химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

составляет 95—98% Г179].

Анионообменная колонка. С апионообменной колонки Gla элюируется после всех аминокислот. Так, с колонки (125X9,0 мм, фирма Bio-Rad) с носителем Aminex А-27 или А-28, уравновешенной 0,3 М натрийацетатным буфером (рН 4,6), при элюировании тем же буфером (скорость потока 70 мл/ч, 30 °С) Gla элюировалась на 55-й минуте [361]. Аналогичные результаты были получены в работе [182].

8.12.2.3. ВЭЖХ [206].

Предколоночная модификация. Смешивают 50 мкл гидролизата белка или мочи с 50 мкл ОФА-рсагента (разд. 8.16.3.2) и энергично перемешивают. Через 2 мин добавляют 100 мкл 0,1 М KH2POd в 66%-ном ацетонитриле. 2—20 мкл приготовленного раствора вносят на колонку.

ВЭЖХ. Используют короткую колонку (50X4,6 мм), упакованную Nucleosil 5SB (размер частиц 5 мкм; фирма Macherey-Nagel). Это сильный анионообмеиник на основе силикагеля с N (СН3)3-функциональными группами. Элюируют в изократическом режиме при 47 °С (скорость потока 2 мл/мин), в качестве подвижной фазы служит 0,2 М натрийцитратный буфер (рН 5,28)—ацетонитрил (1:1). Повторные анализы могут быть проведены в тех же условиях без регенерации колонки. Детектирование осуще-ставляют при длине волны возбуждающего света 240 нм и эмиссии при 418 им с обрезающим фильтром. Большинство аминокислот элюируются вместе в течение двух минут, затем сходят с колонки Glu, Asp, Суа, S-карбок-симетилцистеин и, наконец, Gla (на 7-й минуте). Соотношение площадь пика: количество Gla линейно меняется в диапазоне 0,3—100 пмоль.

Замечание. Недавно производное Gla с ОФА было определено методом ВЭЖХ с использованием (J-карбоксиаспарагиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта [143].

266

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

8.13. Ацетильная и формильная группы

После первого сообщения о выделении N-ацетилированного пептида из N-концевого участка белка вируса табачной мозаики [273] обнаружено значительное число белков с блокированными а-аминогруппами. N-Ацетилировапные остатки аланина, аспарагиновой кислоты, глицина, серина, треонина идентифицированы у белков, выделенных из различных источников [47, 81]; см. также обзоры [2 и 406].

С N-формилметионина начинается синтез белковой цепи па рибосоме, формилвалин и формилглицин расположены на N-koh-це у грамицидина А [325] и меллитина [203]. Описано спонтанное N-формилирование формальдегидом остатков l-лизина [371].

Для установления природы ацилирующего остатка в белках применялись различные методы. Так, ацетильная группа определялась с помощью ферментативных методов [135, 201, 204, 319, 346, 354], колориметрически в виде комплекса с гидрокса-матом железа [227], перегонкой с паром с последующим титрованием [7, 183], идентифицировалась в форме ацетогидразида и 1 -ацетил-2-ДНФ-гидразида [301 ] или 1 -ацетил-2-даисилгидра-зида [329]. Применение ферментативных методов предполагает наличие у исследователя высокоочищениых препаратов соответствующих ферментов и требует, как правило, значительных количеств субстрата (100 нмоль ацетата в образце), хотя описана методика определения ацетата на уровне 3—12 нмоль/мл с флуоресцентной детекцией [135].

Формильная группа определялась колориметрическим методом (по Баркеру и Замерсу) после реакции с 2-тиобарбитуро-вой кислотой, приводящей к образованию хромофорной группы с хшах = 450 нм (фосфаты и уксусная кислота не мешают определению) . Зависимость поглощения от концентрации линейна в диапазоне 1 —10 ммоль, но чувствительность определения низкая [113].

Если N-концевой участок белка удается выделить в виде короткого пептида, то содержание в нем ацетилированной аминокислоты может быть определено после гидролиза хроматогра-фическим или электрофоретическим анализом [414]. Для установления природы блокирующего остатка и одновременно аминокислотной последовательности пептида наиболее надежен прямой масс-спектрометрический метод (на анализ требуется — 50 пмоль пептида) (гл. 19), [6].

Разработано несколько методик определения ацетильных групп в белках с помощью ГЖХ [45, 154, 164, 332, 389, 390] и пиролиза [402]. Однако при газожидкостном анализе могут возникать «хвосты» уксусной кислоты на колонке, «фальшивые»

8.13. АЦЕТИЛЬНАЯ И ФОРМИЛЬНАЯ ГРУППЫ

267

пики, а также наблюдаться низкий ответный сигнал детектора.

Предложено отщеплять ацетильную и формильную группы щелочным гидролизом белка [54], так как при кислотном гидролизе образуются свободные уксусная и муравьиная кислоты и их потери в дальнейшем неизбежны. После щелочного гидролиза соли этих кислот превращаются в фенациловые эфирыпри катализе краун-эфирами (дициклогексил-18-краун-6). Для обнаружения фенациловых эфиров пламенно-ионизационным детектором содержание ацильпых групп в образце должно быть достаточно высоким ( — 20 нмоль). До настоящего времени остается проблемой более полное использование чувствительности метода ГЖХ, поскольку в обычных условиях возможна инжекция в колонку лишь небольшой части полученного производного образца. В описываемом случае в колонку вводилось 1—2 нмоль фепацилового эфира. Более эффективны в этом отношении пен-тафторобепзиловые (ПФБ) эфиры, чувствительность определения которых выше благодаря возможности использования детектора электронного захвата.

8.13.1. Определение ацетильных и формильных групп

S.13.LL Метод газожидкостной хроматографии [59]. Приборы.

Газожидкостный хроматограф с детектором электронного захвата (или пламенно-ионизационным меньшей чувствительности).

Стеклянная капиллярная колонка (30 мХ0,27 мм, внутренний диаметр), покрытая смесью 5% хромосорб R4-5% РР Seb (нанесенной по соответствующей методике) [55]. Прямой ввод образца (объем до 2 мкл) в капиллярную колонку без обогрева ввода [56].

Реагенты

а-Бромо-2,3,4Д6-пентафторотолуол (ПФБ-Br) (фирма Aldrich), 15-краун-эфир (фирма Fluka), Ацетонитрил (перегнанный над Р2О5).

Методика. >5 нмоль N-ацетилированного соединения гидролизуют в 20 мкл 0,1 М NaOH в полипропиленовой центрифужной пробирке объемом 0,5 мл в автоклаве при давлении в 1 атм (123°С) в течение 3 ч. По окон-кании гидролиза вносят определенное количество (—5 нмоль) внутренних стандартов (я-масляная и изовалериановая кислоты) и приливают к смеси 20 мкл 1 М НВг и 2 мкл раствора 1 М NaHC03. Отбирают аликвоты по 5 мкл и высушивают их в силанизированных стеклянных пробирках (50X30 мм) в потоке азота. К сухому остатку добавляют 10 мкл ацетонитрила, содержащего ПФБ-Вг (50 нмоль) и 15-краун-5-эфир (50 нмоль). Герметически закрывают пробирку и инкубируют при 80 °С 2 ч, регулярно встряхивая. Отбирают 1 мкл реакционной смеси, разбавляют 2 мл толуола. 1 мкл толуольного раствора наносят на колонку в изократическом режиме при 110°С без обогрева ввода. Времена удерживания: ПФБ-Вг 6 мин, ПФБ-формиат 9 мин, ПФБ-ацетат 11 мин, ПФБ-пропионат 15 мин и нитробензол 18 мин (последний используется как внутренний стандарт).

Поскольку следовые количества уксусной и муравьиной кислот образуются в условиях реакции из реагентов, необходимо провести «глухой» опыт (в отсутствие исследуемого материала). Определяют также содержание ацетата в виде ПФБ-эфира в негидролизованном образце белка. Найденные

268

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

величины и степень чистоты препарата белка ограничивают чувствительность метода (чувствительность обнаружения этих соединений с помощью детектора электронного захвата ~3 фмоль).

8.14. Обнаружение соединений при хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента

После высушивания хроматограмму просматривают в УФ-свете для обнаружения флуоресцирующих пятен. Обычно также видна линия фронта растворителей, по ее форме можно проконтролировать нарушение потока в хроматографической системе.

Ниже приводимые методики используются для проявления хроматограммы погружением в раствор реагента или опрыскиванием в соответствующих условиях.

8.14.1. Флуоресцентные методы обнаружения

1. Погружают лист бумаги в раствор флуорескамина в ацетоне (25 мг в 1 л, содержащем 0,5% триэтиламина). Исследуют в УФ-свете, чувствительность обнаружения 1 нмоль пептида. В препаративном опыте применяют менее концентрированный раствор флуорескамина (4 мг/л). После промывки ацетоном могут быть применены другие типы окрашивания.

2. Необходимы: раствор флуорескамина (10 мг/100 мл ацетона) и раствор триэтиламина (1%-ный в ацетоне). Хроматограмму высушивают, для удаления растворителя промывают ацетоном и вновь сушат. Опрыскивают раствором триэтиламина и после сушки в вытяжном шкафу (15 мин) раствором флуорескамина. Высушивают, опрыскивают ацетоном, снова сушат. Отмечают флуоресцирующие пятна под УФ-лампой (336 нм). Для обнаружения слабо проявившихся пятен пептидов процедуру обработки повторяют еще раз. При нагревании хроматограммы в термостате при 110 °С в течение 3 ч могут быть обнаружены пептиды с N-концевым остатком пролина [131].

3. Необходимы: раствор о-фталевого альдегида (30 мг/100 мл ацетона) и раствор триэтиламина (1%-ный в ацетоне, содержит 0,05% 2-меркаптоэтанола). Процедура обработки хроматограммы этим реагентом аналогична описанной в пункте 2. По чувствительности ОФА не уступает флуорескамину, но дешевле его.

8.14.2. Обнаружение с помощью нингидрина

Окрашивание нингидрином может быть проведено после обработки флуорес-камином. Если в процессе хроматографии использовались кислые растворители, то следует слегка подщелочить реагент слабым основанием, если растворители были щелочными, то рекомендуется подкислить его слабой кислотой.

1. Нингидрин (0,2%-ный раствор в 95%-ном ацетоне) с добавлением нескольких капель коллидина (2,4,6-триметилпиридин) или ледяной уксусной кислоты. После погружения в раствор или опрыскивания сушат хроматограмму при 60 °С, 20 мин или при 100 °С 5—10 мин под наблюдением. Перегрев вызывает образование темного фона, он не возникает, если оставить хроматограмму на 24 ч в темноте при комнатной температуре. Большинство аминокислот дает фиолетовое окрашивание, но имеются исключения (Asp — сине-красное, Pro и Hyp — желтое окрашивание). Предел чувствительности ~1 мкг.

8.14. ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ И В ТОПКОМ СЛОЕ

269

2. Необходимы: нингидрин (300 мг), 3 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл w-бутанола. Чувствительность обнаружения 0,001 мкг (для алани-на) —0,1 мкг (для пролина и аспарагиновой кислоты) [107].

3. Необходимы забуференные растворы нингидрина. Нингидрин (300мг), ледяная уксусная кислота (20 мл) и коллидин (5 мл) разбавляют до объема 100 мл этанолом [190]. Нингидрин (0,1 масс./об.) в смеси ацетон — уксусная кислота — коллидин (100 : 30 : 4) [42].

4. Нингидрин — ацетат кадмия |148|. В отличие от нингидрина этот реагент дает прочное окрашивание (дли всех аминокислот — красное, для пролина — желтое), lie выцветающее со временем.

Растворяют 0,5 г ацетата кадмия в смеси 50 мл воды и 10 мл концентрированной уксусной кислоты. Доводят до объема 500 мл ацетоном. К порции этого раствора прибавляют твердый нингидрин до конечной концентрации 0,2%. После опрыскивания хроматограмму нагревают 15 мин при 60 °С. Отмечают пятна аминокислот сразу же и через 24 ч хранения при комнатной температуре. Не возникает окрашенного фона, если хроматограмму после обработки реагентом без нагревания оставляют на ночь в темноте при комнатной температуре. У некоторых соединений (таурин, треонин) окраска проявляется очень медленно. Чувствительность обнаружения — 0,5 нмоль.

S.14.3. Смешанные методы обнаружения

Система хлор— крахмал — иод [293]. Этот тест на пептидную связь (можно применять после нингидрина) основан на замещении водорода в NH-rpynnax пептида на хлор.

После хроматографии в пиридиновых буферах обязательна отмывка бумаги ацетоном. Затем помещают лист бумаги в камеру, насыщенную хлором, на несколько минут, в течение этого времени нингидриновая окраска исчезает. После тщательного проветривания хроматограммы от следов хлора (вытяжной шкаф!) погружают ее в смесь (1:1) 2%-ного (масс/об.) водного раствора крахмала и 2%-ного (масс, об.) KI. Пептиды проявляются в виде темно-синих пятен на розово-голубом фоне (чем длиннее пептид, тем больше интенсивность окраски).

Аргинин [409].

Реагенты.

A. 0,02%-ный фенантренхинон в безводном этаноле, Б. 10%-ный NaOII в 60%-ном этаноле.

Методика. Смешивают равные объемы реагентов А и Б непосредственно перед использованием. Погружают в раствор или опрыскивают им хроматограмму. Высушивают на воздухе 20 мин. Флуоресцентные пятна видны под УФсветом. Чувствительность определения 10~4 мкмоль. Далее могут быть применены последовательно нингидрин и диазореагент Паули.

Аргинин [177].

Реагенты для модифицированной реакции Сакагучи.

Л. 0,0125%-ный а-нафтол в абсолютном этаноле. Хранят в течение одной недели на холоду в темной склянке.

Б. 1,5 М NaOCl. Хранят 3—4 мес при 0—4 °С.

B. Раствор иода. 22,4 г иода и 30 г KI растворяют в 400 мл дистиллированной воды. Хранят неограниченное время при комнатной температуре.

Г. 10%-ный NaOH.

Методика. Хроматограмму погружают в реагент А и высушивают. Опрыскивают трижды раствором 1,5 мл Л-}-23,5 мл Б и затем один раз смесью 2,4 млВ + 20 мл Г.

Растворы для окрашивания должны быть использованы в течение 10 мин после смешивания компонентов. Аргинин, аргининсодержащие пептиды и многие соединения гаунидинового ряда образуют красное окрашивание, ста-

270

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

сильное в темноте в течение нескольких дней (чувствительность <1 мкг). После такой обработки может быть также применен нингидриновый реагент при условии предварительного подкисления уксусной кислотой для нейтрализации избытка щелочи.

Гистидин и тирозин [44|. Применение диазореаеента Паули.

Реагенты

A. 0,4 М сульфанилат натрия. Б. 0,4 М нитрат натрия.

B. 0,25 М HCI.

Г. 1 М карбонат натрия.

Методика. Смешивают реагенты А, />, В и Г в пропорции 1:1:8: 10. Реагент специфичен для гистидина, тирозина и некоторых их производных. Гистидин и гистидинсодержащие пептиды дают ярко-красную окраску, тирозин — коричневую.

Тирозин |293|. Хроматограмму погружают в 0,1п/о-ный (масс./об.) раствор 1-нитрозо-2-нафтола в ацетоне. Высушивают. Затем погружают в смесь ацетон — концентрированная азотная кислота (9:1). Высушивают и нагревают осторожно (не перегревая) при 105 °С 2—3 мин. Тирозин дает темно-красное окрашивание. Тест может быть использован после нингидрина.

Триптофан и имидазолы [344]. Применение реагента Эрлиха. л-Диметил-аминобензальдегид в концентрированной IICI (10%- ный раствор, масс./об.), разбавляют ацетоном (1:4) непосредственно перед использованием.

Методика. После опрыскивания оставляют хроматограмму при комнатной температуре. При этом у триптофана и трпптофаисодержащих пептидов постепенно развивается фиолетовое окрашивание. Тест может быть использован после нингидрина. Серу содержащие аминокислоты |333|.

1. Система азид натрия — иод. Опрыскивают сухую хроматограмму раствором 0,05 М иода в 50%-ном этаноле, содержащем 1,5% азида натрия. Пятна лучше видны в УФ-свете. Чувствительность определения 0,5 мкг метионина.

2. Применение иодида платины. Смешивают в следующем порядке: 4 мл 0,002 М хлорида платины, 0,25 мл I М иодида калия, 0,4 мл 2 М НС1 и 76 мл ацетона. Погружают в этот раствор или

страница 40
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.02.2017)