химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

лях, так как электрофорез может не дать точных результатов из-за различия в связывании ДСН с полипептидной цепью и полисахаридными фрагментами. Следует также напомнить, что мономер может включать несколько полипептидных цепей, связанных дисульфидными связями, поэтому определение молекулярной массы следует проводить как до, так и после восстановления S—S-мостиков.

Молекулярную массу можно найти по данным количественного анализа N-концевых аминокислот (разд. 1.3,1.4). По расходу материала (количество образца) этот метод эквивалентен гель-фильтрации; при инструментальном анализе расход материала существенно меньше (гл. 12, 15, 17).

Статистическая обработка данных для 500 белков показала, что наиболее вероятная область молекулярных масс мономеров приходится па 10 000—60 000 [63]. Действительно, молекулярные массы субъединиц более чем 2/з изученных к настоящему времени белков располагаются в указанном диапазоне. Примерно 50% этих белков составляют димеры, 30% — тетрамеры, 8% — гексамеры.

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

27

L3.L1. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН. Большинство белков в присутствии ДСН диссоциируют на субъединицы. Субъедипицы, состоящие из двух и более полипептидных цепей, связанных дисульфидными связями, могут подвергаться дальнейшей диссоциации в присутствии восстанавливающих агентов, например 2-меркаптоэтанола (разд. 1.5.1). Полипептидные цепи в общем связывают ДСН равномерно, примерно 1,4 г/г белка [143]; при этом комплекс приобретает сильный отрицательный заряд. Собственный суммарный заряд нативного белка маскируется, а отношение заряда к массе становится практически постоянным. Кроме того, ДСН вызывает конформационные из-менения полипептидной цепи, хотя ее абсолютная конфигурация может быть и неизвестной (это может быть палочка, ожерелье, вытянутый эллипсоид, статистический клубок). Показано, что при электрофорезе в ПААГ комплексы мигрируют в соответствии с молекулярной массой [182]. Длину полипептидной цепи определяют путем сравнения электрофоретической подвижности комплекса с подвижностью белков-маркеров с известными молекулярными массами. На практике метод используется в трех вариантах:

1. Непрерывная буферная система (обычно фосфатный буфер [182]) в однородном геле.

2. Ступенчатая буферная система в однородном геле [95].

3. Непрерывная или ступенчатая буферная система в градиентном геле.

Каждому варианту свойственны собственные преимущества и недостатки. Общие принципы и методика эксперимента электрофореза в ПААГ подробно рассмотрены в ряде исчерпывающих публикаций [3, 35, 73, 183]. В ступенчатой системе образцы предварительно концентрируются в «формирующем» геле, после чего входят в рабочий гель в виде узких зон. В непрерывной системе предварительное концентрирование исключено и при нанесении образца в большом объеме по завершении электрофореза образуются широкие зоны. Если образец наносить в небольшом объеме, результаты в обеих системах должны быть идентичны. Наблюдающиеся иногда различия в результатах, возможно, обусловлены частичной диссоциацией комплекса при электрофорезе в ступенчатой системе.

По ряду причин многие белки связывают ДСН в аномально низком соотношении [164]. Причиной может быть необычный состав, присутствие углеводов; к этой группе относятся белки с высоким положительным или отрицательным зарядом. Элект-рофоретическая подвижность комплексов может меняться в зависимости от замен отдельных аминокислот, конформационных изменений в белках [40, 46, 126]. Подобное аномальное поведение можно обнаружить и свести к минимуму путем проведе-

28

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

ния электрофореза в гелях различной пористости и построения по результатам эксперимента графика Фергюсона (см. далее). Иными словами, для достоверной оценки кажущейся молекулярной массы в ступенчатой или непрерывной системе необходимо проводить измерение по крайней мере в четырех различных гелях.

При электрофорезе в градиентном геле полипептиды мигрируют до достижения зоны с определенной пористостью, препятствующей их дальнейшему продвижению. Если все комплексы полипептидов с ДСН имеют одинаковую форму, концентрацию ПААГ в этой зоне можно принять характеристической для данной молекулярной массы [97, 99, 101, 137]. Комплекс может частично разрушиться с потерей ДСН, в особенности в области, близкой к равновесному состоянию, однако это не влияет на конечный результат. Объем образца не влияет на ширину белковых зон, тем не менее наносить образец в большом объеме не рекомендуется. При электрофорезе в градиентном ПААГ формирование градиента с высокой воспроизводимостью может быть затруднительным. Однако для этих целей выпускаются преформированные гели высокого качества.

Аппаратура и реактивы. Полиакриламидные гели готовят в виде стержней в стеклянных трубках или в виде пластин; последний вариант более удобен при определении молекулярных масс. При электрофорезе в трубках различная электрофорети-ческая подвижность может быть обусловлена изменениями степени полимеризации геля, а также зависеть от длины слоя геля, условий проведения электрофореза. Техника извлечения геля из трубок разработана детально [35]; показано, в частности, что извлечение гелей с концентрацией мономеров более 10% бывает затруднительным. Рекомендации по использованию аппаратуры и меры безопасности при работе с реактивами обсуждаются в разд. 1.2.1.1.

30%-ный запасной раствор, содержащий 29,2% (масс./об.) акриламида и 0,8% (масс/об.) Ы^'-метиленбисакриламида, фильтруют и хранят при 4°С (в этих условиях раствор можно хранить в течение нескольких месяцев). Перед употреблением раствор нагревают до 20°С и деаэрируют в вакууме водоструйного насоса.

М^М'^'-тетраметилендиамин (ТЕМЕД) перегоняют в вакууме и хранят в темном сосуде при 4°С. Реактивы высокого качества поставляются фирмой Biorad и другими фирмами. Рекомендуется использовать ДСН («ос. ч.») фирмы BDH, поскольку на разрешение зон и общий конечный результат могут оказывать влияние примеси в ДСН, например натрийтетрадецил-сульфат [21, 50, 118]. Остальные реактивы должны иметь квалификацию «ч. д. а.». Для дополнительной очистки ДСН можно

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

29»

перекристаллизовать из этанола (600 г растворяют в 3 л 80%-иого этанола и обрабатывают активированным углем).

Полиакриламидные гели. Свойства геля зависят от общей концентрации мономеров (акрил амид Ч-Ы^'-бисакрил амид) и доли сшивающего агента (]М,1\Г-метиленбисакриламида) [34]. Гели готовят путем радикальной полимеризации мономеров, в водном растворе в присутствии катализатора — персульфат аммония + ТЕМЕ Д.

После внесения персульфата раствор перемешивают до растворения кристаллов и быстро переносят в систему для проведения электрофореза. Следует принять меры против образования в геле пызырьков воздуха. Для этого на иглу шприца надевают отрезок тонкого шланга (силиконового, полиэтиленового), по которому осторожно по стенке наслаивают рабочий раствор мономеров. Гребенку для формирования лунок осторожно погружают в раствор, удаляют с зубцов пузырьки воздуха и выдерживают раствор до завершения полимеризации. Скорость полимеризации может варьировать в зависимости ог концентрации персульфата аммония и ТЕМЕД. В среднем полимеризация должна завершиться спустя 10—25 мин после добавления персульфата. Ускоренная или замедленная полимеризация плохо воспроизводится и может привести к образованию геля с неравномерными порами.

Соотношение компонентов для приготовления 10 мл акриламидного геля

30%-ный раствор ак-риламида Запасной буфер (фосфат-ДСН) Вода ТЕМЕД

Персульфат аммония

Приготовление образца. Лиофильно высушенный образец белка растворяют в стартовом буфере (см. далее), образец в растворе диализуют против стартового буфера в течение 3—12 ч. Равновесная концентрация ДСН в образце достигается во времени, поэтому перед диализом к раствору белка добавляют сухой ДСН [до концентрации 1% (масс/об.)]. С целью полноты денатурации и связывания с ДСН образцы инкубируют при 95—100°С в течение 2 мин. Содержание белка в образце должно быть 0,5—1 мкг/мкл; в зависимости от толщины геля в лупки вносят 2—10 мкл такого раствора. Нагрузка существенно меньше, если обнаружение предполагают вести с помощью солей серебра. При проведении электрофореза в ступенчатой системе можно в случае необходимости вносить и большие объемы, при работе в непрерывной системе разбавленный образец

различной концентрации

5% 7,5% 10% 12,5%

1,67 мл 2,50 мл 3,33 мл 4,17 мл

2,0 мл 2,0 мл 2,0 мл 2,0 мл

6,33 мл 5,50 мл 4,67 мл 3,83 мл

5 мкл 5 мкл 5 мкл 5 мкл

10 10 10 10

30

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

концентрируют. С этой целью белок осаждают сульфатом аммония или трихлороуксусной кислотой, осадок вновь растворяют в стартовом буфере до достижения оптимальной концентрации (0,5—1 мкг/мкл).

Если белок плохо растворим (имеются в виду липопротеины и мембранные белки), в образец добавляют 8 М мочевину или неионный детергент, например 1%-ный тритон Х-100, или увеличивают концентрацию ДСН до 10%. В последнем случае образец и буферные растворы не должны содержать ионов калия или солей гуанидина, так как эти анионы образуют с ДСН плохо растворимые соли. Полиакриламидные гели градуируют <: помощью белков-маркеров, наборы которых выпускаются рядом фирм (Pharmacia, Biorad, BDH, Sigma, Calbiochem).

Непрерывная буферная система с постоянной концентрацией полиакриламида [182]. Основные компоненты этой системы: 0,05 М фосфатный буфер и 0,1%-ный ДСН.

Запасной буфер имеет следующий состав: 0,25 М фосфат <рН 7)+0,5% ДСН+ 0,02% азид натрия (13 г NaH2P04-2H20 + + 26 г Na2HPO4 + 0,2 г NaN3 + 5,0 г ДСН). Для растворения фосфатов необходимо слабое нагревание; хранят раствор при температуре выше комнатной.

Электродный буфер готовят из запасного раствора путем разбавления дистиллированной водой в соотношении 1:4.

Образцы растворяют в буфере следующего состава: 20 мл запасного буфера+ 1 г ДСН+ 10 г глицерина+ 0,05 г бромофено-лового синего +дистиллированная вода (до объема 100 мл). При электрофорезе с целью определения молекулярной массы полипептидных цепей с восстановленными дисульфидными связями буфер должен содержать 1% (об./об.) 2-меркаптоэтапола.

После кратковременного нагревания до кипения образцы вносят в лунки геля с помощью микрошприца или микропипетки. Электрофорез ведут при 200 В до подхода зоны красителя к нижнему краю геля. Продолжительность эксперимента зависит от длины слоя геля и геометрии пластины. По завершении электрофореза проводят операции окрашивания, обесцвечивания и фотографирования (разд. 1.2.1.1).

Ступенчатая система с постоянной концентрацией полиакриламида [95]. Основные компоненты этой системы 0,375 М трис и 0,1%-ный ДСН.

Концентрация акриламида в рабочем геле 5%—25%, в формирующем геле (длиной 20 мм) 4,5%.

Рабочий буфер имеет следующий состав: 1,5 М трис + 0,4% (масс/об.) ДСН, рН 8,8 (подтитрован НС1 до указанного рН).

Буфер формирующего геля имеет следующий состав: 0,5 М трис + 0,4% (масс/об.) ДСН, рН 6,8 (подтитрован с помощью НС1).

КЗ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

31

Образец растворяют в буфере следующего состава: 0,0625 М трнс + 2,3% (масс/об.) ДСН+10% (масс/об.) глицерина+ 0,05% (масс./об.) бромофенолового синего.

При определении молекулярной массы полипептидных цепей с восстановленными дисульфидными связями буфер содержит 1% (об./об.) 2-меркаптоэтанола или 100 ммоль/л дитиотреита.

Электродный буфер имеет следующий состав: 0,025 М трис + + 0,192 М глицин + 0,1% (масс/об.) ДСН.

Соотношение компонентов для приготовления 10 мл акриламидного рабочего геля различной концентрации

5% 7,5% 12,5%

30%-нын растнор ак- 1,67 мл 2,50 мл 3,33 мл 4,17 мл

рнламнда

Буфер для рабочего 2,5 мл 2,5 мл 2,5 мл 2.5 мл

ГОЛ Я

Вода 5,83 мл 5,00 мл 4,17 мл 3,33 мл

ТЕМЕД 5 мкл 5 мкл 5 мкл 5 мкл

11орс\\'п>фат аммония 10 мг 10 мг 10 мг 10 мг

Раствор деаэрируют дважды — перед добавлением ДСН и (вторично) перед прибавлением персульфата и ТЕМЕД. После внесения в систему па поверхность раствора осторожно наслаивают воду или насыщенный водой изобутанол. По завершении полимеризации верхний слой отсасывают, промывают поверхность геля буфером формирующего геля и наслаивают раствор для приготовления формирующего геля. Для приготовления 10 мл этого раствора (концентрация 4,5%) смешивают 1,5 мл запасного буфера, 2,5 мл буфера формирующего геля, 6,0 мл воды, 10 мг персульфата аммония, 10 мкл ТЕМЕД.

После кратковременного нагревания до кипения образцы вносят в лунки с помощью микрошприца или микропипеткн. Электрофорез проводят при 100 В до прохождения красителем формирующего геля, затем при 200 В до подхода зоны красителя к нижнему краю геля. Продолжительность электрофореза зависит от длины геля и геометрии камеры, обычно электрофорез длится 3 ч.

Непрерывная или ступенчатая система в градиентном поли-акриламиде. В этой методике используются рассмотренные ранее основные буферные системы. Единственное отличие от предшествующих систем состоит в том, что в блоке формируется градиент концентрации акриламида. Градиент образуют с помощью смесителя из двух сообщающихся сосудов и перистальтического насоса [113] или смесителя иной конструкции.

Фирмы Gradipore и Pharmacia производят преформировап-пые пластины высокого качества (разд. 1.2.1.1). Преформиро-ванные гели не содержат ДСН, детергент вводят в гель на стадии предварительного электрофореза при 50 мА в течение 3 ч. Дли приготовления электродного буфера запасной раствор (со-

32

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

держащий фосфат и ДСН) разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:9. После внесения образцов проводят электрофорез при 50 мА в течение 3,5 ч. За это время белковые зоны достигают равновесного положения, ограниченного размерами пор.

1.3.1.2. Анализ полученных результатов. Как отмечалось в разд. 1.2.1, молекулярные массы полипептидных цепей определяют с помощью градуировочного графика. Однако при электрофорезе в геле с постоянной концентрацией (пористостью) не удается исключить ошибки, обусловленные различием свободной подвижности У0 исследуемого белка и белков-маркеров [148, 149]. Поэтому рекомендуется проводить электрофорез в нескольких гелях различной концентрации. При этом результаты определения молекулярной массы будут тем точнее, чем меньше систематическое отклонение при изменении общей концентрации акриламида. Полученные результаты можно проанализировать с помощью эмпирического уравнения Фергюсона [57]

lgRf = -KRT+lgY0

Коэффициент удерживания Kr для исследуемого белка и белков-маркеров определяется по наклону графика в координатах \gRf — общая концентрация акриламида Г, а молекулярную массу исследуемого белка находят по графику Kr— молекулярная масса белков-маркеров. Для надежного определения KR электрофорез следует проводить по крайней мере в четырех гелях различной концентрации (7, 8; 9 и 10%), но предпочтительнее в семи гелях. Результаты экспериментов обрабатывают методами статис

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
футбольные гетры и трусы купить в перми
правильное оформление баннера для улицы
помяло крышу багажником
стол обеденный орфей 8 купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.09.2017)