались пределом обнаружения 0,5 нг белка/мм2 поверхности ПААГ [282]. Чувствительность окрашивания комплексами серебра несколько варьирует в зависимости от свойств и природы белка, как показано в сравнительном исследовании четырех различных методик применительно к белкам секрета околоушной железы человека, причем выбор оптимального варианта

8.19. ОКРАШИВАНИЕ В ГЕЛЯХ

303

окрашивания во многом определяет корректность интерпретации результатов [ 115J. Электрофореграммы, окрашенные кумасси и комплексами серебра, часто отличаются друг от друга, а некоторые белки, как, например калмодулии и тропоиип С, обнаруживаются с помощью кумасси, по не проявляются комплексами серебра. Было найдено, что такого рода белки требуют для окрашивания серебром предварительной обработки глута-ровым альдегидом, а соответствующая процедура отмывки электрофореграмм должна проводиться под строгим контролем во избежание потерь растворимых белков [328]. Основные белки менее чувствительны к окрашиванию комплексами серебра, чем нейтральные, и для них предложены методы двойного проявления— кумасси и солями серебра [176].

С помощью комплексов серебра удалось обнаружить пептиды в ДСН — ПААГ, полученные из иаиограммовых количеств белка [222]. В работе сделан вывод, что метод более быстр, дешев и безопасен, чем радиоактивное мечепие и приготовление авторадиограмм или флуореграмм. Были использованы коммерческие наборы реагентов фирмы Upjohn Diagnostics для гелей толщиной 1,5 мм [324] и рекомендован для окрашивания более тонких гелей по методике, описанной в работе [408] (набор фирмы Bio-Rad).

Механизм взаимодействия комплексов серебра с белком включает участие в нем фосфатных [326], сульфгидрильных и карбоксильных групп аминокислот [286]. Чувствительность обнаружения белков реагентом повышалась после предварительной обработки их глутаровым альдегидом [281] или формальдегидом [408], а также в случае предварительного восстановления дитиотреитом [269]. В работе [99] сделан вывод, что усиление чувствительности метода происходит только при обработке глутаровым альдегидом (по не формальдегидом) и что интенсивность окраски линейно коррелирует с числом остатков лизина в белке.

Первоначальный вариант метода [252, 359] был модифицирован многими исследователями с целью сделать его более простым и дешевым [175, 253—255, 269, 281, 305, 324, 408]. См. критический обзор [305].

Окрашивание комплексами серебра — первый надежный метод обнаружения гистонов в гелях, содержащих тритон, кислоту и мочевину, с близкой к линейной зависимостью интенсивности окраски от количества белка при его содержании 0—50 иг [259].

Было показано, что помещение ПААГ-электрофореграммы последовательно в гипер- и гипотонический растворы дает возможность обнаруживать с помощью комплексов серебра 10 фг белка [285]. В то же время в исходном варианте процедура окрашивания солями серебра многостадийна, трудо-

304

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

емка, включает много ручных операций. Неполное удаление непрореагировавших комплексов серебра может привести к образованию силыюокрашенного фона. Продолжительная процедура отмывки электрофореграмм в потоке жидкости позволяет избежать этих осложнений и получить, как было показано па мышечном белке, линейную зависимость в диапазоне 2—70 иг образца в полосе геля [126]. Предложена новая техника микроволновой сушки ПААГ [124], позволяющая осуществить этот процесс за 3,5 мил (вместо обычных 35—45 мин) при толщине геля 0,75 мм и за 1 ч при толщине в 3 мм (аппарат для сушки Bio-Rad делает это за 4—5 ч).

8.19.1. Методы окрашивания белков красителями

Окрашивание белков в гелях с помощью красителей уступает по чувствительности описанным выше методикам с применением комплексов серебра, по его проще осуществлять в повседневной практике. Наиболее широко используется краситель кумасси бриллиантовый голубой, по существует и много других модификации метода. Окрашенные кумасси полосы белков могут быть сфотографированы при освещении лампой дневного света на поляроидпую пленку типа 665 (фокусное расстояние 32, экспозиция 0,5 с) с желтым светофильтром [353].

1. Окрашивание ПААГ красителем кумасси R250 (0,1%, масс./об., фирма Serva) в смеси 50%-ный метанол — 12%-пая уксусная кислота в течение ночи при легком помешивании. Обесцвечивание несколькими объемами раствора 10%-ный этанол— 5%-пая уксусная кислота. Фотографирование через узкополосный (550 нм) интерференционный светофильтр (фирма Baird Atomic, Bedford, MA) [253]. При электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСН белков, прочно связанных с ДНК, были обнаружены две артефактные полосы (соответствующие молекулярным массам 54-10-'* и 68-Ю3), окрашиваемые кумасси и комплексами серебра; в буфере присутствовал меркаптоэтанол [364].

2. Окрашивание ПАА-гелей в течение ночи кумасси R250 (0,2% масс./об.) в смеси 45%-ный метанол — 10%-пая уксусная кислота, обесцвечивание раствором 10%-ный метанол — 7%-пая уксусная кислота [317]. После электрофореза агарозные гели смачивались дистиллированной водой, обертывались фильтровальной бумагой и выдерживались 30 мин при 37 °С. Окраска проявлялась через 15 мин после обработки кумасси R250 (0,1%, масс/об.) в смеси 45%-ный этанол— 10%-ная уксусная кислота. Обесцвечивание той же смесью растворителей.

3. Обнаружение с помощью кумасси белков и полипептидов после изоэлектрофокусирования [370]. Кумасси бриллиантовый голубой R250 не может быть использован в обычных условиях

8.19. ОКРАШИВАНИЕ В ГЕЛЯХ

3(j5

для обнаружения белков на ПААГ после изоэлектрофокусиро-вания, поскольку носители-амфолиты (полиаминополикарбоно-вые кислоты) реагируют с красителем. Для преодоления этих ограничений было предложено использовать коллоидные суспензии кумасси R250 и G250 в хлорной [311] и трихлороуксусной [26, 313] кислотах. Приведенная ниже методика дает хорошие результаты.

После изоэлектрофокусирования полосу геля толщиной 0,5 мм опускают на 3 ч в водный 0,15%-ный раствор кумасси G250, содержащий 40% метанола и 4% формальдегида. Обесцвечивают в течение ночи 10%-ным метанолом путем смены нескольких объемов промывного раствора. Слабый голубой фон остается, но он не мешает определению. Фотографируют при освещении лампой дневного света на поляроидную пластинку типа 665 с оранжевым светофильтром, фокусное расстояние 8, экспозиция 1/8 с.

Метод применим к ПААГ-системам, содержащим ДСН и 8 М мочевину. Полипептиды и белки (М 1665—68 000) с изоэлектри-ческими точками при рН 2,2—10,2 были разделены изоэлектро-фокусированием в градиенте рН 3,5—10,5. Чувствительность обнаружения для тридекапептида а-меланостимулирующего гормона составила 20 мкг.

4. Окрашивание кумасси в процессе электрофореза [379]. Метод позволяет осуществить окрашивание в процессе электрофореза в кислых гелях и применялся в основном для обнаружения гистоиов. Добавляют кумасси R250 (0,01%, масс./об.) к катодному буферу и ведут электрофорез в 0,9 М уксусной кислоте (рН 2,5) при нагрузке 4 мА на одну гелевую трубку и 100 В до достижения красителем верхнего края геля. Обесцвечивают в течение короткого времени (2—3 ч) для обнаружения минорных полос.

5. Для обнаружения гистоиов на ПААГ была использована следующая методика.

Перед окрашиванием солями серебра погружают гель на 3 ч в 500 мл раствора, содержащего 1% амидочерного, 40% метанола и 7% уксусной кислоты. Обесцвечивают в течение ночи в 4 л смеси 32%-ный этанол—18%-ная уксусная кислота и затем промывают 4 раза по 1 л воды [259].

В альтернативном варианте при легком размешивании выдерживают гель в течение 3 ч (не более) в растворе, содержащем 0,05% 2,7-нафталиндисуль-фокислоты (фирма Eastman), 50% метанола и 10% уксусной кислоты. Обесцвечивания не требуется.

8.19.2. Окрашивание белков комплексами серебра

Внимание! Аммиачные комплексы серебра взрывоопасны и не подлежат хранению. Отработанные растворы комплексов надо обрабатывать НС1 для разрушения и разбавлять водой перед удалением.

Для регенерации серебра добавляют насыщенный раствор NaCl, жидкость отделяют путем фильтрования и отбрасывают; собирают осадок AgCI [408].

2j--7j3

306

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

После окрашивания серебром можно осуществлять непрерывную регистрацию результатов с помощью фотографирования на поляроидную пленку (3X5") или негативную пленку (впоследствии с нее печатают фотографии). Описан метод с использованием пленки прямого копирования (Kodak X-Omat) при УФ-освещении в течение 1 — 1,5 с с последующей обработкой проявителем и закрепителем фирмы Kodak. Процедура неприменима к образцам, окрашенным кумасси [125].

8.19.2.1. Фотопроявление белков на ПААГ.

Методика A [253J. Для визуального обнаружения белка необходимо всего <50 мин.

1. После электрофореза фиксируют белок в течение 10 мин в растворе, содержащем 50% метанола и 12% уксусной кислоты.

2. Промывают гель дважды смесью 10%-ный этанол — 5%-ная уксусная кислота.

3. Вымачивают гель в 0,5%-ном растворе ферро(П)цианида калия в течение 5 мин при легком встряхивании.

4. Сливают раствор и промывают гель трижды водой (20 с на каждую промывку).

5. Добавляют раствор, содержащий 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл 37%-ного формальдегида (фирма Fischer Scientific) и 0,06 мг бензотриазола в 100 мл воды.

6. Освещают гель в течение 20 мин в блоке флуоресцентной лампой 160 Вт, модель Т-12 (фирма Aristo Grid Products) с интенсивностью эмиссии, эквивалентной эмиссии вольфрамового источника света мощностью 500 Вт.

7. Сливают раствор нитрата серебра, и без промывки геля добавляют 200 мл 3%-ного раствора карбоната натрия, содержащего 37% формальдегида и 0,6 мг бензотриазола/л. Продолжают освещение при легком встряхивании. Через 1 мин образуется коричневый осадок и раствор карбоната натрия заменяют на свежий. Процесс заканчивают при достижении необходимой интенсивности окраски.

8. Окрашивание может быть прервано в любую минуту удалением раствора карбоната натрия и вымачиванием геля (5 мин) в 1%-ной уксусной кислоте.

9. Перед хранением гель промывают водой.

Методика Б [256]. Методика позволяет обнаруживать белки и нуклеиновые кислоты в течение 10 мин.

1. Фиксируют гель выдерживанием 5 мин в смеси метанол — уксусная кислота — вода (100:20:80), содержащей 4 г лимонной кислоты и 0,4 г NaCl.

2. Обмывают гель 200 мл деионизованной воды для удаления NaCl.

3. Помещают гель в 200 мл смеси метанол — уксусная кислота — вода (100:20:80), содержащей 4 г нитрата серебра, и освещают, как описано в методике А.

Делают серию фотографий в процессе проявления (для количественного анализа каждые 10 мин).

4. Останавливают окрашивание путем помещения теля в темноту. Чувствительность 0,5 нг белка. ДНК дает негативное окрашивание.

8.19.2.2. Полиакриламидные гели. Методика [242].

Реагенты для окрашивания солями серебра. Раствор комплекса. Смешивают (1:5) 30%-ный раствор метиламина (продажный) с раствором NaOH (0,36%, масс./об.) и добавляют ~10 мл этого раствора к 4 мл 20%-иого

8.19. ОКРАШИВАНИЕ В ГЕЛЯХ

317

(м)асс./об.) AgN03 до образования коричневого осадка и просветления раствора. Доводят общий объем до 100 мл водой. Надо соблюдать меры предосторожности; см. разд. 8.19.2.

Проявитель. Добавляют 15 мл раствора, содержащего 1 % (масс./об.) лимонной кислоты и 1,5 мл 40%-ного (продажного) формальдегида к 3 л воды.

Реагенты для обесцвечивания.

A. Растворяют 11,1 г NaCl и 11,1 г CuS04 в 285 мл воды и прибавляют 25%-ный раствор аммиака до выпадения осадка и просветления темно-голубого раствора (конечный объем —300 мл).

Б. Растворяют 44 г тиосульфата натрия (пентагидрат) в 85 мл воды (конечный объем —100 мл).

B. Осветляющий реагент фирмы Kodak: 20 г в 800 мл воды. Методика окрашивания.

1. Вымачивают ПААГ (0,8—3,0 мм толщиной) после электрофореза в течение ночи в растворе 50%-ный метанол+10%-ная уксусная кислота (100 мл).

2. Промывают при 60 °С в течение 10 и 20 мин, сменяя несколько раз воду (200 мл).

3. Инкубируют 30 мин при 60 °С в 0,1%-ном (масс./об.) ра

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
фбс 600х600х2400
В КНС всегда быстро, выгодно и удобно: ноутбуки asus цены - хорошее предложение от супермаркета компьютерной техники.
клиника выкидыш выскабливание узи
сайты для помощи ребенку

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.07.2017)