химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

лков для аминокислотного анализа подробно обсуждается в ряде обзоров [27, 106, 220, 266, 293, 317, 327].

8.6.1. Методики кислотного гидролиза

H.6.L1. Соляная кислота. Для гидролиза используют кипящую при постоянной температуре соляную кислоту (разд. 8.4) или продажную 6 М HCI высшего качества с добавкой 0,02% меркаптозтанола и 0,25% (масс./об.) фенола. Для удаления следов кислорода пропускают через кислоту в течение 5 мин поток азота.

Приготовление образцов для гидролиза. Пробирки или ампулы, которые могут быть изготовлены путем запаивания коротких трубочек из стекла пирекс, в целях очистки следует обработать, как описано в разд. 8.2. Берут навеску (1—5 мг) высушенного на воздухе или лиофнлиловапного белка (взвешивают прямо в ампуле); можно использовать и раствор белка, при >том лиофилизацию алнквотпой части раствора проводят также в ампуле. Анализируемый образец не должен содержать солей, поэтому используют летучие буферные растворы.

Добавляют к осадку 6 М HCI (1 мл на 5 мг белка или при меньших количествах 10—200 мкл). Вращением ампулы в пламени кислородно-газовой горелки под углом 45° разогревают стекло в верхней части и оттягивают его так, чтобы образовался «перешеек» с диаметром ~1 мм. Чтобы не обжечь руки, можно припаять к ампуле небольшую стеклянную трубку. Замораживают содержимое ампулы в бане (ацетон с твердой углекислотой), присоединяют ее к вакуумной линии с помощью короткой резиновой или тайгоновой трубки и откачивают воздух на масляном насосе ниже остаточного давления О'10~2 мм рт. ст. При работе одновременно с несколькими образцами удобно использовать стальную или стеклянную систему (рис. 8.1). Ампулы одеваются на боковые отростки на пробках. Трехходовой кран в положении 1 позволяет включать и отключать вакуум.

В процессе вакуумирования (обычно 3—5 мин бывает достаточно) образец должен находиться под наблюдением. Если масса в ампуле начинает подниматься или «вскипать», то на короткое время к верхней ее части подводят тепло. Если эта процедура не помогает, на мгновение открывают крап / м тут же его закрывают. При необходимости повторяют эту процедуру несколько раз. Второй трехходовой кран в положении 2 присоединен к баллону с азотом, что делает возможным проводить попеременно удаление воздуха нз системы и наполнение ее азотом до полного исключения кислорода. В процессе вакуумирования рекомендуется осторожно разморозить содержимое ампулы для удаления растворенного кислорода.

По завершении вакуумирования при работающем насосе с помощью узкого пламени кислородной горелки отпаивают ампулы по перешейку.

Описана методика, позволяющая подготовить для проведения кислотного или щелочного гидролиза за 1 ч 12 образцов в вакуумном эксикаторе [302].

Условия гидролиза. Ампулу помещают в термостат с циркулирующим воздухом, прогретым до 110 °С; точный температурный контроль процесса очень важен [266]. Удобно использовать для этих целей термостат газожидкостного хроматографа.

По окончании гидролиза (т. е. через 24, 48 или 72 ч) ампулу осторожно центрифугируют. Затем с помощью напильника (или стеклореза) на верхней части ампулы делают насечку и прикосновением раскаленной стеклянной

8.6. ИСЧЕРПЫВАЮЩИЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ 251

^__^ образец

РИС. 8.1. Приспособление для вакуумирования ампул для гидролиза белков. Стальной трубопровод (наружный диаметр 20 мм) имеет шесть боковых отростков с отверстиями (длина 65 мм и наружный диаметр 6 мм). 1 и 2 — места трехходовых кранов. Ампулы для гидролиза имеют узкую шейку 3 и присоединяются с помощью пробки из силиконовой резины 4.

трубки к смоченной водой насечке отламывают верхний конец и оплавляют острый край. Невскрытые ампулы хранят при —20 °С.

Для быстрого удаления соляной кислоты используют поток азота, роторный испаритель или скоростной вакуумный концентратор. Если гидролизу подвергалось много образцов, то можно их лиофилизовать. Для этого закрывают ампулы пленкой типа парафильм, делают в ней небольшие отверстия, замораживают в бане (ацетон — твердая углекислота) и помещают в вакуумный эксикатор над твердым NaOH или КОН (КОН в форме чешуек). Лно-филизуют на масляном насосе, снабженном ловушкой со щелочью, обычно в течение ночи. В условиях такого достаточно медленного удаления HCI, хотя этот способ общепринят, происходит дальнейшее разрушение остатков серина и треонина, что приводит к артефактным пикам на хроматограммах аминокислот [266].

Описана методика быстрого удаления соляной кислоты из большого числа гидролизатов белков без вспенивания, основанная на использовании центрифуги [195]. (См. разд. 8.5).

Перед нанесением аликвоты раствора на колонку анализатора рекомендуется профильтровать гидролизат через мембрану Millipore (0,45 мкм).

8.6.1.2. Методика быстрого гидролиза. Быстрый гидролиз свободных и присоединенных к носителям пептидов проводится в следующих условиях [397]: смесь пропионовая кислота — 12 М HCI (1 : 1), вакуум, 160 °С, 15 мин. Для количественного определения серина в образце температуру гидролиза снимают на 10 °С.

8.6.1.3. Гидролиз в незапаянных ампулах. В некоторых случаях, если в лаборатории нет кислородных горелок, гидролиз белка проводят в сосудах, снабженных краном для вакуумирования [89]. Реакционные пробирки этого типа выпускаются фирмой Pierce.

Гидролиз может быть проведен в атмосфере азота. Взвешивают белок или упаривают раствор непосредственно в небольшом сосуде с завинчивающейся крышкой с тефлоновым вкладышем. Добавляют 100—150 мкл 6 М HCI, продувают азотом и немедленно закрывают сосуд, обработка ультразвуком

252

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

на этой стадии способствует удалению растворенного воздуха [193]. Гидролиз, проводят в алюминиевом блоке при 155 °С в течение 20 мин. Этого времени обычно бывает достаточно для достижения результатов, аналогичных полученным в классических условиях (110 °С, 22 ч), но гидролиз может быть и более продолжительным [142].

Результаты аминокислотного анализ рибонуклеазы после быстрого (145___2°С, 4 ч) и обычного (110°±1 °С, 24 ч) гидролизов были идентичными. Авторы подчеркивают, однако, что для получения достоверных данных предварительно должны быть построены графики зависимости выходов аминокислот от времени гидролиза [193, 317].

8.7. Триптофан

В условиях кислотного гидролиза соляной кислотой триптофан практически полностью разрушается, особенно если белковая молекула содержит углеводные компоненты. Были предприняты попытки получить лучшие результаты; для этого к НС1 добавляли тиогликолевую кислоту или соляную кислоту заменяли на я-толуолсульфокислоту, метансульфокислоту или меркаптоэтап-сульфокислоту (см. методики в разд. 8.7.1).

Наилучшие результаты по триптофану дает альтернативный кислотному щелочной гидролиз, однако при этом молярные соотношения аминокислот должны рассчитываться из данных независимых анализов кислотных гидролизатов [168]. При проведении щелочного гидролиза щелочную среду создают с помощью Ва(ОН)2 [318], NaOH [168] и LiOH [226]. В качестве внутреннего стандарта используют 5-метилтриптофан; по его выходу вносят поправку на деструкцию триптофана [404], следует иметь в виду, что на некоторых колонках 5-метилтриптофан элюируется совместно с лизиноаланииом, образующимся в процессе щелочного гидролиза [419].

8.7.1, Определение триптофана после щелочного гидролиза белка

8.7.1.1. Методики.

Методика 1. Использование NaOH [168].

Реагенты. Продажный частично гидролизованный крахмал (50 г) промывают ацетоном, сушат и используют в качестве антиоксиданта.

1-%ный октиловый спирт в толуоле для подавления вспенивания.

50%-ный NaOH (масс/об.) разбавляется непосредственно перед употреблением.

Методика. К 1—5 мг белка в полипропиленовой центрифужной пробирке (109X5,0 мм) добавляют 25 мг крахмала, 0,5 мл 4,25 М NaOH (или 0,1 мл раствора белка и 0,5 мл NaOH) и 5 мкл 1%-ного октилового спирта. Пробирку помещают в запаянную с одного конца трубку из пирекса; верхнюю часть трубки оттягивают в пламени газовой горелки (без нагревания пластикового вкладыша). Нижнюю часть этой незапаянной еще ампулы с центрифужной пробиркой охлаждают в бане (ацетон + «сухой» лед), не замораживая содержимого. Ампулу вакуумируют до остаточного давления <5-10~2 мм

8.7. ТРИПТОФАН

253

ртутного столба и запаивают. Нагревают при 110 °С обычно в течение 16— 24 ч или более (до 96 ч); если в белке имеются связи Пе-Тгр или Val-Trp, ю гидролиз ведут при 135 °С в течение 48 ч.

Охлажденную пробирку осторожно открывают, добавляют 0,5 мл 0,20 М Na-цитратного буфера (рН 4,25). Раствор с помощью пастеровской пипетки переносят (с последующими промывками) в мерную колбу объемом 5 мл, содержащую 420 мкл 6 М HCI, охлажденной в «сухом» льду. Доводят объем до 5 мл нитратным буфером.

Замечание. Триптофан анализируют на короткой катионообменной колонке (80X9 мм) [267] с Na-цитратным буфером (рН 5,4). Нейтральные и кислые аминокислоты выходят с колонки вместе за 20 мин, триптофан — на 35-й минуте, лизнноаланин (образующийся во время щелочного гидролиза) на 53-й минуте; затем элюируются Lys (65 мин), His (80 мин) и NH3 (95 мин). Причиной того, что для анализа не применяют обычный буфер с рН 2,2, является частичная потеря (10%) Trp при 25 °С. Выходы триптофана составляют 100±3%.

Методика 2. Использование LiOH [226]. Для гидролиза белка используют пробирки с завинчивающейся пробкой с тефлоновым вкладышем (1 мл 4 М LiOH на 25 мг образца). Пробирку с образцом продувают азотом, замораживают и бане с ацетоном и «сухим» льдом и плотно закрывают. Гидролизуют в течение 20 ч при ПО °С или 4 ч при 145 °С, что дает приблизительно одинаковые результаты. Гидролизат охлаждают и нейтрализуют 85%-ной оргофосфорпой кислотой; доводят до определенного объема. Аликвоту разбавляют 0,2 М фосфатным буфером (рН 7,0) для анализа.

Замечание. Экстраполяция к нулевому времени гидролиза показала, что за 4—8 ч при 145 °С разрушается ~5% Trp. При сравнении двух методик щелочного гидролиза найдено, что лучшие результаты дает применение LiOH.

8.7.2. Определение триптофана после кислотного гидролиза белка

8.7.2.1. Методики.

Методика 1. Использование НС1 с добавкой тиогликолевой кислоты [246]. Гидролизуют белок со свежеприготовленной 6 М НС1, содержащей 4% тиогликолевой кислоты, при 108—110 °С 24—64 ч. Выход Trp ~90%. Выходы других аминокислот, за исключением пролина, не меняются. Углеводы в небольших количествах не мешают анализу; в то же время при 50-кратно\г молярном избытке глюкозы Trp в белке не был обнаружен.

Методика 2. Использование п-толуолсульфокислоты [223]. /г-Толуолсуль-фокислоту перекристализовывают из соляной кислоты и тщательно освобождают от НС1 путем высушивания в вакууме при 45 °С над NaOH (гранул.) (тест на отсутствие ионов хлора — реакция с 1%-ным раствором AgN03 в 50%-ной НШз).

Гидролизуют 2—4 мг белка в 1 мл 3 М /г-толуолсульфокислоты, содержащей 0,2% (масс/об.) 3-(2-аминоэтил)индола, смесь вакуумируют (2-Ю-2— 3-Ю-3 мм рт. ст.) при П0°С в течение 24, 48 или 72 ч. Охлаждают, добавляют 2 мл 1 М NaOH, доводят объем до 5 мл, фильтруют и берут аликвоту на анализ. Одновременно с триптофаном определяются и другие аминокислоты. Образец должен содержать не более 2 мг углеводов.

Методика 3. Использование меркаптоэтансульфокислоты [292]. Гидролизуют белок в 1 мл 3 М меркаптоэтансульфокислоты при 110°±2°С 24 и 72 ч. Охлаждают, добавляют 2 мл 1 М H2S04 и количественно переносят в 5 мл колбу.

Замечание. Эта методика приводит к выходам лучшим, чем методика 1, и почти таким же, как методика 2. В химотрипсине после 22- и 72-часового

254

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

гидролиза найдено 96 и 91% Тгр соответственно. Методика рекомендуется только для чистых белков.

Методика 4. Использование метансульфокислоты [343]. 4 М метансуль-фокпслоту готовят разбавлением концентрированной кислоты с добавкой твердого 3-(2-аминоэтил) индола до концентрации 0,2% (масс/об.). Реагент продувают азотом и хранят при 4 °С. Препарат поставляет фирма Pierce. Белок (0,2—2,0 мг) гидролизуют в вакууме (2-10~2 мм рт. ст.) при 115°С, -22, 48 и 96 ч в 1 мл метансульфокислоты (0,3 мл при количестве образца <1 мг). Частично нейтрализуют 3,5 М NaOH, доводят до определенного объема. Центрифугируют или фильтруют перед нанесением на колонку анализатора.

Замечание. Потери Тгр (3,2%), Thr (5,9%), Ser (9,6%) меньше, чем в "Методике 2. Однако при содержании углеводов в белке >20% потери Тгр становятся значительными и его количественное определение невозможным [172].

8.7.3. Определение триптофана в интактном белке

Триптофан в интактном белке может быть определен спектро-фотометрически [103, 128, 349], флуорометрически [337] или колориметрически после перевода в окрашенное производное [11, 14, 334, 351]. На ограниченном числе белков были опробованы метод магнитного кругового дихроизма при 293 нм [13] и сцинтилляционный метод с использованием 3-диазо-1,2,4-*[5-14С]триазола [97]. На пикомольном уровне триптофан был определен по модифицированной реакции Пиктет-Шпенглера: смесь кипятят с феррицианидом калия и формальдегидом, количество образовавшегося 9-гидроксиметилф-карболина определяют спектрофотометрически или методом ВЭЖХ на обращенной фазе [174].

Триптофан присутствует в белках в наименьших по сравнению с другими аминокислотами количествах, поэтому его тщательный анализ делает возможным прецизионное определение молекулярной массы белка.

3.7.3.1. Определение с 2-гидрокси-5-нитробензилбромидом [11] Реагенты

Мочевина, перекристаллизованная из смеси этанол — вода. 2-Гидрокси-5-нитробензилбромид (ГНБ-Вг). Трихлороуксусная кислота (ТХУ), 50%-ная.

Методика. Анализируемый белок инкубируют при 37° 16—20 ч в 1 мл 10 М мочевины, подкисленной до рН 2,7 концентрированной НС1, охлаждают до комнатной температуры и добавляют (самотеком из пипетки, погруженной в раствор белка) при размешивании на магнитной мешалке 5 мг ГНБ-Вг в 0,1 мл сухого ацетона. Образующийся осадок (в основном продукт гидролиза реагента) удаляют центрифугированием.

Модифицированный белок пропускают через колонку (230X11 мм) с сефадексом G-25 (грубая фракция), уравновешенную 0,18 М уксусной кислотой (рН 2,7) или 10 М мочевиной (рН 2,7). В этих условиях белок остается в растворе. Элюируют со скоростью 100 мл/ч, собирая фракции по 1—4 мл. Белок осаждают 50%-ной ТХУ, добавляя ее в раствор до конечной концентрации 5%. Если использовалась мочевина, то перед добавлением ТХУ раствор разбавляют пятикратным объемом воды. Элюат оставляют при 4 °С на 30 мин

8.8. ОСТАТКИ АМИДОВ ДИКАРБОНОВЫХ АМИНОКИСЛОТ

25S

или на ночь, образовавшийся осадок отделяют путем центрифугирования, промывают дважды 5 мл раствора этанол — HCI (2 мл концентрированной НС1 + 98 мл 95%-ного этанола). В заключение осадок растворяют в 1 мл концентрированной НС!, 0,1 мл этого раствора подщелачивают 2,5 М NaOII до рН 12, доводят общий объем раствора до 2,5 мл. Измеряют'поглощение при 410 нм (ем = 18 000). Для проведения аминокислотного анализа соответствующие аликвоты гидролизуют 6 М НС1.

8.8. Остатки амидов дикарбоновых аминокислот

В условиях обычного кислотного гидролиза (6 М НС1) аспара-гпп и глутамин превращаются со

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Стол компьютерный Мэрдэс СР-160М
где можно получить удостоверение бухгалтера кассира в москве
купить подарок мужчине в москве
бейсбольные спайки купить в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)