химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

й промышлепностях, по в белковых лабораториях он вытеснен аминокислотными анализаторами, обеспечивающими в 100 раз большую чувствительность определения не только аммиака, по и одновременно аминокислотного состава [9, 39].

8.18.1.3. Аминокислотный анализ. Образец белка подвергается исчерпывающему гидролизу, и путем исследования гидролизата определяется аминокислотный состав. Каждая аминокислота может быть легко идентифицирована, если ее количество составляет 5—10 нмоль, а во многих специализированных лабораториях проводится анализ па уровне 50—100 пмоль аминокислоты.

8.18.1.4. Колориметрические методы. Многие из этих методов достаточно просты, по не все могут быть применены к данному конкретному белку. Ошибки в результатах чаще всего обусловлены тем, что исследуемый белок резко отличается по своей природе от белка-стандарта (обычно в качестве белка-стандарта применяется БСА).

1. Биуретовый метод основан па специфической реакции пептидной связи с ионами меди в щелочной среде; методика проста в экспериментальном отношении. Метод ограничен низкой чувствительностью (предел обнаружения белка 300 мкг/мл). Предложено много вариантов реагента с целью увеличения интенсивности окраски, стабильности ее и исключения наложения фона, вносимого соединениями с сульфгидрильными группами (такими, как дитиотреит).

2. Наиболее широкое применение нашел метод Лоури [225]. Возникающая окраска в основном определяется реакцией фе-нольного реагента (Фолина — Чикольте) с остатками Туг, но определенный вклад дают некоторые другие аминокислоты — Тгр, His и Cys, а также пептидные связи. Зависимость интенсивности окраски от количества белка-стандарта не линейна. Определению мешают детергенты, используемые для солюбилизации белков. Предложено много различных модификаций метода.

19*

292

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

3. Неспецифическое связывание красителя. Ряд красителей был использован для определения белка по окраске, возникающей в результате простой адсорбции. Некоторые из них дают воспроизводимые результаты (в данных условиях) и достаточно высокую чувствительность, но степень связывания красителя зависит от индивидуальных свойств белка. Кроме того, зависимость степени сорбции от концентрации белка не линейна и у разных белков угол наклона кривой сильно различается.

Несколько примеров. Белок из ткани листьев определен с помощью реактивов цианин G и нафталиновый темно-голубой [401. Сульфобромофталенн был использован для реакции с белком в кислых условиях; образовавшийся осадок комплекса белок — краситель отделяли центрифугированием и затем вновь растворяли в щелочи и измеряли оптическую плотность при 580 нм [34, 248]. Специфический метод определения коллагена (10 мкг—100 мкг) основан на реакции с красителем Sirins Supra red F3BA |192]. Очень широкое применение нашел кумасси бриллиантовый голубой [38, 336, 3501.

Сравнительное изучение содержания белка в образцах из культуры клеток и субклеточных фракций было проведено с использованием методов Лоури и Бредфорда |61|. Метод Лоури дал завышенные результаты, но соотношение величин, полученных двумя методами, было постоянным (среднее значение 1,58±0,09). Рекомендован метод Бредфорда из-за его большей скорости.

Ни один из колориметрических методов не может гарантировать получение корректных результатов со всеми белками, сказывается индивидуальная природа каждого белка и в некоторых случаях наличие загрязнений — детергентов, липидов и т. д., внесенных в процессе его выделения. Так, было показано, что реакция белков с гомобифункциональпыми сшивающими агентами вызывает падение интенсивности окраски с кумасси или комплексом серебра [217].

Несколько методов, рассматриваемых ниже, наиболее удовлетворяют современным требованиям.

8.18.1.5. С пектрофот о метрические методы. Спектрофотометри-ческие методы определения белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами и могут быть рекомендованы во многих случаях. Они просты, быстры и не вызывают структурных разрушений в исследуемом материале. Один из наиболее ранних прочно утвердившийся метод Варбурга и Христиана [388] основан на определении соотношения величин поглощения при 280 и 260 нм и позволяет определять белок в присутствии нуклеиновых кислот. В нескольких методах, предложенных позднее, для измерений используются другие длины волн.

8.18.1.6. Флуорометрические методы. Очень перспективен как высокочувствительный метод анализа флуорометрический метод естественно при условии, что в белок или полипептид можно ввести флуорогенную метку. Этет метод на конкретных примерах обсуждался в разд. 8.16.3.

8.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

293

8.18.2. Определение белка с помощью реактива Фолина — Чикольте

8.18.2.1. Метод Лоури [225]. Реагенты.

A. 2%-ный (масс/об.) раствор Na2C03 в 0,10 М NaOH.

Б. 0,5%-ный раствор CuS04-5H20 в 1%-ном Na- или К-тартрате.

B. Щелочной раствор меди. Смешивают 50 мл реагента Л и 1 мл реагента Б (пригоден в течение 2 сут).

Г. Смешивают 50 мл 2%-ного (масс./об.) раствора Na2C03 с 1 мл реагента Б (годен в течение 1 сут).

Д. Реагент Фолина — Чикольте. После приготовления надо использовать в тот же день; в настоящее время доступен комерческий препарат с более длинным сроком использования (хранение при 0—4°С). Титруют аликвоту реагента до рН 10,0 (по фенолфталеину) и на основании результатов титрования разбавляют реагент приблизительно в два раза до концентрации 1 моль/л.

Белок-стандарт. Готовят раствор БСА или другого очищенного белка с концентрацией 500 мкг/мл. В пробирки вносят с помощью пипетки порции раствора 10 мкл — 200 мкл (5 мкг—100 мкг) и разбавляют водой до 200 мкл.

Методика. В 3—10-миллилитровую пробирку вносят пипеткой 0,2 мл раствора белка (5—100 мкг) и приливают 1 мл реагента В. Смешивают на вибраторе и оставляют стоять на 10 мин. Быстро добавляют 0,10 мл реагента Д, перемешивают (общий объем 1,3 мл). Выдерживают 30 мин или немного дольше и измеряют поглощение против пробы «холостого» опыта. Находят концентрацию по градуировочному графику. Могут быть использованы любые кратные количества указанных объемов.

Если белок находится в разбавленном растворе (~25 мкг/мл), то на анализ берут 0,5 мл раствора образца, добавляют 0,5 мл реагента В, имеющего концентрацию в 2 раза выше, и 0,1 мл реагента Д.

При плохой растворимости белка в 0,1 М щелочном растворе реагента А к пленке высушенного белка (5—100 мкг) добавляют 0,1 мл 0,1 М NaOH, при необходимости нагревают. Затем к раствору приливают 1 мл реагента Г и через 10 мин — 0,1 мл реагента Д.

Замечание. Интенсивность окраски определяется природой белка, и ее зависимость от концентрации лишь приблизительно линейна в диапазоне 15—40 мкг белка (30—80 мкг при увеличении вдвое объемов реагентов). Методика проста, дает воспроизводимые результаты и достаточно чувствительна ( — 0,2 мкг белка). С помощью несложных операций градуировочный график для концентрации белка вплоть до 1,0 мг можно преобразовать в линейный [75].

Разработано несколько модификаций методики, чтобы исключить возможность ошибок из-за наложения фона примесей небелкового характера. Во многих случаях ошибки удается уменьшить путем внесения соответствующего соединения как в раствор стандартного белка, так и в контрольный («холостой») опыт.

Присутствие ДСН не оказывает влияния на реакцию [216], а меркапто-этанол должен быть удален полностью перед добавлением реагента (обычно это делается тщательной сушкой образца в вакууме) [238]. От таких соединений, как катехоламины, также дающие окрашивание, белок должен быть предварительно освобожден осаждением трихлороуксусной кислотой [165, 279, 421]. Описана модифицированная процедура с использованием хлорами-на-Т для растворов белков, содержащих пурины и/или сульфгидрильные соединения [157—159].

Опубликован обширный обзор, где рассмотрено влияние на определение белка по методу Лоури примесей различных соединений: пуринов, глицина,

294

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

гидразина, сульфата аммония (при конечной концентрации >0,15%) и фенола [2991.

8.J'8.2.2. Упрощенный метод Лоури. Модификация Петерсона [298]. Реагенты.

1) Тартрат-карбонат меди (ТКМ). Медленно при перемешивании добавляют 20%-ный раствор карбоната натрия к раствору сульфата-тартрата меди до получения конечного раствора следующего состава: 0,1% CuS04-5H20 + -+-0,2% тартрата калия+10% карбоната натрия. Раствор стабилен в течение 2 мес при 20 °С.

2) 0,8 М NaOH.

3) 10%-ный раствор ДСН (фирмы Sigman и Pierce).

4) Реагент Фолина— Чикольте (2 моль/л). Рабочие растворы.

1) 0,15%-ный дезоксихолат натрия (ДОХ).

2) 72%-ная ТХУ,

3) БСА, 0,5 мг/мл. Срок хранения 5 сут (в холодильнике).

4) Реагент Л. Смешивают равные объемы исходных растворов ТКМ, NaOH, ДСН и воды (можно хранить 2 нед при 20 °С). Небольшой осадок не мешает определению, если перед употреблением хорошо встряхнуть раствор.

5) Реагент Б. Разбавляют водой реагент Фолина — Чикольте (1:5). Методика. Белок (5—10 мкг) разбавляют водой до конечного объема

1,0 мл. Добавляют 0,1 мл 0,15%-ного ДОХ и оставляют стоять 10 мин при 20 °С. Добавляют 0,1 мл 72%-ной ТХУ.' Перемешивают и центрифугируют при 3000 g 15 мин. Жидкость с осадка отделяют декантацией (процедура осаждения может быть опущена, если отсутствуют примеси или в процессе измерения их присутствие учитывается).

К осадку "белка добавляют 1 мл воды и 1 мл реагента А. Перемешивают до растворения и оставляют стоять 10 мин при 30 °С. Добавляют 0,5 мл реагента ?, быстро перемешивают. Через 30 мин измеряют поглощение при 750 нм. Уменьшение интенсивности окраски во времени составляет 1—2% в час при 20 °С. Зависимость поглощения от концентрации белка в логарифмических координатах линейна. Метод осаждения белка ТХУ из раствора в дезоксихолате применим как к растворимым, так и к мембранным белкам.

Белок в количестве 1 —10 мкг может быть определен по этой же методике с уменьшением объемов всех реагентов в 5 раз.

8.18.2.3. Другие модификации метода Лоури, приводящие к линейной зависимости.

Метод 1 [1441.

Реагенты.

Л. 2 г KNa-тартрата и 100 г Na2C03 растворяют в 500 мл 1,0 М NaOH и разбавляют водой до 1 л.

й. 2 г KNa-тартрата и 1 г CuS04 растворяют в 90 мл воды и добавляют 10 мл 1 М NaOH.

Реагенты А и Б пригодны к употреблению в течение 6 месяцев, если хранятся в полиэтиленовых емкостях.

В. Реагент Фолина — Чикольте разбавляют водой (1:15). При титровании 1 м NaOH до рН 10 (по фенолфталеину) раствор должен быть 0,15— 0,18 М по [H+J, готовится ежедневно.

Методика. Образцы исследуемого белка и белка-стандарта разбавляют водой до 10 мл в пробирке диаметром 13 мм. Добавляют 0,9 мл реагента Л, перемешивают и помещают на 10 мин в водяную баню при 50 °С. Охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,1 мл реагента Б, оставляют на 10 мин, затем максимально быстро добавляют 3 мл реагента В и перемешивают в течение 1 с. Нагревают 10 мин при 50°С. Охлаждают и измеряют поглощение при 650 нм (во избежание помутнения раствора кюветы по окончании работы промывают НС1).

8.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

295

Замечание. Поглощение при 650 нм на 30% ниже, чем при 750 нм, но интенсивность окраски выше, чем при использовании оригинального метода Лоури; кроме того, зависимость оптической плотности от количества белка линейна в диапазоне 15—ПО мкг. Утверждается, что низкая растворимость некоторых белков не затрудняет анализ. Влияют сахароза и тритон Х-100 (как и в исходной методике).

Метод 2 [156].

Ргагенты.

A. Растворяют 0,2 г тартрата натрия и 10 г Na2C03 в 55 мл 1 М NaOH. Разбавляют дистиллированной водой до 100 мл.

Б. Растворяют 2 г тартрата натрия и 1 г CuS04-5H20 в 90 мл воды. Добавляют 10 мл 1,0 М NaOH.

B. Разбавляют реагент Фолина — Чикольте дистиллированной водой (1 : 2). Раствор готовят ежедневно.

Методика. Белок растворяют в 150 мкл воды, приливают 100 мкл 2 М NaOH. Перемешивают на вибраторе и добавляют 180 мкл реагента А. Смешивают, оставляют стоять 30—45 мин при комнатной температуре. Добавляют 20 мкл реагента Б. Смешивают. Оставляют стоять 20 мин или несколько дольше. При интенсивном перемешивании добавляют двумя порциями по 300 мкл реагента В. Выдерживают при комнатной температуре 30—60 мин и измеряют поглощение при 650 или 750 нм. Строят градуировочный график в диапазоне 0—50 мкг белка.

Замечание. В общих случаях градуировочные графики линейны до величины поглощения 1,1 и несколько большей при измерении при 750 нм. Увеличение концентрации реагента В приводит к улучшению результатов. Присутствие ДНС не мешает определению.

8.18.2.4. Метод Лоури. Определение в присутствии детергентов.

Метод 1 [386]. Определение белка возможно в присутствии ДСН и тритона Х-100.

Реагенты.

A. Щелочной раствор меди. 250 мг этилендиаминтетраацетата меди растворяют в 800 мл дистиллированной воды. Добавляют 100 мл 20%-ного Na2C03 (масс/об.) и 10 мл 10,0 М NaOH. Перемешивают и разбавляют водой до 1 л.

Б. 10%-ный раствор ДСН.

B. Реагент Фолина — Чикольте (фирма Harleco) разбавляют водой (1:1).

Белок-стандарт. Растворяют 50 мг БСА в 50 мл 0,1 %-ного тритона Х-100. Аликвоты этого раствора разбавляют до концентрации по белку 40, 60, 80, 100 и 120 мкг/0,2 мл.

Методика. Помещают 0,2 мл раствора белка в пробирку и добавляют 1 мл реагента А. Смешивают на вибраторе и оставляют стоять при комнатной температуре 15 мин. Добавляют 1 мл реагента Б. Смешивают, добавляют 0,1 мл реагента В, выдерживают 30 мин, после чего измеряют поглощение при 500 нм.

Замечание. Добавление 10%-ного ДСН обязательно, поскольку ДСН предотвращает образование осадка при прнливании реагента Фолина к образцам, содержащим тритон Х-100. В диапазоне 40—120 мкг зависимость поглощения от количества белка линейна. Допустимое содержание тритона Х-100 в образце составляет <1%, при большей концентрации детергента необходимо добавить соответствующее количество белка-стандарта, чтобы компенсировать образование окраски. Предложено перед определением по методу Лоури удалять тритон Х-100 путем однократной экстракции изоамило-вым спиртом [245].

Метод 2 [50].

Методика. Используют те же реагенты, что и в методе 1. Белок разбавляют до объема 0,7 мл. Добавляют 1 мл реагента А. Смешивают и оставля-

296

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ют стоять при комнатной температуре 15 мин. Добавляют 0,5 мл реагента Б, затем 0,1 мл реагента В и быстро перемешивают. Оставляют стоять 30 мин при комнатной температуре, после чего измеряют поглощение при 500 нм. В качестве белка-стандарта используют БСА (0—60 мкг). Как стандарт, так и образец должны содержать одинаковое количество детергента.

Замечание. В присутствии ДСН (до концентрации 4,35%) допустимо наличие других детергентов до 1% (катскам, ионидет-Р40, твин-20) и 0,75% цетилтриметиламмонийбромида.

8.18.3. Определение белка с помощью биуретовой реакции

8.18.3.1. Микрометод f 180]. Реагенты.

А. 0,21%-ный раствор CuS04-5II20 в 30%-ном NaOH, Чтобы предупредить выпадение осадка гидроксила меди этот раствор готовят следующим образом: 21 мл 1%-ного (масс./об.) водного раствора CuS04-5H20 добавляют к 75 мл 40%-ного NaOH, а затем уже разбавляют во

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить съемную ручку для сковороды
Выгодное предложение от KNS digital solutions купить моноблок асус - мы дорожим каждым клиентом!
цена вентиляторов вод-100-ду
рико модус 2 в 1

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.05.2017)