химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

о производного с ОФА с максимумом возбуждения при 360 нм и максимумом эмиссии при 455 нм происходит при рН 9—11. Лизин дает слабую флуоресценцию, усиливающуюся при добавлении реагента бриджа. Цистеин реагирует только в присутствии иодоуксусной кислоты [78], а цистин лучше определять в виде цистеиновой кислоты после окисления надмуравьиной кислотой. Пролин, гидр-оксипролин и вторичные амины вступают в реакцию только после окисления хлорамином-Т, N-сукцииимидом или гипохлоритом [33, 178, 321]. Если нет необходимости определять пролин и гидроксипролин, то безусловно выгодно использовать ОФА; чувствительность определения производных достигает 5 пмоль, для нингидрина она составляет 100 пмоль, как для первичных, так и для вторичных аминогрупп. Среднее относительное стандартное отклонение для аминокислот равно 6% (разброс 3—24%) [85].

Более поздние методы определения аминокислот с постколоночной модификацией основаны на использовании таких флуо-рогенов, как 7-хлоро-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол, позволяющий обнаружить все аминокислоты, включая пролин и гидро-оксипролин, на уровне 1 пмоль [415], и 4-фторо-7-нитробензо-2,1,3-оксадиазол [391] с пределом обнаружения 5 пмоль для про-лина и 20 пмоль для других аминокислот.

8.16.3.2. Пред колоночная модификация. Применение постколоночной модификации сопряжено с техническими трудностями осуществления смешивания каждой разделяемой аминокислоты в элюате с раствором реагента в соответствующих, оптимальных для реакции условиях. Провести предколопочную обработку аминокислот реагентами проще, а полученные соединения могут быть разделены с помощью ОФ-ВЭЖХ, но по имеющимся данным, воспроизводимость результатов уступает достигаемой в постколоночном методе. Наиболее изученные производные аминокислот— фенилтиогидантоины — продукты деградации пептидов по методу Эдмана (гл. 13) не использовались непосред-

8.1G. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

279

ственно для анализа аминокислот, хотя детально разработаны несколько методов их идентификации, в том числе ВЭЖХ [186, 420]. Методом ВЭЖХ за 30 мин разделяются также окрашенные аналоги ФТГ — диметиламиноазобензолтиогидантоины [412] (см. гл. 14).

Обзор по прсдколоночной модификации аминокислот и пептидов с последующим разделением производных ВЭЖХ см. в работе [360].

Данейламинокислоты. Для идентификации дансиламииокис-лот при определении аминокислотной последовательности белков широко используется метод тонкослойной хроматографии (гл. 10 и 11). Недавно дансильные производные были успешно разделены па колонках с обращенной фазой [15, 152, 167, 202, 330, 340, 363, 394, 403]. Чувствительность обнаружения составляет 100 пмоль при спектрофотометрическом и несколько фем-тамолей при флуоресцентном [15, 202] или хемилюмииесцент-пом определениях [166, 200].

Дансильные производные при анализе аминокислот не дают результатов, сравнимых с получаемыми при использовании ОФА. Один из недостатков дансилирования состоит в том, что для одной аминокислоты возникает несколько пиков, например пик О-дансилтирозина и 0,Ы-дидансилтирозина наряду с пиком N-дансилтирозина. Преимущество же состоит в возможности одновременной с другими аминокислотами идентификации пролина и гидроксипролина. Было предложено применять [403] дансильные производные аминокислот для анализа состава пептидов с высокой степенью чувствительности и для количественного определения N- и С-концевых остатков, в частности С-коп-цевых остатков амидов аминокислот, отщепленных ферментативными методами от амидированных пептидов на уровне 50 пмоль с УФ-детекцией [340]. d- и l-изомеры дансиламино-кислот разделены методом ВЭЖХ [209, 208].

Производные с о-фталевым альдегидом. о-Фталевый альдегид реагирует с аминокислотами в присутствии р-меркаптоэта-пола при 25 °С с образованием замещенного изоиндола [341]. Соединения, не содержащие а-водородного атома, дают флуоресцентный сигнал, составляющий по интенсивности <1% флуоресценции эквивалентного количества глицина [83], для цистина эта величина составляет 3%, даже если реакция проводится при 100 °С [84].

В присутствии меркаптоэтанола реакция ОФА с первичными аминогруппами завершается за 0,1—1,0 мин, но образующиеся производные глицина, лизина, гидроксилизина и фосфосерина имеют период полупревращения 1—4 мин [374]. Была изучена стабильность ОФА-2-меркаптоэтанолпроизводных аминокислот [80] и проведено их разделение методом ВЭЖХ за 22 мин [79];

28Э

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

показано, что разрушение продуктов может быть сведено к минимуму при быстром введении в колонку. Интенсивность флуоресценции для лизина и гидроксилизина повышается до 40— 50% при добавлении к реакционному раствору реагента бридж-35. Цистин может быть определен количественно в виде цистеиновой кислоты и карбоксиметилцистеина.

Вторичные аминокислоты (пролин и гидроксипролин) не взаимодействуют с ОФА непосредственно, но при их окислении гипохлоритом образуются первичные аминогруппы, вступающие в реакцию. Эти аминокислоты могут быть определены также после модификации 4-хлоро-7-нитробензофураном (НБФ) [376]. Прекрасные результаты были получены при разделении ОФА производных аминокислот методом ВЭЖХ с флуорометриче-ским детектором [79, 160, 161, 163, 187—189, 210, 219, 376].

Новые возможности не только для повышения чувствительности определения, но и селективности обнаружения некоторых производных, например основных аминокислот [191], открывает применение электрохимических детекторов.

Автоматизация анализа флуорогенных соединений предъявляет повышенные требования к их устойчивости, которым не удовлетворяют аддукты ОФА-меркаптоэтаноламинокислоты. Более длинный период полупревращения имеют ОФА-этантиоль-ные производные. Хотя падение интенсивности флуоресценции на 20—50%) за 6—8 ч наблюдается и у этих соединений [342], процесс их синтеза и последующего разделения в автоматическом варианте был опробован при исследовании аминокислот плазмы [111].

В 1984 г. описан [74] автоматический рутинный метод анализа ОФА-производных аминокислот на колонке Altex Ultra-sphere ODS (250x4,6 мм) с размером частиц 5 мкм с предко-лонкой Brownlee, заполненной сорбентом Cis (5 мкм). В этой системе без смены носителя удалось проанализировать более 2000 образцов.

ОФА был введен в программу автоматического анализа аминокислотной последовательности на секвенаторе для блокирования а-амииогрупп «остаточных» пептидов, когда пролин становится N-концевым в определяемой последовательности [41].

Реагенты для модификации с помощью ОФА.

ЮФА-реагент \214]. Растворяют 62 г борной кислоты и 25 г КОН в 900 мл воды. Подщелачивают до рН 10,4 45%-ным КОН и доводят до объема 1 л. Фильтруют через мембрану Millipore 0,22 и добавляют 2 мл меркап-тоэтанола, 6 мл 30%-ного (масс/об.) бридж-35 и 1,2 г ОФА, растворенного в 15 мл метанола. Выдерживают в течение ночи в темноте под азотом при комнатной температуре. Реагент стабилен в течение 1 мес под азотом при 4°С. ОФА использовался для определения аминокислот на уровне 10 пмоль [214] и фосфоамииокислот (разд. 8.11.2.3).

Реагент ОФА — этантиол [206]. Растворяют 100 мг ОФА в 5 мл метанола. Добавляют 50 мкл этантиола (ЭТ) и 10 мл 0,15 М натрийборатного бу-

8.1G. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

281

фера (рН 10,5), содержащего 0,2% реагента бридж-35. Смесь продувают азотом и оставляют стоять в темноте по крайней мере на 16 ч. Для сохранения стабильности каждые 4 дня к реагенту добавляют 10 мкл ЭТ (разд. 8.12.2.3).

Предколоночная дериватизация ОФА [187, 188].

Реагенты. Растворяют 50 мг о-фталевого альдегида в 1,25 мл метанола и добавляют 50 мкл 2-меркаптоэтанола и 11,2 мл 0,4 М боратного буфера подщелаченного до рН 9,5 с помощью 4 М NaOH. Реагент стабилен в течение 1—2 недель. Можно использовать раствор реагента фирмы Pierce. Он содержит ОФА в боратном буфере с добавкой реагента бридж-35 и 2-меркаптоэтанола. Реагент стабилен 6 мес при 4 °С.

Модификация. Белок гидролизуют в 6 М НС1, лиофилизуют и остаток растворяют в воде. Если для гидролиза использовалась метансульфокислота, гидролизат нейтрализуют 4 М NaOH. Разбавляют, если необходимо, 0,4 М боратным буфером (рН 9,5) до получения конечной концентрации по каждой аминокислоте <25 нмоль/мл. Перед гидролизом белок может быть окислен или карбоксиметилирован.

Аликвоту раствора образца 5—10 мкл смешивают с 5 мкл раствора реагента. Через одну минуту добавляют 20—100 мкл ацетата натрия (рН 7,0) и немедленно 20 мкл наносят на колонку. Внутренним стандартом служит 2-аминоэтан ол.

Анализ сыворотки мочи или спинномозговой жидкости. Смешивают 25 мкл образца при энергичном размешивании с 75 мкл ацетонитрила. Центрифугируют при 1000 g 2 мин. Берут 10 мкл аликвоты для обработки ОФА.

ВЭЖХ. Используют колонки с носителем Ultrasphere ODS (45-^-240) X Х4,6 мм с размером частиц 5 или 3 мкм и Microsorb Ci8 (100X4,6 мм). Необходима предохранительная колонка (СО : PELL сорбент ODS, 40 мкм), особенно для колонок с носителем Cie и размером частиц 3 мкм. Длина колонки практически не влияет на эффективность разделения аминокислот, поэтому предпочитают укороченные колонки (45—100 мм) для сокращения времени анализа. Иногда проблему составляет достижение четкого разделения глицина и треонина. Дело в том, что колонки даже одной фирмы значительно различаются между собой. В некоторых случаях глицин и треонин разрешаются полностью, на других колонках не удается достичь полного разделения даже варьированием состава элюирующей системы.

Измерения проводят на флуориметре с кюветой 9 мкл и фильтрами для возбуждения при 305—395 нм и эмиссии при 420—650 нм.

Для градиентного элюирования смешивают два предварительно дегазированных раствора:

Раствор А. 0,1 М ацетат натрия, рН 7,2 (для гидролизатов белков) или рН 6,4 (для физиологических жидкостей). Раствор Б. Абсолютный метанол.

Линейная зависимость площади пика от количества нанесенного образца сохраняется в диапазоне 500 фмоль — несколько сотен пикомолей вещества; при содержании <5 пмоль наблюдаются значительные отклонения от линейности для таких аминокислот, как серии, глицин, аланин, из-за наложения фоновых примесей. В этих случаях необходимо проводить коррекцию результатов путем вычитания данных «глухого» опыта. Для большинства аминокислот чувствительность 25—50 фмоль, рабочий интервал 50 фмоль — 1 нмоль. На рис. 8.6 приведены результаты разделения аминокислот на колонке со смолой Ultraspere ODS (3 мкм) за 13,5 мин. Кривые элюирования гидролизатов вазопрессина и соматостатина в аналогичных условиях представлены на рис. 8.7.

Замечание. Смесь, содержащая более 60 аминокислот и аминов, была разделена с использованием предколоночной модификации с ОФА. Недавно на колонке Perkin Elmer Ci8 (4,6X32 мм), размер частиц 3 мкм (Jones, частное сообщение), проведен анализ менее чем за 7 мин. Цистеин определялся в виде карбоксиметильного производного, а метионин—в виде метионин-S-

282 8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

I___I_I_

О 5 10 :5

Время, мин

РИС. 8.6. Профиль элюирования смеси аминокислот, модифицированных ОФА. В каждом пике 40 пмоль вещества. Система ВЭЖХ включает два насоса (фирма Beckman, модель 100А), микропроцессор для создания режима градиентного элюирования (фирма Beckman, модель 421) и флуориметр (фирма Gilson, модель 121), снабженный 9-мкл кюветой и фильтрами с полосой пропускания 305—395 нм (для возбуждающего света) и 420—650 нм (для эмиссионного излучения). Эмиссионный фильтр снабжен диафрагмой с отверстием диаметром 2 мм. Диапазон шкалы флуориметра 0,1 отн. ед., временная константа 0,5 с. Образцы вводились в колонку с помощью инжекционного клапана (фирма Beckman, модель 210), снабженного петлей объемом 20 мкл. Хроматогра-фические пики записывались и обрабатывались с помощью интегратора системы C-RIA. Колонка с обращенной фазой Ultrasphere ODS (75x4,6 мм, частицы 3 мкм) соединена с предколонкой (30x2,1 мм), наполненной сорбентом СО: PELL ODS (частицы 40 мкм). Скорость потока 1,5 мл/мин, исходное давление на колонке 3100 psi. Любезно предоставлено д-ром В. N. Jones. Седьмой пик слева направо Asn.

оксида; пролин и гидроксипролин — по методу, описанному в работе [3761.

Предколоночная дериватизация с 4-хлоро-7-нитробензофураном (НБФ) [3761 используется для модификации пролина и гидроксипролина. Аликвоту нейтрализованного образца разбавляют, если нужно, до конечной концентрации пролина —20 нмоль/мл. Смешивают равные объемы 0,4 М боратного буфера (рН 9,5) и метанольного раствора НБФ (2 мг/мл). Нагревают при 60 °С 5 мин в закрытом сосуде. Реакцию останавливают охлаждением до 0 °С Аликвоту раствора наносят на колонку.

ВЭЖХ. Используется колонка Ultrasphere (250X4,6 мм) с частицами 5 мкм.

8.16. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

283

0,10}-

0,05 /

Asp гмг

6/ПМОЛЬ

Glu

32 пмЬль

0,10-

0,05^"

Gly

32 пмоль го

ЕА Туг | ЗОпмоль

Ser

30 пмоль

Phe

ЗОпмоль

Phe

3?п20пмольГКу Опмрль Gly

20 пмоль

J

Ala

20 пмоль TrP ,

20 пмоль

10

Время ,мин

15

100

со ^

50 36.

«=to

О СО

и"

03

100 ^ из

о

Jo

РИС. 8.7. Профили элюирования гидролизатов двух карбоксиметилированных полипептидов. Количество вещества в каждом пике выражено в пикомолях. а — кислотный гидролизат вазопрессина; найденные количества аминокислот находятся в хорошем соответствии с известным составом полипептида: Asp, Glu, СМС2, Gly, Arg, Туг, Phe; б — ферментативный гидролизат соматостатина; ожидаемый состав соматостатина из данных аминокислотной последовательности; СМС2> Asn, Ser, Gly, Thr2, Ala, Trp, Phe3, Lys2.

Растворитель А. Тетрагидрофуран — 0,05 M ацетат натрия (pH 6,6) (1 :99).

Растворитель Б. Метанол.

Линейный градиент от 30% до 45% Б при скорости 1,5% Б в минуту. Скорость потока 1,0 мл/мин.

Обнаружение при длине волны возбуждения света 220 нм, эмиссии до 370 нм и шкалой чувствительности 0,1 мкА, НБФ-аддукты пролина и гидро-ксипролина элюируются в этих условиях за 6 мин.

Фенилтиокарбамильные производные. Реакция фенилизотиоцианата (ФИТЦ) с аминокислотами изучена детально, поскольку она лежит в основе методики деградации пептидов по Эдману, конечными продуктами которой являются фенилтиогидантоины [104]. Первая стадия этой реакции — образование фенилтиокарбамильных (ФТК) производных — используется для количественного определения аминокислот в так называемом PICO-TAG™-aHa-лизе, разработанном и внедренном фирмой Waters. ФТК-аминокислоты стабильны, легко синтезируются и успешно идентифицируются после разделения методом БЭЖХ на обращенной фазе. В реакцию вступают как первичные, так и вторичные аминогруппы аминокислот и разделяются все производные одновременно. Обнаружение с УФ-детектором при 254 нм; это дешевле и

284

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

проще, чем применение флуориметра для ОФА-производных. Для анализа был использован S35, меченный ФИТЦ [76, 151, 199].

П'редколоночная модификация фенилизотиоцианатом [151].

Реагенты. ФИТЦ (в 1-миллиметровых ампулах, запаянных в вакууме), триэтиламин («для секвенирования»), аминокислоты (фирма Pierce). Пиридин и триэтиламин перегнаны над нингидрином и гидридом кальция. Ацетонитрил и метанол для ВЭЖХ (фирма Burdik and Jackon). Буфер для конден

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
московская юридическая коллегия
Фирма Ренессанс: цена винтовой лестницы- быстро, качественно, недорого!
мебель домашнего кинозала
Стол-трансформер Терра Geisha

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.01.2017)