химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

обильно им опрыскивают хроматограмму. Цистеин, цистин, метионин и восстанавливающие агенты дают белые пятна на красно-фиолетовом фоне. Фенолы и лутидины, использованные в системе растворителей, должны быть удалены промывкой хроматограммы эфиром, ацетоном и т. д.

3. Применение нитропруссида натрия.

А. Растворяют ннтропруссид натрия (1,5 г) в 5 мл 1 М серной кислоты. Добавляют 95 мл метанола и 10 мл 28%-ного аммиака. Фильтруют и хранят при 0—4°С.

Б. Растворяют 2 г цианида натрия в 5 мл воды и разбавляют до 100 мл метанолом. Далее:

а) для обнаружения цистеина используют реагент Л;

б) для обнаружения цистина хроматограмму погружают в реагент Л или опрыскивают им. Слегка высушивают и во влажном состоянии обрабатывают реагентом ?;

в) для обнаружения цистеина и цистина готовят растворы реагентов с двойной концентрацией и обрабатывают хроматограмму смесью равных объемов Л и Б.

Аспарагин [288].

После окрашивания нингидрином хроматограмму погружают в 5%-ный водный раствор бората, промывают водой и высушивают. Аспарагин проявляется в виде голубого пятна.

Аспарагин дает реакцию с нингидрином на хроматографической бумаге, но его идентификация затруднена в тех случаях, когда рядом с ним расположены аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, серии или некоторые другие

8.15. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

271

аминокислоты. Обработка боратом приводит к возникновению голубого окрашивания, характерного только для аспарагина. В выековольтном электрофорезе при рП 5,8 аспарапш слегка сдвигается к катоду, а аспарагнновая кислота движется к аноду.

Фосфаты (по Шмидту и Таннхаузеру).

Реагенты

Молпбдат аммония 1 г (топко измельченный) растворяют в 8 мл воды. Концентрированная IIC1. Хлорная кислота, 12 моль/л. Ацетон.

Реагенты берут в соотношении 8:3:3: 86.

Методика. Готовят реагент (смешением указанных объемов компонентов). Погружают в пего бумагу и затем высушивают. При освещении УФ-све-том (>30 мин) моно-, ди- и трнфосфаты нуклео.шчов проявляются в виде голубых пятен.

Сахара [36|. Опрыскивают хроматограмму 6,5 мМ раствором Ы-(1-наф-тнл)этилендиампндигидрохлорида (фирма Baker) в метаноле, содержащем 3% серной кислоты. Нагревают при 100 °С. Цветные пятна (цвс варьирует от коричнево-красного для аскорбиновой кислоты до сине-серого шя дезок-спглюкозы) проявляются на белом фоне. Метод может прпмеь гься для количественного анализа Сахаров.

Применение паров иода. Помещают высушенную бумагу и тонкослойные пластинки в стеклянную камеру, наполненную парами пода. Некоторые производные аминокислот, индолы п другие соединения обнаруживаются по быстрому окрашиванию с образованием темных пятен на бледном фоне.

Другие недеструктивные методы обнаружении см. |12|.

Дополнительная литература. С подробностями применения многих локализующих реагентов можно познакомиться в работах [58, 94, 344]. Описано последовательное применение различных реакций на хроматограммах при пептидном картировании [102].

8.15. Тонкослойная хроматография аминокислот

Тонкослойная хроматография (ТСХ)—простейший и наиболее доступный метод разделения аминокислот, по возможности количественной оценки результатов этим методом весьма ограниченны. Идентификация индивидуальных пятен может быть сделана только тщательным сравнением хроматограмм, полученных для стандартных аминокислот, разделенных в идентичных условиях параллельно (в то же самое время). Описаны методы приготовления пластинок со слоем силикагеля и целлюлозы и условия разделения аминокислот двумерной хроматографией [44]. Ряд фирм выпускает пастипки для тонкослойной хроматографии, дающие воспроизводимые результаты.

8.15.1. Методы разделения

1. Описано разделение 24 аминокислот, в том числе лейцина и изолейцина, на пластинках 200x200 мм, покрытых слоем целлюлозы MN-300 (фирма Macherey Nagel and Со.) толщиной 100 мкм [190]. Общее время анализа 6 ч.

272

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Растворитель для первого направления: пропан-2-ол-муравь-иная кислота — вода (40:2:10); для второго направления; грег-бутанол — мстиэтилкетон — 0,88 NH3 — вода (50 : 30 : : 10: 10).

2. Предложена улучшенная система растворителей, позволяющая разделить 40 аминокислот и родственных соединений на целлюлозных пластинках MN-300 без связующего агента [147]. Растворитель для первого направления: пропап-2-ол — 2-бута-иои—1 М НС1 (60: 15:25), для второго направления: 2-метил-пропапол — 2-бутапоп — пропапон — метанол — вода — 0,88 Nib (40 : 20 : 20 : 1 : 14:5). Пластинки перед употреблением промывают от загрязнений. Камера должна быть насыщена каждым из компонентов смеси растворителей. После прохождения в первом направлении высушивают пластинку 15 мин холодным воздухом, зат^ м 15 мин при 60 °С для удаления следов НС1 перед хромате рафией во втором направлении. Время прохождения растворителей в каждом направлении 2,5 ч. На рис. 8.3 схематически показаны результаты разделения смеси 24 аминокислот.

Та же система растворителей была использована для разделения 76 N-содержащих метаболитов, найденных в биологических жидкостях; идентификация осуществлялась с помощью селективно окрашивающих реагентов [149] (разд. 8.14).

3. Тонкослойные пластинки Avicel (фирма Analtech) исследованы для одно- и двумерного разделения аминокислот в 6 системах растворителей. Приведены значения Rf для 35 аминокислот. В препаративных экспериментах использовалась нагрузка до 0,05 М вещества [87].

4. Разделение 19 аминокислот проведено на тонкослойных пластинках с обращенной фазой, в том числе с Ci8, химически связанной с силикагелем [338].

5. Представляет интерес разделение 24 аминокислот на вольфрамате олова, однако этот метод не дает никаких преимуществ по сравнению с другими методами [272].

8.16. Колоночная хроматография аминокислот

8.16.1. Колонки и буферы

Сульфированный полистирол, сшитый с дивинилбеизолом, впервые использован Муром и Стейном в ионообменной хроматографии аминокислот [263—267, 348] и до настоящего времени широко применяется в лабораторной практике [347].

Аминокислоты в катионной форме при низком рН связываются с отрицательно заряженными сульфогруппами носителя. С повышением рН элюирующего буфера (обычно цитрата натрия) уменьшаются положительные заряды аминокислот и тем

8.16. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

273

О 23

«О

2*0 о о

О

0* О

О" 'О О'9 о о

'О 09" ° о*

О*

о

21

Растворитель 2 -».

РИС. 8.3. Двумерная тонкослойная хроматография аминокислот на пластинках с целлюлозой. Состав растворителей указан в тексте.

/—Ala, 2 — Arg, 3 — Asp, 4 — Asn, 5 —Cys, б —Cys-Cys, 7—Суа, S —Glu, 9 — Gin, /0 —Gly, // — His, /2 —Hyp, /3 — He, 14 — Leu, /5 —Lys, /6 — Met, /7—Nle, 18 — Phe, /9 — Pro, 20 — Ser, 21 — Thr, 22— Trp, 23 —Tyr, 24 — Val [1471 (c разрешения авторов).

самым силы взаимодействия со смолой, что приводит к их последовательному элюированию с колонки. Определяет очередность выхода аминокислот с колонки рН элюирующего буфера. Но катионы Na+ в буфере конкурируют за центры связывания с сульфогруппами и, хотя аминокислоты имеют более сильное сродство к смоле, они постепенно замещаются ионами натрия вследствие более высокой концентрации последних в среде. Природа боковой цепи также влияет на порядок элюирования, например тирозин (р/Ся = 9,1), содержащий ароматический радикал, элюируется после лейцина (р/Са = 9,7). В двухколоночном методе первая колонка (0,9X120 см) с амберлитом IR-120 служит для разделения кислых и нейтральных аминокислот с помощью двух элюентов: 1) 0,2 М Na++0,1 М цитратный буфер

18-703

274

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

(рН 3,25); 2) 0,2 М Na+ + 0,1 М цитратпый буфер (рИ 2,25). Вторая колонка (0,9x15 см) используется для анализа основных аминокислот; состав элюента: 0,35 М Na +0,12 М цитрат (рН 5,28). В работе [357] эти результаты критически обсуждаются.

Осуществить двухколоночную систему сложно чисто технически; кроме того, она не удовлетворяет и современным требованиям, поскольку в два раза увеличивается расход материала и соответственно возрастает вероятность ошибок.

Некоторые затруднения при количественной оценке результатов возникают при больших различиях в концентрациях компонентов смесей, когда часть пиков аминокислот находится в пределах шкалы измерений, а другая выходит за нее и не может быть корректно рассчитана. В таком случае повторяют анализ с меньшим количеством образца, а окончательные результаты выводятся из суммы двух определений. Проблему такого рода можно решить, записывая кривую элюирования одновременно при высокой и низкой чувствительности детектора или применяя линейно-логарифмическое преобразование электрического сигнала с выводом на диаграммную ленту самописца или интегратора, что позволяет определить площадь всех пиков.

Разработано много различных буферных смесей для разделения всех аминокислот в однократном процессе па одной колонке. В программы включались по три или даже четыре дискретных изменения буферных систем. Их не трудно установить и проконтролировать, но при смене буфера всегда наблюдается повышение базовой линии, вызванное хроматографическим смещением примесных пиков и небольшими изменениями коэффициентов преломления растворов [10].

Непрерывные буферные градиенты [297] менее популярны из-за трудности точного воспроизводства, однако с введением современной техники ВЭЖХ проблемы, связанные с созданием непрерывных буферных градиентов и точной подачей на колонку малых объемов растворов, в значительной степени преодолены. В 1972 г. описана система [18] с тремя буферными растворами, имеющими рН 3,25, 3,50 и 3,65 с повышающейся концентрацией ионов натрия (0,02, 0,70 и 1,60 моль/л). В этих условиях могут возникнуть осложнения только из-за расширения или сжатия упаковки колонки при изменении молярности элюента. Одновременно появилось сообщение [141] о системе из четырех буферов с постоянным содержанием Na+ (0,20 моль/л) рН — 3,25, 4,15, 5,25 и 10.10.

Возможность работы на самой высокой из возможных чувствительности определяется необходимостью отсутствия «фоновых шумов» на ленте самописца благодаря применению растворителей и реагентов высокой степени чистоты (разд. 8.3).

8.16. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

275

Тест на чистоту буферов. Для приготовления натрийцитратного буфера растворяют 20 мг Ка^СеНзОу^НяС) в 1 мл воды (концентрация Na+ —0,2 М) и добавляют 40 мкл «чистой» 1 М НС1 до рН 2,0. Вводят 100 мкл этого раствора в ионообменную колонку и сравнивают хроматограмму с полученными данными для воды и соляной кислоты П42].

Для нахождения оптимальных условий разделения можно менять рН, молярность, скорость потока буфера и температуру колонки. Буферы должны быть приготовлены на воде и из реагентов высокой степени чистоты. Значения рН устанавливают с точностью 0,001 ед. и растворы буферов хранят под азотом. Обычно вводят в первый буфер (рН 3,25) —2% (по массе) изопро-пилового или этилового спирта для улучшения разделения Thr и Ser. Коммерческие приборы снабжены полной технической документацией для их эксплуатации, но каждый работающий оператор, конечно, должен сделать свою корректировку программы анализа методом проб и ошибок.

На рис. 8.4 и 8.5 приведены кривые элюирования аминокислот, полученные с помощью анализатора фирмы Beckman.

Замечание к рис. 8.4: повышение базовой линии происходит при введении нового буфера на колонку после 42 и 56 мин. На рис. 8.5 приведены результаты разделения (при высокой чувствительности) гидролизата глико-протсина, содержащего глюкозамин и галактозамин (указаны). С обзорами по аминокислотному анализу можно познакомиться в статьях [19, 20, 28, 138, 139, 142, 300J.

Для лучшего разделения многокомпонентных смесей нингид-рипположительных соединений плазмы и других биологических жидкостей было предложено использовать при ионообменной хроматографии литийцитратные буферы [264]. Хроматография в одноколоночном варианте применена для разделения 65 соединений за 20 ч [296]. На двухколоночной системе удалось разделить 41 соединение за 7,5 ч [18] и 55 соединений за 9,5 ч [270].

8.16.2. Внутренние стандарты

К раствору белка до гидролиза добавляется точно известное количество аминокислоты — внутреннего стандарта, выход которого принимается за основу для расчета выходов аминокислот белка. При использовании двухколоночного метода требуются разные стандарты. Выбор стандартного соединения определяется индивидуальными особенностями каждой колонки и отчасти пристрастиями и привычками исследователя. В любом случае надо попытаться найти оптимальный вариант. Для длинной колонки можно попробовать норлейцин, норвалин или нитроти-розин, для короткой колонки (для основных аминокислот) — диаминопимелиновую кислоту или гомоаргинин [314].

8.16.3. Определение аминокислот

8.16.3J. Постколоночная модификация. До начала 70-х годов элюирующиеся с ионообменной колонки аминокислоты детектировались реакцией с нингидрином, смешивание с реагентом

18*

276

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Время, мин

РИС. 8.4. Разделение аминокислот ионообменной хроматографией в одноколо-ночной системе. Колонка (6X460 мм), заполненная смолой типа W-3 до высоты 220 мм. Натрийцитратные буферы: рН 3,25 (0,2 М Na+, с 1%-ным пропаио-лом-2; рН 3,95 (0,4 М Na+); рН 6,4 (1,0 М Na+). Температура 50—60 °С. Скорость потока 44 мл/ч (буфер), 22 мл/ч (нингидрин). Кювета 12 мм. Вся шкала 2,0 А. Смесь аминокислот для построения градуировочного графика (50 нмоль каждого компонента в 100 мкл). С разрешения фирмы Beckman.

проводилось в послеколоночном реакторе с последующим прохождением раствора через нагретую спираль. Интенсивность образующейся окраски измерялась сначала в одном колориметре при 570 нм, а затем в другом, где при 440 нм определялась концентрация пролина и гидроксипролина.

В 1972 г. в качестве селективного флуорогенного реагента на первичные амины был предложен флуорескамин [375], а не-

го

1_|_I_I_I-1-1

О 30 60 90 120 150 180

Время, мин

РИС. 8.5. Одноколоночное разделение аминокислот (гидролизат гликопротеина). Анализатор фирмы Beckman, модель 119CL. Колонка (6X460 мм), заполненная смолой типа W-3H до высоты 370 мм. Na-цитратные буферы фирмы Beckmarr рН 3 33 (0,20 М Na+); рН 4,25 (0,20 М Na+); рН 6,04 (1,0 М Na+). Температура 30 и 60 °С. Скорость потоков 30 мл/ч (буфер), 15 мл/ч (нингидрин). Кювета 12 мм. Вся шкала 0,5 Л. Объем образца 100 мкл. Концентрация (нмоль) каждого компонента указана в скобках над пиком. С разрешения фирмы Beckman.

278

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕ'ЮДЫ

сколько позднее он стал использоваться для модификации аминокислот после их выхода с колонки аминокислотного анализатора. Получаемая при этом чувствительность определения в 10—100 раз превышала возможности нингидринового метода [21J. Для измерений применялся флуориметр с длиной волны возбуждения 340 им и эмиссией при 450 нм. Широкому распространению флуорескамина помешали его нестабильность в вод-пых средах и высокая стоимость. Этих недостатков лишен введенный в практику почти одновременно с флуорескамином [320] о-фталевый альдегид (ОФА), вытеснивший в значительной степени флуорескамин и применявшийся в аминокислотных анализаторах многими исследователями. Образование флуоресцирующег

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить розы остин в москве
Компания Ренессанс: лестницу заказать - надежно и доступно!
кресло престиж с 11
Выгодное предложение от интернет-магазина KNSneva.ru на 80KX01HBRK - офис в Санкт-Петербурге, ул. Рузовская, д.11

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)