химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

сации: ацетонитрил — пиридин —триэтиламин — вода (10:5:2:3). Стабилен в течение месяца при —5 °С. ФТК-аминокислоты устойчивы, если хранятся замороженными при рН 6,8.

Модификация. В небольшой пробирке высушивают досуха гидролизат белка или раствор аминокислот. Растворяют остаток в 100 мкл буфера для конденсации и высушивают досуха на роторном испарителе или высокоскоростном концентраторе (Speed-Vac Concentrator). Эта предварительная обработка необходима для удаления следов НС1 и дает возможность избежать появления постороннего пика на хроматограмме вблизи гистидина.

Добавляют 100 мкл буфера для конденсации и 5 мкл ФИТЦ. Оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Упаривают и затем сушат в глубоком вакууме (0,5—10~2 мм рт. ст.). Вновь растворяют образующиеся ФТК-аминокислоты в 250 мкл 0,05 М аммонийацетатного буфера или смеси вода — ацетонитрил (7:2). Вводят с помощью инжектора 1 —10 мкл (100—1000 пмоль каждой аминокислоты) на колонку с обращенной фазой. Аликвота может быть одновременно исследована на обычном анализаторе для контроля полноты превращения аминокислот в ФТК-производные.

ВЭЖХ. Используют обычно колонки (250X4,6 мм) с носителем Сз и С)8 и частицами 5 мкм (Altex, Dupont и IBM).

Системы растворителей:

Л. 0,05 ацетат аммония (рН 6,8), подкисленный фосфорной кислотой. Б. 0,1 М ацетат аммония (рН 6,8) в различных растворителях:

1) ацетонитрил — вода (50:50);

2) метанол — вода (80:20);

3) ацетонитрил — метанол — вода (44 : 10 : 46). В. Ацетонитрил — вода (70 : 30).

Прекрасное разделение ФТК-аминокислот было получено с использованием градиента растворителей (см. ниже) при температуре колонки 52 °С и общем времени анализа 30—40 мин. Поглощение измерялось в УФ-свете при 254 нм:

Приведенная методика описана в работе [76]. В табл. 8.1 приведены коэффициенты молярного поглощения ФТК-аминокислот (последние указаны в порядке их элюирования с колонки).

Процедура определения аминокислотного состава, называемая PICO-• ТАО™-анализом, заключается в обработке избытком ФИТЦ нескольких (до 12 одновременно) образцов и удалении летучих компонентов в вакууме в специально сконструированном приборе. В диапазоне 5—1000 пмоль зависимость величины сигнала от количества вещества линейна. Возможна автоматизация процесса. Все белковые аминокислоты включая аспарагин, глутамин, цистеи-новую кислоту, карбоксиметилцистеин, гомосерин, метионинсульфоксид и ме-тионинсульфон, гидроксипролин и гидроксилизнн могут быть проанализиро-

Время, мин

Содержание растворителя, % а В в

0

15 30 30,1 40

100 0 0

85 15 0

50 50 О

0 0 100

100 0 0

8.17. ГЛЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

285

Таблица 8Л. Коэффициенты молярного поглощения ФТК-аминокислот в системах растворителей Л, Б (1) и В (см. текст) [151]

Ампнокислота Молярное поглощение при 254 нм (1 моль/см) Аминокислота .Молярное поглощение при 254 нм (1 моль/см)

Ala 15772 Arg 13874

Glu 14465 Pro 15235

KM-Cys 15500 Туг 16524

Hyp 15420 Val 16295

Scr 14824 Met 16716

Gly 15326 Не 21375

His 12645 Leu 17069

Thr 15152 Phe 16293

Ala 16316 Lys 30224

ваны на специальной колонке PICO-TAG™. Результаты разделения стандартной смеси аминокислот (фирма Pierce Н) в количестве 250 пмоль и 1 имоль (за 12 мин) приведены на рис. 8.8 и 8.9.

8.17. Газожидкостная хроматография аминокислот

Аминокислоты могут быть превращены в летучие производные и затем проанализированы с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Существует единственный метод одностадийной модификации — триметилсилилирование, разработанный для качественного и количественного анализа всех белковых аминокислот [119, 121]. Серьезный недостаток метода заключается в том, что некоторые аминокислоты образуют мультиплет-ные пики; однако этим методом удается определить Asp и Glu в присутствии Asn и Gin.

Наиболее удачные варианты метода включают две стадии: 1) этерификацию карбоксильных групп и 2) ацилирование других реакционноспособных групп (амино-, гидрокси-, сульфгидрильных, гуанидино-). В табл. 8.2 приведены производные аминокислот, которые, как было показано, дают наилучшие результаты при разделении ГЖХ.

Подробному рассмотрению анализа аминокислот методом ГЖХ посвящены ряд отличных обзоров [28, 30, 170, 229, 395] и специальная монография [422].

При освоении этого метода нетрудно получить удовлетворительные качественные результаты, но достижение корректной количественной их оценки требует большей настойчивости. Ряд осложнений может возникнуть, в частности, с определением гистидина, аргинина, цистина, которые разрушаются на некоторых стационарных фазах [90, 123]. Наиболее интенсивно количественные исследования проводились Герке и его группой с «-бутиловыми эфирами трифтороацетиламинокислот и Маккензи и

Glu Ser Gly His Arg Thr Ala Pro

10 NH

11 Tyr

12 ш

13 Met H Cy& /5 lie 10 Leu 17 Phe /в Lys

> >

h

S

m о

к

tn

% m н О ?a

Время, мин

РИС. 8.8. Анализ методом Pico-Tag™ смеси аминокислот (250 пмоль, Pierce). Условия: Р1со-Т৙-колонка (фирма Waters), 38°С, детекция при 254 нм, шкала 0,1 отн. ед. Растворитель Л: 6% ацетонитрила+94% 0,14 М ацетата натрия+3,6 мМ триэтиламина (рН 6,4). Растворитель Б: 60%-ный ацетонитрил в воде. Скорость потока 1 мл/мин. Градиент: 0—46% Б, 10 мин, промывка — 100% Б. (С разрешения Waters Associates.)

Asp Glu Ser Gly His Arq Thr S Ala 9 Pro

Ю NH3

11 Tyr

12 Val

13 Met /4 Cys /5 He Ю Leu 17 Phe /S Lys

Waters 7284

РИС. 8.9. Анализ метолом Pico-Tag™ 1 пмоль аминокислот (фирма Pierce Н). Шкала на 0,005 отн. ед., остальные условия, как на рис. 8.8. (С разрешения Waters Associates.)

283

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Таблица 8.2. Некоторые производные аминокислот для газожидкостной

хроматографии

Эфир Ацильная группа Литература

Метиловый Трифтороацетильная 91, 73

w-Пропиловый » 117, 118

Гептафторобутирильная 198, 239

я-Бутиловый Трифтороацетильная 315, 122, 422

Пзобутиловый Гептафторобутирильная 231,232, 233, 289,339, 96,

260, 57, 58, 261

Изоамиловый 418, 109

Танашук, изучавшими изобутиловые эфиры гептафторобутирил-аминокислот. Методики синтеза последних соединений, с которыми приходилось работать автору, приведены ниже.

Большинство исследователей для этерификации карбоксильных групп использовали метод Фишера — обработку спиртами с различной концентрацией НС1. Было предложено несколько модификаций, направленных на увеличение выходов продуктов. Обычно используется прямая, одноступенчатая процедура этерификации, но были разработаны и методы переэте-рификации [120, 352], в которых метиловые эфиры аминокислот превращались в я-бутиловые, что позволяло избежать осложнений с трудной растворимостью некоторых аминокислот в высших спиртах. Однако позднее исследователи вернулись к первоначальному одностадийному варианту [316].

8.17.1. Общая методика приготовления образцов

К гидролизату белка добавляют определенное количество внутреннего стандарта, обычно норлейцина, поскольку он хорошо разделяется со всеми другими аминокислотами, по применялись также пипеколиновая и транэксамовая кислоты и гомоаргинип. Некоторые биологические препараты требуют предварительной очистки.

Очистка биологических препаратов. Образцы плазмы (100—500 мкл) де-протонизируют обработкой сульфосалициловой кислотой (50 мг/мл плазмы).

1) Пастеровскую пипетку (40X3 мм) заполняют на 10 мм смолой дау-3kc-50W (8% поперечных сшивок, 200—400 меш, Н+-форма); сверху и снизу набивки помещают небольшие пробки из стеклянной ваты.

Добавляют к образцу известное количество внутреннего стандарта, подкисляют до рН I и наносят на колонку. Удаляют некатионные примеси промывкой 2 мл деионизованной воды. Аминокислоты элюируют 2 мл 4 М NH4OH со скоростью —1 капля за 5—10 с. Элюат высушивают досуха [96].

2) Аминокислоты вновь растворяют в 0,1 М НС1 и наносят на колонку (150X15 мм) с 7 мл катионообменной смолы амберлит CG-120 (Н+-форма, 100—120 меш). Промывают дважды 10 мл деионизованной воды. Элюируют

8.1?. ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

289

аминокислоты 2X10 мл 7 М NH4OH, затем 5 мл деионизованной воды. Собирают элюат и высушивают досуха в вакууме на роторном испарителе при 60 °С [1931.

8.17.^.1. Изобутиловые эфиры гептафторобутириламинокислот [231—233]. В большинстве случаев чувствительность пламенно-ионизационного детектора бывает достаточной для обнаружения этих производных. Для специальных целей использовались детекторы электронного захвата и термоионный, а также метод масс-спектрометрии [96, 230].

До и после этерификации следовые количества воды из образца могут быть удалены ацеотропной сушкой путем добавления метиленхлорида и упаривания. Для эффективного смешивания компонентов в процессе этерификации и ацилирования используют обработку ультразвуком или вибромешалки.

Приготовление спиртовых растворов НС1 для этерификации. Спирт следует высушить над гранулированным сульфатом кальция ( — 50 г/л) или кипячением 3—4 ч над магниевой стружкой (с добавлением кристаллика иода, чтобы катализировать реакцию); после декантации кипятят еще 3—4 ч над гидридом кальция и перегоняют.

Необходимую молярную концентрацию ПС! получают пропусканием сухого газообразного HCI в спирт до насыщения или до соответствующей массы, а затем после титрования щелочью разбавляют раствор до необходимого объема. Хранят в небольших склянках на холоду.

Когда требуется небольшое количество реагента для единичного образца, готовят его добавлением соответствующего количества ацетилхлорида к спирту на холоду (операция требует осторожности, поскольку реакция эндо-термична) и доводят до нужного объема.

Этерификация. Образец смеси аминокислот (10—100 нмоль каждой аминокислоты) высушивают при 50 °С в сосуде типа Reactivial (фирма Pierce) в потоке сухого азота. Добавляют раствор 3 М НС1 в изобутаноле (50— 100 мкл) и выдерживают при 120 °С 30 мин. Через 5 мин после начала нагревания реакционную смесь встряхивают 20—30 с на вибраторе и продолжают нагревание. Охлаждают до комнатной температуры. Упаривают избыток реагента в потоке азота, это делается быстро, если сосуд нагрет до 50 °С. Следы воды могут быть удалены азеатропной сушкой с метиленхлоридом. Аналогичным образом были получены н-пропиловые эфиры аминокислот [118].

Ацилирование. Добавляют ангидрид гептафторомасляной кислоты (50 мкл) и нагревают при 150 °С 10 мин. После охлаждения до комнатной температуры образец высушивают досуха в потоке азота. Слишком длительное выдерживание в потоке азота может привести к потере некоторых летучих производных.

Растворяют остаток в сухом перегнанном ацетонитрнле или этилацетате (50 или 100 мкл). Вводят 1—2 мкл на колонку ГЖХ. Если в смеси присутствует гистидин, образец растворяют в смеси этилацетата и уксусного ангидрида (1:1) и нагревают 3 мин при 150°С; по охлаждении до комнатной температуры разбавляют этилацетатом. Реакцию лучше всего проводить в нагревательном блоке, лунки которого заполнены силиконовым маслом на высоту жидкости в реакционном сосуде, при этом его верхняя часть служит обратным холодильником.

Поскольку в реакционных сосудах возможны потери из-за негерметичности, предпочтительно использование трубок (50X3 мм) из стекла пирекс, их запаивают и вскрывают на каждой стадии процесса.

Рекомендуется проводить анализ на колонке как можно быстрее после окончания реакции ацилирования (не позднее чем через 2—3 ч), что особенно важно для сохранения производных цистеина, цистина, метионина, аргинина, гистидина.

Колонки. Хорошее разделение и количественное определение изобутило-вых эфиров гептафторобутириламинокислот достигнуто несколькими группа-

19-703

290

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ми исследователей. При этом были использованы различные типы колонок (описаны ниже), но порядок элюирования был одинаковым во всех случаях. Для улучшения разделения могут быть введены изменения в температурную программу. Скорость потока газа-носителя, температура узла ввода и детектора подбираются индивидуально для каждого прибора и исследуемой колонки.

1. Капиллярная стеклянная колонка (25 мХ'0,4 мм), покрытая смесью фаз 5% хромосорба 4-15% OV-101. Газ-носитель — водород (3 мл/мин); газ-ускоритель— азот (30 мл/мин), водород (27 мл/мин), воздух (350 мл/мин). Температура колонки 90°С, повышение но программе (4 град/мин). Порядок элюирования в течение 35 мин: Ala, Gly, Val, Tfir, Ser, Leu, He, Nle, Pro, Cys, пипеколиновая кислота, Hvp, Met, Asp, Phe, Glu, Lys, Tyr, Arg, KM-Cys, His, HomoArg, Trp, Cys-Cys [57, 58|.

2. Капиллярная колонка (25 мХ0,23 мм), покрытая стационарной фазой OV-101 (фирма LKB) [9б|.

3. Стеклянная капиллярная колонка SCOT (60 мХ0,5 мм) со стационарной фазой SL-30 (фирма SGE) [289].

4. Стеклянная колонка (3,5 мХ2,5 мм), упакованная смолой Gas-Chrom Q (100—120 меш) с 3% фазы SL-30 (по массе) (Applied Science Laboratories) [2311.

5. Стеклянная колонка (3,1 мХ2 мм), упакованная хромосорбом WI1P (100—120 меш) с 3% фазы SE-30 |232, 233].

6. Стеклянная колонка (3,5 мХ2 мм) с Gas-Chrom Q (80—100 меш) с 3% фазы SE-30 (фирма Supelko) [289|. '

7. Стеклянная колонка (6 мХ2 мм), упакованная Gas-Chrom Q (80— 100 меш) с 3% фазы OV-101 |339].

8.18. Количественное определение белка

8.18.1. Введение

Количественное определение белков может быть осуществлено разными методами, основные из них рассмотрены ниже. В качестве стандарта обычно используют бычин сывороточный альбумин (БСА), его следует высушить в вакууме при 60 °С над Р2О5 до постоянной массы (удобно делать это в «пистолете» Фишера). 1%-ный раствор БСА при 280 им в 1-сантиметровой кювете имеет А = 6,6 [362]. На практике при незначительном количестве белка невозможно определить точную массу образца, так как в образце содержатся минеральные примеси и влага [162]. В настоящее время общепринятым методом количественного определения белка является аминокислотный анализ. В 1973 г. были изучены образцы 350 белков и сделано заключение, что анализ, основанный на определении азота в белке, дает в большинстве случаев согласующиеся результаты.

8.18.1.1. Гравиметрический анализ. Этот метод требует значительных количеств материала (порядка миллиграммов).

8.18.1.2. Определение азота. Этот метод также требует большого количества белка, значительных затрат времени и достаточно сложен в экспериментальном отношении. Методика Кьельдаля

иль. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

291

основана на полном разрушении белка под действием серной кислоты в присутствии катализатора. Азот белка улавливается в форме сульфата аммония и определяется в виде аммиака после перегонки с паром гидролизата, подщелаченного добавлением концентрированной NaOH. Аммиак обычно анализируется обратным титрованием после поглощения в кислотных ловушках, хотя возможны и другие методы, такие, например, как колориметрия или применение электродов, чувствительных к аммиаку [72]. Разработана система, объединяющая прибор для определения аммиака по Кьельдалю с программируемым устройством для титрования (фирма Buchi Lab. Techniues Ltd.). Метод все еще широко используется в пищевой и пивоваренно

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
профнастил купить г. рязань
Стол Левмар Cross Lt
Сервировочные столы MIK
Стулья детские для школ, детских садов и дошкольных учреждений, производство детских стульев

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)