химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ответственно в аспарагиновук> и глутамиповую кислоты. Общее число амидов дикарбоновых аминокислот может быть определено по количеству выделяющегося аммиака в селективных условиях кислотного гидролиза (концентрированная ИС1, при 37 °С, 10 сут или 2 М НС1, 100 °С, 2—8 ч). Одновременно происходит незначительное деаминиро-ванис остатков серина, треонина, цистииа и триптофана. Порция гидролизата в микродиффузионном аппарате Конвея подщелачивается, и после диффузии в течение ночи аммиак определяется по реакции с пингндрипом фотометрическим методом [401]. Глутамин более легко деамидируется, чем аспарагин [32]. Амиды аспарагиновой и глутаминовоп кислот могут быть-определены раздельно химическим и ферментативным методами [369]. См. обзор [8].

Белки даже после диализа часто содержат свободный аммиак, от которого освобождаются пропусканием раствора белка через колонку с катионообменником в Н+-форме.

8.8.1. Методики определения амидов

8.8.LL Диффузионный метод [401].

Контрольный опыт. Растворяют 10 мг белка в 1 мл 0,03 М НС1 в метаноле и осаждают 2 мл этилового эфира. Центрифугируют. Процедуру повторяют дважды. Осадок сушат в вакууме и количественно переносят во внешнюю камеру диффузионного сосуда Конвея. В центральную часть ячейки помещают 1 мл 0,02 М H2S04. Быстро и осторожно к осадку белка прибавляют 1 мл насыщенного раствора тетрабората натрия, подщелаченного до* рН 10,5 2 М NaOH. Крышка сосуда должа быть герметично закрыта с дополнительным грузом сверху. Процесс диффузии проходит в течение ночи при комнатной температуре. Содержимое центральной ячейки переносят количественно в колбу и разбавляют водой до определенного объема. Определяют аммиак реакцией с пингндрипом фотометрическим методом.

Лмидный азот в белке. Инкубируют 2 мг белка в 1 мл 2 М НС1 при 100°С 2—8 ч; охлаждают и в случае необходимости центрифугируют. Переносят 100—250 мкл раствора во внешнюю камеру сосуда Конвея, как я контрольном опыте, но используют более концентрированный боратный буфер (15 мг борной кислоты в 100 мл 2 М NaOH). На каждое измерение требуется —0,2 мкмоль NH3. Строят график зависимости количества выделившегося NH3 от времени и определяют величину отрезка, отсекаемого прн> экстраполяции к нулевому времени.

256

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

8.8.1.2. Диффузионный метод с тринитробензолсульфокислотой [399]. Реагенты.

2,4,6-Тринитробензолсульфокислота (ТНБС) псрскрпсталлизована из 1 М НС1 в воде [110].

Раствор ТНБС (1,1 М; 100 мг/200 мл воды) используют свежеприготовленный. Хранят замороженным в темноте.

Сульфат аммония («для анализа», фирма Merck) сушат 3 ч при 100 °С и храпят в эксикаторе над силикагелсм.

Борная кислота, 0,1%-ный раствор (масс./об.). Na2B407, насыщенный водный раствор.

A. ОД М Na2S03; готовится ежедневно. 5. 0,1 М NaH2P04.

b. 0,1 М Na2B407 в ОД М NaOH.

Г. 1,5 мл Л+98,5 мл Б (готовится ежедневно).

Методика. Гидролизуют белок 10 М НС1 при 37 °С 10 сут, Гидролизат помещают во внешнюю камеру диффузионного сосуда Копвея и добавляют воду, чтобы общий объем составил 1,5 мл, В центральную ячейку наливают 0,9 мл 0,1%-ной борной кислоты. Наносят смазку па крышку камеры, слегка приподнимают се и быстро добавляют 3 мл насыщенного раствора тстрабо-рата натрия, подщелаченного до рН 10,5 2 М NaOH. Плотно закрывают камеру и сверху крышки кладут груз. Реакционную смесь оставляют на 20 ч при комнатной температуре, затем количественно переносят содержимое центральной ячейки во взвешенную пробирку и добавлением воды доводят массу раствора до 1,5 г. Из такого объема можно взять три пробы для анализа по методике Филдса [ПО], описанной ниже; чувствительность 6 пмоль. Одновременно находят содержание воды и сульфата аммония.

Методика Филдса. Образец вносят в 0,5 мл реагента В и доводят объем до 1,0 мл. Добавляют 0,02 мл раствора ТНБС и быстро перемешивают. Через 5 мин останавливают реакцию, приливая 2 мл раствора Г. Измеряют поглощение при 420 нм.

8.8.1.3. Аминокислотный анализатор [173]. Гидролизуют 2—3 мг белка в

1 мл иодоводородной кислоты (кипящей при постоянной температуре; содержащей 0,03% гипофосфорной кислоты) (BDH-MAR); гидролиз проводят в запаянной вакуумированной ампуле при 107°С (термостат с принудительной циркуляцией воздуха) в течение 1,5 ч для растворимого и 2 ч для нерастворимого белка. Можно использовать и другие условия: 2 мл 2 М НС1, 110°С,

2 и 14 ч. Гидролизат разбавляют 5 мл 0,1 М НС1 и наносят на колонку (75X9 мм) со смолой аминекс А-5 аминокислотного анализатора фирмы Beckman. Реальное количество аммиака, образовавшегося из амидных групп, определяют вычитанием из полученной величины пика соответствующих значений, найденных в глухом (без гидролиза белка) эксперименте.

Таким образом с использованием 1,5 мг белка для гидролиза и 2,5 мг для контрольного опыта был определен единственный остаток амида дпкар-боновой аминокислоты в белке с молекулярной массой 7000. Гидролиз иодоводородной кислотой и микрометод Кьельдаля дали сравнимые результаты. Аналитическая колонка должна иметь сверху слой смолы в 1 см, расположенный на тефлоновой прокладке для задерживания негидролизованного белка. Эта часть смолы (с прокладкой) удаляется перед подачей на колонку раствора NaOH и затем регенерируется нагреванием при 70 °С с 12 М серной кислотой.

ТНФ-а-аминогруппы ТНФ-е-аминогруппы ТНФ-тиолгруппы

22 000 15 200 2250

8.9. СЕРУСОДЕРЖАЩИЕ АМИНОКИСЛОТЫ

257

8.8.1 А. Бис(1)1-трифтороацетокси)иодобензол [345]. Реагент

Бис(1,1-трифтороацетокси)иодобеизол (БТИ) может быть приготовлен по методике, описанной в работе [287]. Растворяют при слабом нагревании 5,0 г фснилиодозилацетата (фирма Aldrich) в 25 мл безводной ТФУ и оставляют стоять при комнатной температуре 1 ч. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток перекристаллизовывают из смеси гексан-ТФУ. Температура плавления 123—126 °С. Хранят в темной склянке при —20 °С.

Методика. Разрушение карбоксиамидных групп. Раствор 200 мкг белка в 2 мл 0,01 М ТФУ или 5 М гуанидин-HCl — 0,01 М ТФУ смешивают с 2 мл свежеприготовленного БТИ в диметилформамиде (36 мг/мл). Ампулу вакуумируют и запаивают; нагревают при различных температурах (35, 60 и 110 °С) в течение увеличивающихся периодов времени (4 и 18 ч). Удаляют избыток реагентов диализом против воды (мембрана типа Spectrapor 3). Экстрагируют диализованный образец три раза равным объемом я-бутилаце-тата. Лиофилизуют. Гидролизуют 6 М НС1 в вакууме при 110°С 24 ч.

Аспарагип превращается количественно в 2,3-дпамппопропионовую кислоту, а глутамин — в 2,4-дпаминомасляпую кислоту. Эти кислоты обычно н? отделяются от лизина на аминокислотном анализаторе, поэтому содержание амидов в белке определяется дифференциальным методом, т. е. находят содержание Asp п Glu в образцах без обработки белка БТИ и после такой обработки. Некоторые аминокислоты (Cys, His, Lys, Met и Thr) затрагиваются при реакции с БТИ.

8.8.1.5. Ферментативный гидролиз и газожидкостная хроматография [150].

Ферментативный гидролиз. 0,2 мкмоль пептида в 0,2 мл 0,05 М NH4HCO3 (рН 8,0) гидролизуют проназой (1% по массе) 24 ч при 37 °С. Затем продолжают гидролиз еще 17 ч, добавив 4% (по массе) аминопептидазы М. Лиофилизуют.

Газожидкостная хроматография. Смесь аминокислот в сосуде с завинчивающейся пробкой с тефлоновым вкладышем обрабатывают 0,2 мл 1,25 М НС1 в н-бутаноле при 100°С в течение 7 мин. Реакционную смесь охлаждают во льду и сушат в потоке азота. Затем проводят анилироваппе, для этого к остатку добавляют 0,1 мл трифтороуксусного ангидрида в метиленхлориде (1:3) и нагревают смесь 20 мин при 100°С. Производные аминокислот разделяют на колонке (1,5 мХ4 мм) е хромосорбом О. В качестве внутреннего стандарта используют «-бутилстеарат, содержащий 0,325% (по массе) эти-ленгликольадипата. Приведенные условия этерификацпи должны строго соблюдаться во избежание возможного частичного превращения амидов в аспарагиновую и глутаминовую кислоты.

8.9. Серусодержащие аминокислоты

8,9.1. Методы определения

8.9.1.1. Цистеин и цистин. По методике, описанной в работе [262] определяется сумма остатков цистеина и цистина в виде цистеиновой кислоты и метионин в виде сульфона. Можно проводить анализ углеводсодержащих образцов, некоторые аминокислоты (His, Тгр и Туг) при этом разрушаются [162].

Реагенты. Иадмуравьиная кислота. К 9 мл 88%-пой муравьиной кислоты добавляют 1 мл 30%-пого Н202. Смесь оставляют па 1 ч при комнатной температуре, затем охлаждают до 0°С.

Раствор стандартов. Растворяют 20 мг цистниа, 30 мг метионина и 20 мг алаиина в 2 мл 1 М NaOH и доводят объем до 10 мл. Для анализа используют 10 мкл раствора.

17-703

258

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Методика. К белку (содержащему около 0,1 мг цистина) в пробирке из пирекса приливают 2 мл раствора надмуравьиной кислоты и оставляют при 0°С на 4 ч (для растворимого белка) или па ночь (для нерастворимого). Затем добавляют 0,3 мл 48%-иого НВг при встряхивании пробирки. Смесь испаряют досуха при 40 °С на роторном испарителе. Гидролизуют образец белка в 3 мл 6 М НС1 в вакууме при 110 °С 18 ч; высушивают и анализируют с помощью ионообменной хроматографии. Выход метиоиинсульфона 100±2%, цистеиновой кислоты 94±2%. Число остатков полуцистин+цистеин, а также метионина лучше вычислять по отношению к молярным количествам стабильных в этих условиях аминокислот (Ala, Leu, Asp и Glu).

8.9.1.2. Определение сульфгидрильных групп и остатков полуцистинов. В основе метода определения как свободных сульфгидрильных групп, так и остатков полуцистинов в белке [343] лежит реакция, схематически изображенная с помощью уравнения (8.1).

SCH.COOH

:) Рогстаноичеши'

1) ТГТ(МТИ0ИЛТ

С ySCHXOOH + CySSCV

Определение свободных SH-групп. Растворяют белок (0,3 мкмоль) в 0,1 М трис — HCl-буферс, (рН 8,3), содержащем 1 мМ ЭДТА, при 4 °С в отсутствие или присутствии 6 М гуанидин-HCl и ДТТ (0,1 мл, 10 мкмоль) и добавляют 10-кратный мольный избыток перскристалпзовашюй нодоуксуспой кислоты (ICILCOOH). Может быть использован калнйфосфатиын буфер (рП 6,7). Гидролизуют 4 М мстапсульфокислотон (разд. 8.7.2). Определяют карбоксиметилцистеип па аминокислотном анализаторе.

Определение остатков полуцистина. Охлаждают 1 мл раствора гидролп-зата белка и добавляют к нему 0,3 мл пиридина (перегнанного над инпгпдри-иом), 0,9 мл 4 М NaOH (до рН 6,8) и затем ДТТ (4 мкл в 1 мл воды). Продувают азотом, закрывают пленкой парафильм и инкубируют при 37 °С 1 ч. По окончании восстановления добавляют твердый тетратиопат натрия (60 мг, 200 мкмоль) и оставляют при 25° не менее чем па 5 ч для превращения всех остатков цистеина в 5-сульфоцистеипы. Реакционную смесь упаривают па роторном испарителе в вакууме при 30°С. Осадок после упаривания растворяют в 0,5 мл воды и вновь сушат досуха (для удаления пиридина). Растворяют остаток в буфере с рП 2,2, фильтруют и определяют S-сульфоцистепн па аминокислотном анализаторе.

8.9.1.3. Определение дисульфидных связей. Описываемая ниже методика [365] более удобна, чем предыдущие, и позволяет проводить анализ с более высокой чувствительностью (Ю-8 моль дисульфида) и скоростью. Ошибка определения составляет ±3%.

Дисульфпдная связь расщепляется избытком сульфита натрия [уравнение (8.2) J. Образовавшиеся тиоловьте группы вступают в реакцию с 2-нитро-5-тиосульфобензойной кислотой (НТСБ) [уравнение (8.3)] и переводятся в сульфопроизводные; эквимолярное количество выделившейся 2-питро-5-тно-бспзопной кислоты (МТБ) измеряется спсктрофотомстрпчсски (?412 нм = 13 600).

R-S—S—R'-f S032" ^ R—S—S03~ + R/S~— (8.2)

S.9. СЕРУСОДЕРЖАЩИЕ АМИНОКИСЛОТЫ

259

R'S-—t-НТСБ R'SS034-NTB (8.3)

Приготовление реагента. Исходный реагент НТСБ получают в виде

0,5 мМ раствора по уравнению (8.4). Растворяют 0,1 г (2,5-10*4 моль)

5,5/-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) (реагент Эллмана; фирма

NO, N02 4 N02 NO:

ДТНБ НТСБ НТБ

Aldrich) в 10,0 мл 1 М Na2S03 (Ы0~2 моль) при 38 °С и доводят рН до 7,5. Продувают через раствор кислород, контролируя ход реакции по увеличению еочержания НТБ измерением поглощения при 412 нм (концетрация НТБ достигает максимума — 99%—через —45 мин). Раствор НТСБ хранят при —20°С, он стабилен в течение 6 месяцев; используется без очистки.

Раствор НТСБ для анализа. Исходный реагент НТСБ разбавляют в 100 раз раствором, содержащим 0,2 М трнс (основание), свежеприготовленный 0,1 М ЫагБгОз, 3 мМ ЭДТА н 2—3 М гуанидинтиоциаиата (фирма Eastman); доводят рН смеси до 9,5 с помощью НС1. Раствор стабилен в течение двух недель при комнатной температуре.

Анализ дисульфидов. К 3 мл раствора НТСБ для анализа добавляют по каплям из пипетки 0,01—0,20 мл раствора пептида или белка (с концентрацией S —S-связсй 0,5—2 мМ). Смесь инкубируют в темноте в течение 5 мин (пептид) и 25 мин (белок). Измеряют поглощение при 412 им против холостого опыта (3 мл раствора НТСБ для анализа в соответствующем объеме воды).

Замечание. Гуанидин применяют для денатурации белка, приводящей к большей доступности дисульфидных связей. Мочевину нельзя использовать для этих целей, поскольку присутствующий в ней цнанат аммония реагирует с тиольными группами. Последовательные операции по расщеплению дисульфидных связей и титрованию тиольпых групп проводят в одном и том же реакционном сосуде, поэтому ист необходимости в удалении растворенного кислорода. Метод можно применять в пептидном картировании для селективной идентификации цистиновых и цистеиновых остатков с последующим их выделением. НТБ-апнон претерпевает фотохимическое превращение, продукт которого уже не поглощает при 412 им [88], поэтому инкубирование должно проводиться в темноте.

Реагент Эллмана был предложен для прямого титрования свободных тиольных групп в белках [105]; позднее эта реакция была изучена более подробно [312].

8.9.1.4. Определение S-сульфиноаланина и цистеиновой кислоты методом ВЭЖХ [171]. S-Сульфиноалании (сульфиповая кислота L-цистсина (Csa) и цпстеиновая кислота (Суа) (как н О-фосфосерип) элюируются совместно в диапазоне нескольких минут на катиоиообменной колонке; однако они хорошо разделяются на сильноосновиой апиоиообменной смоле (ISA-07/S2504. (фирма Schimadsu) при элюировании 0,05 М КН2Р04. Времена удерживания: Csa 22 мин, Суа 35 мин, Ser(P) 41 мин.

Для идентификации этих аминокислот можно использовать обработку (после их выхода с колонки) реагентом ОФА + меркаптоэтанол (разд. 8.16.3,1),

260

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

для образующихся производных существует линейная зависимость площади пика флуоресценции от выхода: для Csa в интервале 20 пмоль — 5 имоль и для Суа в интервале 10 пмоль — 5 имоль.

8-9.1.5. Определение сульфгидрильных. групп с п-хлоромеркурибензоатом. Органические ртутьсодержащие соединения, впервые предложенные в 1937 г [152J, до сих пор остаются наиболее специфичными и чувствительными реагентами па сульфгидрильные группы в интактиых белках. Ниже описывается метод Бойера [37]. Реагент

п-Хлоромеркурибензоат. Для очистки реагент растворяют в 1 М NaOIl и, если необходимо, центрифугируют. Добавляют 1 М НС1 до выпадения осадка, повторяют переосаждепие дважды. Осадок промывают 3 раза дистиллированной водой. Сушат в топком слое в в

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
планета ручки оконные
лайтбоксы подвесныес подсветкой светодиодами led
оборудование для фоновой музыки в ресторане
слова благодарности спонсорам

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.12.2017)