химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

акууме над Р2О5. Растворяют в разбавленном ацетатном или фосфатном буфере (рН 7—8).

Методика. Раствор белка подкисляют до рН 4,6 и добавляют реагент (10-кратный молярный избыток на каждую SH-груииу) в разбавленном нейтральном или слегка щелочном растворе при комнатной температуре. Строят график зависимости увеличения поглощения при 232 им от времени. Находят суммарное увеличение поглощения.

Замечание. Растворы я-хлоромеркурибепзоата при хранении в течение нескольких дней частично разлагаются. Контролируют растворы (если необходимо после центрифугирования) путем измерения поглощения при 232 им, рИ 7 (ем=1,69-104) или 234 им, рИ 4,6 (еЛг = 1,74 -104). В присутствии ЭДТА получают завышенные результаты.

8-9.1.6. Определение метионина и метионинсульфоксида. В процессе расщепления периодатом углеводной цепи в глнконротеинах [69, 95] и дисульфидных связей в белках, а также окисления остатков цистеина надмуравьиной кислотой [162] метиошш превращается в метиопинсульфоксид [411] и ме-тнопнисульфон. Образование метиоиннсульфооксида происходит в значительной степени даже при использовании низкой концстрации (5 ммоль/л) пе-риодата; при кислотном гидролизе из него вновь образуется метиошш, метилсульфонневая соль метионина, гомоцпстенп и гомоцистеииовая кислота [112]. Метношшсульфон стабилен в условиях кислотного гидролиза и может быть количественно определен па аминокислотном анализаторе [116, 251]. Для анализа метионинсульфоксида используют щелочной гидролиз или его количество находят непрямым путем — в виде метнопнисульфоиа [275].

8.10. Аргинин

8.10.1. Методы определения

8.10.1.1. Аргинин в интактном белке [366]. Реагенты

A. 0,1% а-нафтол в 50%-вом этаноле (готовится ежедневно). Б. 10%-ный КОН.

B. 5%-ная мочевина.

Г. Раствор гипобромита калия (0,64 мл Вг2 в 100 мл 5%-ного КОП; готовится ежедневно).

Д. Исходный раствор аргинина, 1,0 мкмоль/мл.

Методика. Аргинин может быть свободным или связанным в белке. К 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,1 —1,0 мкмоль аргинина, последовательно добавляют по 1 мл реагентов Л, Б и В. Тщательно перемешивают и быстро приливают при непрерывном встряхивании 2 мл раствора Г (важная стадия!). Одновременно в глухом опыте проделывают ту же последо-

8.10. АРГИНИН

261

вательность операций с 1 мл воды вместо раствора аргинина. Оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем измеряют поглощение при 520 нм. Определяют концентрацию по градуировочному графику в интервале 0,1 — 1,0 мкмоль/мл.

8.10.1.2. Определение с п-нитрофенилглиоксалем [410]. Реагенты

A. 0,1 М пирофосфат натрия + 0,15 М аскорбат натрия, рН 9,0. Готовится ежедневно с использованием воды, не содержащей азота.

Б. /г-Нитрофенилглиоксаль (10%-ный раствор, масс/об.) в метаноле. Готовится ежедневно.

B. Субтилизин (0,1%-ный раствор, масс/об.) в 0,01 М фосфате натрия, рН 7,9.

Г. Бычий трипсин (0,1%-ный раствор, масс./об.) в 1,0 мМ ЫС1 + 20 мМ СаС12.

/z-Нитрофенилглиоксаль готовят из /г-питроацетофеиона по методике, описанной в работе [355]. Кипятят в течение 1 ч раствор 39 г (0,30 моль) селеновой кислоты в 24 мл воды, 150 мл ледяной уксусной кислоты и 49,8 г (0,30 моль) л-питроацетофенона. Охлаждают, выпавший селен отфильтровывают. При перегонке сначала удаляется вода и уксусная кислота (при 15 мм рт. ст.), а затем продукт реакции при 118—128 °С (0,6 мм рт. ст.). При стоянии желтая вязкая жидкость превращается в твердую стеклообразную массу с температурой плавления 37—46 °С. Выход 0,15 моль.

Методика. К 0,20 мл раствора образца белка (1—2 мг), содержащего 0,1 — 1 мкмоль аргинина, в деионизовапной воде или 0,1 М пирофосфате натрия (рН 9,0) добавляют по 40 мкл реагентов В и Г. Инкубируют при 37 °С 3 ч. Охлаждают и разбавляют до 3,0 мл буфером А. Добавляют при размешивании 25 мкл реагента Б и инкубируют при 30 °С 30 мин. Охлаждают ниже 20 °С в ледяной бане и измеряют поглощение при 475 нм против «холостого» образца. Содержание аргинина находят по градуировочному графику, построенному с применением раствора аргинина известной концентрации (в диапазоне 0,03—0,33 ммоль/л ь-аргинина в 3 мл реагента А) + 25 мкл реагента Б; для аргинина 6475=0,715.

8.11. Фосфорилированные аминокислоты

Фосфоэфирные связи в О-фосфо-производных серина, треонина и тирозина разрушаются под действием сильных кислот, поэтому для предотвращения деградации этих производных нужно использовать короткое время гидролиза [322]. Лабильностью в кислых условиях объясняется и отсутствие надежного количественного метода определения фосфоаминокислот в белках. Обнаружение аминокислот, содержащих радиоактивную метку [32Р], осуществляют авторадиографией или измерением радиоактивности с помощью счетчика.

Фосфорилированные пептиды могут быть отделены от нефосфорилиро-ванных и фракционированы с помощью ВЭЖХ в изократических условиях при 22 °С на колонке сферисорб С]8 с фосфатным буфером рН 3,2—4,5 и w-гексансульфокислотой в качестве противоиона [114]. Около 0,1 нмоль пептида может быть идентифицировано по поглощению при 210 нм, использование флуоресцентной или радиоактивной метки [32Р] позволяет повысить чувствительность в 100 раз.

8.11.1. Гидролиз белка

Белок обрабатывают 6 М НС1 при 110°С в течение 1—4 ч. Гидролизат фильтруют через фильтр типа Millipore (0,22 мкм) и удаляют НС1 в вакууме.

262

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Остаток растворяют в 0,001 М ТФУ, добавляют в качестве стандартов немеченые аминокислоты [51].

Фосфогистоны (100 мкг) гидролизуют с помощью 6 М НС1 в вакууме при 100 °С в течение 4 ч или инкубированием со 100 мкг протеазы из S. griseus в 50 мМ трис — HCl-буфере (рН 7,5) при 20—24 °С в течение 20 ч [358].

Ферментативный гидролиз [32Р] фосфопротеинов. Растворяют белок в 100 мкл 0,1 М аммонийбикарбоната, содержащего 2 мМ ЭДТА (нейтрализованной) и 250 нмоль каждой немеченой фосфоаминокислоты Ser(P), Thr(P), Туг(Р). Добавляют трипсин (200 мкг/мл) и инкубируют 12 ч при 37 °С в присутствии ЭДТА, которая иигибирует любую фосфатазную активность, внесенную с протеазой. Затем добавляют аминопептидазу М (200 мЕ) и инкубируют еще 12 ч при 37°С (/. Downward, 1984, частное сообщение).

8.11.2. Методы анализа

8.11.2.1. Тонкослойная хроматография.

1. На пластинках со слоем целлюлозы MN-300. Элюэнт: бу-танол — изопропанол — муравьиная кислота — вода (3:1:1:1) ([358], детали не приведены).

2. На полиамидных пластинках (фирма Cheng-Chin). В одном направлении хроматографируют в 5%-ной пропионовой кислоте, содержащей 0,013—0,025% ДСН. Высушивают и опрыскивают 0,2%-ным раствором нингидрина, нагревают в термостате при 50 °С под наблюдением. Thr(P) и Ser(P) мигрируют вместе, /?f = 0,70; Туг(Р) /?г = 0,54.

8.11.2.2. Электрофорез [42, 169]. Буфер рН 1,9: ледяная уксусная кислота — муравьиная кислота (88%-ная)—вода (78:25: :897); буфер рН 3,5: ледяная уксусная кислота — пиридин — вода (50:5:945). Пиридин очищают 18-часовым кипячением над я-толуолсульфохлоридом и затем перегоняют.

Используют тонкослойные пластинки (фирма Brinkman, Polygram CEL MN-300, 200X200 мм, 0,1 мм). Растворяют образец в буфере рН 1,9 и проводят электрофорез при рН 1,9, 1,5 кВ, 75 мин по направлению к аноду. После высушивания проводят электрофорез во втором направлении в буфере рН 3,5, 1 кВ, 1 ч. Сушат пластинку, опрыскивают буферным раствором, содержащим 0,1% нингидрина (разд. 8.14.2). Туг(Р) дает серое окрашивание; Ser(P) и Thr(P)—голубое. В случае радиоактивных препаратов используют авторадиографию.

Стандартные растворы: смесь по 0,5 мкл растворов нейтрализованных фосфоамииокислот (20 мг/мл). На рис. 8.2 показано положение пятен фосфоамииокислот после двумерного электрофореза.

8.11.2.3. Аминокислотный анализатор [51]. Используют короткую колонку (по Муру и Стейну) (80X6,0 мм), упакованную смолой фирмы Durrum DC6A. Растворяют образец в 0,01 М ТФУ с немечеными стандартами фосфоамииокислот (1,5 нмоль каждой) лли без них и наносят на колонку. Элюирование

8.11. ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ

263

РИС. 8.2. Двумерное разделение электрофорезом фосфоаминокислот; в первом направлении при рН 1,9, во втором направлении при рН 3,5 [43].

в изократическом режиме при 50 °С 0,01 М ТФУ со скоростью потока 0,4 мл/мин. При флуориметрическом определении фракции обрабатывают ОФА-реагентом (разд. 8.16.3.2) (скорость потока 0,2 мл/мин) в специальном смесителе. При работе с [32Р] меченным образцом ОФА-реагент заменяют на воду и собирают фракции по 1 мл для измерения радиоактивности.

Приблизительные величины времен удерживания: Ser(P) 19 мин Thr(P) 28 мин, Туг(Р) 64 мин. Ци- рН 1,9

стеиновая кислота выходит в свободном объеме, другие аминокислоты не элюируются.

Регенерируют колонку, пропуская через псе следующие растворы:

1) 1,0 Л\ по Na~ (34,8 г NaCl + 39,2 г тринатриевой соли лимонной кислоты на 1 л воды с добавлением 1 мл фенола для подавления роста бактерий);

2) 0,2 М NaOH;

3) 1 М ТФУ;

4) 0,01 М ТФУ.

Результаты количественного анализа. Выходы для стандартных образцов фосфоаминокислот (по измерению флуоресценции) составили: Ser(P) 88%, Туг(Р) 71% относительно выхода Thr(P), принятого за 100%, и соответственно Thr(P) 89%, Ser(P) 71% и Туг(Р) 71% относительно выходов их пефосфорилированных аналогов.

8.11.2.4. Жидкостная хроматография под высоким давлением.

1. Анионообменная колонка (фирма Ultrasil Ах, 250X4,6 мм, Beckman), уравновешенная 15 мМ К-фосфатным буфером (рН 3,8). Наносят образец и элюируют тем же буфером в течение 25 мин, скорость потока 2,0 мл/мин. Нерадиоактивные соединения детектируют измерением поглощения при 206 нм. Приблизительные времена удерживания: Thr(P) 6 мин; Ser(P) 8,6 мин; Туг(Р) 9 мин и Pt 10,5 мин [358].

2. Анионообменная колонка (Synchrom Ах-300, 250X4,6 мм). Элюирование фосфатным буфером (как и в пункте 1), скорость потока 1 мл/мин. Фракции элюата обрабатывают ОФА [213] и измеряют поглощение при 338 нм пли радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Времена удерживания: Thr(P) 12 мин; Scr(P) 17 мин; Туг(Р) 23 мин (/. Downward, частное сообщение).

3. Колонка (250X4,6 мм) с аиионообменной смолой Partisil-10 SAX (фирма Whatwan). Наносят образец и элюируют 10 мМ К-фосфатным буфером (рН 3,0), содержащим 10,5% метанола, скорость потока 1 мл/мин, температура комнатная. Обнаружение с помощью обработки ОФА. Приблизительные времена удерживания: Thr(P) 26 мин; Туг(Р) 32 мин; Ser(P) 38 мин; Р; 60 мин [413].

4. Дансилирование и ВЭЖХ ДНС-фосфоаминокислот [77]. Гидролизуют белок 2 ч при \\0°С концентрированной соляной кислотой (фирма Pierce), Упаривают в потоке азота. Приливают 100 мкл 0,2 М ЫагС03 и снова упа-

Scr(P)0 Thr (Р)О

Туг(Р) О

264

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ривают. Суспендируют образец в 100 мкл воды и добавляют 100 мкл свежеприготовленного раствора даисилхлорида (2,5 мг ДНС-С1 на 1 мл ацетона). Инкубируют в темноте 1 ч при 37 °С. Высушивают досуха в потоке азота. Для анализа методом ВЭЖХ растворяют ДНС-производныс в 100 мкл 0,5%-ной ТФУ.

ВЭЖХ на колонке Protesil 300 (фирма Whatman). Промывают колонку раствором вода — ТФУ (1000:1) или смесью вода — ацетопитрил — ТФУ (970:30:1). Элюируют в режиме линейного градиента: 30 мл раствора вода — ацетопитрил — ТФУ (970 : 30 : 1) +30 мл раствора вода — ацетопитрил — ТФУ (900:100:1). Измеряют поглощение элюата при 280 нм. Собирают радиоактивные фракции для измерения на счетчике. Приблизительные времена удерживания: Ser(P) 12 мин, Thr(P) 16 мин и Туг(Р) 22 мин.

ВЭЖХ на микроколонке Bondapak С\$ (фирма Waters). Элюирование в изократическом режиме раствором вода — ацетопитрил — ТФУ (925:75:1). Приблизительные времена удерживания: Ser(P) 15 мин, Thr(P) 22 мин, Туг(Р) в элюате не обнаружен.

5, Ионопарная ВЭЖХ фосфоамииокислот па обращенной фазе [1, 268]. Колонка (150 мХ4,6 мм) с Partisil 5 ODS2. Элюируют при комнатной температуре смесью 0,5 мМ гидроксид тетрабутиламмопия — 0,5 мМ о-фталат, рН 6,3, скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 243 им, шкала на 0,1 сд. опт. пл., чувствительность 200 пмоль. Приблизительные времена удерживания: Asp и Glu 5,3 мин; Pf 6,9 мни; Thr(P) 11,6 мин; Scr(P) 12,8 мин; Туг(Р) 15,9 мин.

8.12. Y-Карбоксиглутаминовая кислота

Впервые 'у-карбоксиглутаминовая кислота Gla была обнаружена в протромбине, позже — в других белках и моче; для ее количественного определения были предложены различные методы: аминокислотный, анализ [134, 145, 146, 179, 182, 234, 361], ГЖХ [247], колориметрический анализ (в интервале 0,5-10~4-^5х Х10-4 моль/л) [290] и ВЭЖХ [205, 206].

Gla полностью декарбоксилируется в условиях кислотного (1 М НС1, 100 °С, 16 ч, вакуум) и щелочного гидролиза, используемого для белков [205]. Пептиды, содержащие остатки Gla, могут быть обнаружены с помощью так называемого «теплового диагонального» метода. Пептидная смесь подвергается электрофорезу на бумаге при рН 6,5. Бумагу высушивают нагреванием до 80 °С в течение 1 ч и затем проводят электрофорез при рН 6,5 во втором направлении. Декарбоксилированные пептиды сдвигаются при этом с диагонали [235] (а также Н. Morris, частное сообщение).

8.12.1. Гидролиз белка

1. Гидролизуют белок в 2,5 М КОН при 100 °С (16 ч, вакуум или N2). Центрифугируют. Охлаждают супернатант в ледяной бане и подкисляют до рН 4—5 добавлением по каплям сначала 60%-ной, а затем 6%-ной НС104. Оставляют во льду на 30 мин. Центрифугируют для удаления осадка КС104. Для анализа используют 2—10 мкл супернатанта [205].

2. Гидролизуют белок в 0,4—1,0 мл 2,0 М КОН при 110°С в течение 22 ч. Добавляют 0,2 мл свежеприготовленного насыщенного раствора КНСОз-

8.12. y-КАРБОКСИГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА

265

При перемешивании нейтрализуют 70%-ной НСЮ4 до рН 7 (по индикаторной бумаге). Центрифугируют и прозрачный супернатант анализируют. Gla стабильна при рН 7 (—20 °С) [145].

8.12.2. Методы анализа

8.12.2.1. Тонкослойная хроматография. На алюминиевых пластинках со слоем целлюлозы ОД мм (фирма Merck) в системе я-бутанол— муравьиная кислота— вода (75:15:10) Gla дает фиолетовое пятно при окрашивании нннгид-рипом с Rf 0,24. Описай колориметрический метод определения Gla с аце-тальдегидом и нитропруссидом [260].

8.12.2.2. Аминокислотный анализатор.

Катионнообменная колонка. Время выхода Gla с колонки сильно зависит от рН первого буфера. На анализаторе Bcckman 121 М при рН нитратного буфера 2,68 времена элюирования составляли 13,0, 17,4 и 30,5 мин соответственно для Суа, таурина и Gla. Другие аминокислоты элюировались позднее. Расчетный коэффициент по нипгидрипу для Gla составляет 39% от коэффициента для Glu [145]. В буфере рН 3,25 Gla плохо разрешается с пироглутаминовой кислотой. Для их идентификации собирают фракцию элюата и берут две параллельные пробы: первую для щелочного (2,5 М NaOH, 105°С, 24 ч), вторую для кислотного (6 М HCI, аналогичные условия) гидролиза. Пироглутаминовая кислота в обоих случаях полностью гил-ролизустся до глутамнновой кислоты. Концентрацию Gla находят из разницы между количеством глутамнновой кислоты, образовавшейся при кислотном и щелочном гидролизах. В качестве внутреннего стандарта при количественном определении используют [14С] цистсиновую кислоту. Суммарный выход Gla в виде Glu

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
где в туле обучают на мастера по ремонту газовых котлов
панели для домашнего кинотеатра
врегда проектора и экрана
стоимость билетов на концерт киркорова

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)