химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

дой до 100 мл.

Б. 30%-ный NaOH.

Оба реагента могут храниться в склянках из пирекса в течение 6 мес.

Методика. К 2 мл раствора белка (0,02—0,53 мг/мл) добавляют 1 мл реагента Л. Тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре 5 мин, после чего измеряют поглощение при 310 нм против «холостого» опыта. Готовят следующие смеси: Х{ — 2 мл раствора белка-Н мл реагента Л; Х2— 2 мл дистиллированной воды+1 мл реагента Л; Vi—2 мл раствора белка+1 мл реагента Б; У 2— 2 мл дистиллированной воды+1 мл реагента Б.

Поглощение белка равно (Xi—А2) — (У|—Уа); используют градуировочный график.

Замечание. Этот метод — модификация предложенного ранее [417]; методика может быть использована в присутствии ДНК- ДНК в концентрации до 0,7 мг/мл в реакционной смеси не мешает определению, т. е. допустимо соотношение ДНК : белок>10 : 1.

Окраска развивается менее чем за 5 мин и сохраняет стабильность 2,5 ч (для семи изученных белков); в случае лизоцима наблюдалось за это время падение интенсивности окраски на 11%. Чувствительность составляет 1/16 чувствительности метода Лоури, но существенное преимущество состоит в том, что зависимость поглощения от количества белка линейна, а влияние природы белка менее существенно. На реакцию не влияет присутствие в растворе NaCl (1,5 М), ацетата натрия (0,1 М), формиата натрия (0,75 М), хлорной кислоты (0,67 М) или Ыа2Н-фосфата (0,01 М). При концентрации мочевины >2,0 моль/л требуется ввести небольшую поправку на поглощение мочевины.

Предложен интересный метод, в котором белок обрабатывается сначала биуретовым реагентом, а затем реагентом Фолина. Получена хорошая воспроизводимость результатов (±2% для концентрации белка 50—600 мкг/мл). В координатах Хилла [284] кривая поглощения от концентрации белка преобразуется в прямую.

8.18.3.2. Биуретовый метод для образцов, содержащих тиолы [291]. Реагент. Растворяют 3,9 г CuS04-5H20 и 6,7 №2-ЭДТА в 700 мл дистиллированной воды. Добавляют при постоянном перемешивании 200 мл 20%-ного NaOH до конечного объема 900 мл.

Методика. Раствор, содержащий 50—1000 мкг белка, в пробирке разбавляют до объема 0,1 мл, добавляет 1,0 мл биуретового реагента, инкубируют 5 мин при 60 °С и измеряют поглощение при 545 нм.

8.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

297

Замечание. Метод не очень чувствителен (—50 мкг), но прост и дает линейную зависимость поглощения от концентрации вплоть до 1000 мкг белка. Окраска стабильна в течение не менее 1 ч. Добавление иодоацетамида (12,5 мкг) необходимо для исключения влияния больших количеств дитио-треита. Реагент ЭДТА |661 превосходит по хелатирующей способности тар-трат [129], что позволяет полностью исключить влияние сульфгидрильных соединений.

Комплекс меди с диэтилдитиокарбаматом в присутствии дезоксихолата давал линейный график для БСА при концентрации белка до 500 мкг/мл |185|.

8.18.3.3. Биуретовый метод в применении к образцам, содержащим детергенты [393].

Реагент. 1,5 г CuS04-5H20 + 4,9 г дигидрата №2--тартрата + 7,5 г NaOH в 1 л воды. Реагент стабилен в течение 4 мес при хранении в пластиковом сосуде при комнатной температуре.

Методика. К 2,5 мл биуретового реагента добавляют 0,5 мл раствора, содержащего 0,2—0,4 мг белка и 2% детергента. Смешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют поглощение при 540 нм против 0,5 мл 2% раствора детергента.

Модифицированный реагент позволяет избежать помутнения раствора в случае присутствия детергентов, используемых для экстракции белков. Для БСА в диапазоне 0,4—8 мг/мл сохраняется линейная зависимость поглощения от содержания белка.

8.18.3.4. Биуретовый метод в применении к образцам, полученным экстракцией тканей [24].

Методика. Используется реагент, описанный в разд. 8.18.3.3 [393.] Водный экстракт тканей промывают 3 мл смеси ацетон — петролейный эфир (1:1) при температуре 35—60 °С с перемешиванием на вибраторе 30 с. Центрифугируют и декантируют. К остатку добавляют 0,1 мл 10%-ного дезоксихолата (рН 8,0) и 2,9 мл реагента. Закрывают пробирку парафильмом и смешивают растворы, переворачивая осторожно пробирку. Озвучивают дважды по 15 с при 20 кГ источником ультразвука Branson Sonifier. Для максимального развития окраски помещают пробирку в кипящую водяную баню на 30 с. Охлаждают до комнатной температуры и измеряют поглощение при 540 нм против контрольного раствора реагентов.

8.18.4. Определение белка с помощью кумасси бриллиантового голубого

8.18.4.1. Метод Бредфорда [38].

Реагент — раствор красителя. Растворяют 100 мг кумасси бриллиантового голубого G-250 (фирма Sigma) в 50 мл 95%-ного этанола. К раствору добавляют 100 мл фосфорной кислоты (85%, масс./об.) и доводят до 1 л дистиллированной водой. Фильтруют. Хранят при 20 °С в течение 2 нед. Реагент поставляют фирмы Bio-Rad и Pierce.

Методика. Раствор белка (10—100 мкг) помещают в пробирку (12х Х100 мм) и разбавляют до 0,1 мл 0,15 М раствором NaCl. Добавляют 5 мл раствора красителя и перемешивают на вибромешалке. Через 2 мин начинают снимать кривую поглощения (при 595 нм) против контрольного раствора (0,1 мл соответствующего буфера4-1 мл раствора красителя); измерения продолжают в течение ~1 ч.

Можно работать с пробами, содержащими 1 —10 мкг в 0,1 мл буфера; при этом добавляют 1 мл раствора красителя. Измерение проводят в кювете объемом 1 мл.

298

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Кюветы следует промывать соответствующим детергентом, водой и ацетоном для удаления комплекса белка с красителем, образующим пленку на стеклянной поверхности, или вымачивать в течение ночи в 0,1 М НС1.

Замечание. Описанный метод характеризуется в —4 раза более высокой чувствительностью, чем метод Лоури. Окраска стабильна ( — 4%) в течение 1 ч. Катехоламины (как и хлориды натрия, калия, магния, сульфат аммония, этанол) не мешают определению, что позволило применить его к анализу фракций белков надпочечников [306]. В незначительной степени на результаты оказывают влияние буферные компоненты со щелочными свойствами, трпе, уксусная кислота, 2-меркаптоэтанол, сахароза, глицерин и следовые количества детергентов; это влияние может быть компенсировано путем введения соответствующих добавок в контрольный раствор. Более подробно о мешающих корректному определению белка соединениях см. работу [350].

Достоинства метода Бредфорда заключаются в быстроте анализа и воспроизводимости результатов, но не всегда графики зависимости поглощения при 595 нм от количества белка линейны и угол наклона кривой для разных белков сильно варьирует [289, 377]. Поэтому график, полученный для белка-стандарта, может быть неприменим без соответствующих поправок к неизвестному белку. Наиболее достоверные результаты [303] дает измерение поглощения белка при 280 нм (при концентрации белка >50 мкг/мл) или 205 нм (при концентрации белка <50 мкг/мл).

При тщательном изучении метода Бредфорда [350] было найдено, что коэффициент экстинкции комплекса краситель — белок остается постоянным при концентрации белка 0,8—10 мкг/мл, поэтому рекомендуется выбирать объем раствора красителя (0,5—5,0 мл) таким образом, чтобы конечная концентрация белка оказывалась в указанных пределах. Это обеспечивает выполнение закона Бера (линейность зависимости) и позволяет осуществить точное определение белка при содержании 0,5—50 мкг.

Белки в концентрации менее 2 мкг/мл определялись с помощью кумасси R (фирма Sigma). Белок осаждали на стеклянно-фибровый диск, промывали трихлороуксусной кислотой, обрабатывали реагентом кумасси и образовавшийся окрашенный комплекс растворяли в метанольном растворе NaOH для колориметрического определения при 590 нм [249]. Применение щелочи, рекомендуемое для снятия осажденного белка с подложки, улучшает последующее колориметрическое или радиометрическое измерение [101].

Метод Бредфорда может быть применен к белкам, растворенным в элек-трофоретическом буфере, содержащем ДСН, меркаптоэтанол, трис. В этих условиях БСЛ дает линейную зависимость (в диапазоне 10—90 мкг белка), аналогичную получаемой в методе Лоури; в применении к анализу клеточных гомогенатов оба метода дали воспроизводимые, но различные по углу наклона графики [323].

8.18.4.2. Микровариант метода Бредфорда [46]. Образцы белка по 100 мкл (например, фракции элюата с ВЭЖХ) или растворы белков-стандартов помещают в ячейки плашки для микротитрования, приливают к ним по 200 мкл раствора красителя, разбавляют водой (1 :5). Энергично встряхивают и через 10 мин измеряют поглощение при 595 нм (спектрофотометр фирмы Titertek Multiskan, фильтры фирмы Flow Labs. Inc.).

8.18.5. Определение белка с помощью сульфобромофталенина [248]

Реагент. Смешивают 2,0 мл 1 М НС1, 0,5 мл 1 М лимонной кислоты и 10 мкл раствора динатриевой соли сульфобромофталеина (фирма Baker Chemical) с концентрацией 50 мг.'мл воды.

2 М NaOH, содержащий 1 мг/мл дезоксихолата натрия (ДОХ).

8.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

299

Раствор для промывки: смесь 1 М HCI + 1 М лимонной кислоты-Ы М NaOH (4 : 1:2).

Методика. В 1,5 мл полипропиленовую центрифужную пробирку помещают образец белка (10 мкл) в воде или буфере. Добавляют такой же объем 2 М NaOH, содержащий ДОХ. Смешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре (если это необходимо для полного растворения белка). Добавляют 50 мкл реагента, смешивают и центрифугируют (в центрифуге Ер-pendorf Model 3200 при полной скорости, — 12 ООО g) в течение 1 мин. Удаляют несвязавшийся краситель пипеткой. Добавляют 0,5 мл раствора для промывки. Центрифугируют в этих же условиях и супернатант отбрасывают. Осадок суспендируют в 0,5 мл 0,1 М NaOH на вибраторе и измеряют поглощение при 580 нм. Линейная зависимость наблюдается в диапазоне 0,5— 10 мкг белка, при повышении концентрации красителя до 250 мкг/мл линейность сохраняется до 100 мкг белка.

Замечание. Методика не работает в присутствии тритона Х-100 (0,1%) и ДСН (0,1%), взаимодействующих с красителем. Воспроизводимость результатов ухудшается при использовании настольной центрифуги, дающей — 2000 g. Возможны перерывы между стадиями во времени. Метод рекомендуется для определения белка в тканях.

8.18.6. Определение белка с тринитробензолсульфокислотой в присутствии липидов [258]

Реагенты.

5%-ный раствор ДСН (масс/об.) в воде.

2,4,6-Тринитробензосульфокислота (ТНБС) (фирма Eastman, белая маркировка) может быть перекристаллирована из 1 М НС1. Готовят 0,03 М раствор в смеси грМетодика. Образец белка (0,04—0,5 мкг) обрабатывают 20 мкл 5%-ного ДСН и высушивают в потоке газа (N2, С02 пли воздух). Добавляют 1 мл 0,1 М калийтетрабората и перемешивают в вибраторе. Приливают 0,2 мл раствора ТНБС и снова перемешивают. Выдерживают 30 мин при 24—26 °С (10 мин при 40°С), периодически встряхивая (можно использовать вибратор). Добавляют 3 мл хлороформа или диэтилового эфира, немедленно смешивают и центрифугируют 1 мин при 1000 g. Органическую фазу, содержащую липиды и другие примеси, отбрасывают. Подкисляют водную фазу 0,2 мл НС1. Повторно экстрагируют 3 мл хлороформа или эфира и отбрасывают органическую фазу. Добавляют 2,0 мл 98°/о-ной муравьиной кислоты и нагревают при 100°С 20 мин. По охлаждении окрашенного в желтый цвет раствора измеряют оптическую плотность при 345 нм.

Замечание. Стандартами служат овальбумин или БСА. Ошибка определения ~10%. Другие методики определения белка в присутствии липидов не дают достоверных результатов. Аналогичный метод был разработан для определения аминов, аминокислот, белков в смеси [257] и свободных аминогрупп в белках [136]. Реакция аминокислот и пептидов с ТНБС использовалась для их детекции при ВЭЖХ [381].

8.18.7. Метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии

Метод позволяет определять белки в окрашенных или опалесцирующих растворах [92].

Реагент. 10 мл 0,20 М CuS04 добавляют к 590 мл 0,167 М NaOH, содержащего 2 г тетрагидрата №,К-тартрата. Ионообменная смола AG2-X8.

300

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Таблица 8.3. Определение количества белка по сравнению оптических плотностей при 280 и 260 им

Л 280/ 260 Нуклеиновая кислота, % F

1,75 0,0 1,116

1,52 0,5 1,054

1,36 1,0 0,994

1,16 2,0 0,899

1,03 3,0 0,814

0,939 4,0 0,743

0,874 5,0 0,682

0,822 6,0 0,632

0,784 7,0 0,585

0,753 8,0 0,545

0,730 9,0 0,508

0,705 10,0 0,478

0,645 14,0 0,377

0,595 20,0 0,278

Атомно-абсорбционный спектрофотометр Varian-Techtron, модель 1000 с воздушно-ацетиленовым пламенем.

Методика. Приливают 1 мл Cu-реагента к 1 мл раствора белка (0,05— 1,0 мг/мл). Смешивают. Через 2—5 мин добавляют 250 мг смолы и периодически встряхивают в течение 5 мин. После отстаивания смолы отбирают 1 мл супернатанта и добавляют к 3 мл дистиллированной воды. Определяют содержание меди на атомно-абсорбционном спектрофотометре при 324,8 нм. Готовят контрольный раствор реагентов и строят градуировочный график для БСА (0,05—1,0 мг/мл). Для уменьшения приборных шумов и предохранения прибора от блокировки в промежутках между измерениями образцов распыляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты. Присутствие хлорофилла, гема, рутения и других кофакторов не мешает определению. Метод привлекается, если неприменимы другие методы. Раствор белка должен содержать <0,4 М солей или аминокислот. Нерастворимые белки могут быть переведены в раствор с помощью 1% (масс/об.) ДСН.

8.18.8. Спектрофотометрические методы

8.18.8.1. Сравнение поглощения при 280 и 260 нм. Большинство белков имеет максимум поглощения при 280 нм, что обусловлено содержанием в них остатков триптофана и тирозина. Нуклеиновые кислоты, присутствующие часто в виде примесей к белкам, также сильно поглощают при 280 нм, но максимум поглощения этих соединений находится при 260 нм. Барбург и Христиан экспериментально определили коэффициенты экстинкции различных белков и нуклеиновых кислот при 280 и 260 нм и нашли отношение этих коэффициентов (фактор F; табл. 8.3); предложен дифференциальный метод определения белка в интервале концентраций 50—500 мкг/мл.

Метод Варбурга и Христиана [388]. Измеряют оптическую плотность белкового раствора при 280 нм и 260 нм. Вычисляют

8.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

301

отношение полученных величин, по табл. 8.3 находят соответствующее значение F и подставляют в следующую формулу:

Концентрация белка (мг/мл) =F-l/d-A28o

[где d — длина кюветы (в см)] или [212]:

Концентрация белка (мг/мл) = 1,55Л28о — 0,7бЛ26о

8.18.8.2. Сравнение поглощения при 230 и 260 нм [194]. Концентрация белка (мкг/мл) = 183Л230— 75,8Л2бо

Эти длины волн были выбраны потому, что они соответствуют минимальному и максимальному поглощению в спектре нуклеиновых кислот. Небольшие отклонения в установке длины волны практически не оказывают влияния на определение нуклеиновых кислот, но поглощение белков при —230 им меняется на 1% при изменении длины волны па 0,1 им. Высокие концентрации сульфата аммония, глицерина, сахарозы, мешающие определению в методе Лоури, можно нивелировать соответствующими добавками в «холостом» опыт

страница 45
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ограничитель силиконовый на дверную ручку
атерома стоимость удаления
курсы маникюра цена
какое первое моноколесо купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)