химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

скольких часов при 550—625° (поместив их в стеклянный сосуд, закрытый алюминиевой фольгой) для разрушения возможных примесей аминокислот; после такой обработки посуду надо хранить в закрытом пыленепроницаемом контейнере.

При работе с микрограммовыми количествами вещества становятся ощутимыми потери за счет адсорбции на стенках сосуда. Они могут быть сведены к минимуму обработкой поверхности стекла или соответствующей модификацией растворителя. В этом отношении пробирки из Полипропилена или поликарбоната лучше, чем стеклянные. Пробирки из стекла могут быть обработаны силилирующим реагентом, например диметилди-хлоросиланом в четыреххлористом углероде (2%-ный раствор [137]) или триметилхлоросиланом в толуоле (5%-ный). После вымачивания в течение 5 мин в указанных растворах растворителю дают стечь, стекло промывают ацетоном и высушивают в вертикальном положении в термостате при 110°С.

Силаиизируют также стеклянные пластинки для электрофореза в полиакриламидном геле [274, 309]. Для этого их моют детергентом, водой, ацетоном и погружают в 0,2%-иый раствор полификса D (фирма Desaga) в смеси этанол — вода (1:1) или опрыскивают этим раствором. После такой обработки пластинки сушат под инфракрасной лампой на расстоянии —20 см (температура ~ 60 °С); соблюдение условий высушивания очень важно. Силаиизированные пластинки можно хранить в течение нескольких недель.

Стекло может быть также обработано сначала 3-амииопро-пилтриметоксисиланом, а затем глутаровым альдегидом с последующим добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) и восстановлением борогидридом натрия или 1%-ным (масс./об.) раствором полиэтиленгликоля 20 000 в деионизован-ной воде и высушено при 110°С [5].

Однако обработка стеклянных и пластиковых поверхностей разными реагентами может привести к их загрязнению, поэто-

* Во всех случаях, где это не указано особо, содержание растворителей в смеси дано в объемных соотношениях. — Прим. перев.

8.3. ВОДА

245

му для снижения адсорбционных потерь белков лучше прибегать к модификации растворителя. С этой целью удачно применены добавки к растворителю глицерина (до 50%-ной концентрации) и тритона Х-100 (до 0,2 ммоль) [356]. При работе в пластиковых емкостях может быть использован глицерин или тритон Х-100 для растворов как с низкой, так и с высокой ионной силой, а в стеклянных сосудах рекомендуется применять глицерин для растворов с низкой и тритон Х-100 с высокой ионной силой. Следует заметить, что адсорбционная способность белков весьма различна.

8.3. Вода

Для многих целей пригодна деионизованная вода. Система Milli-Q, включающая ионообменную колонку и углеродные фильтры, обеспечивает производство высокоочищенной воды, содержащей менее 5-10_6% примесей органических веществ (фирма Millipore).

Трехкратная перегонка воды в стеклянном аппарате не избавляет от всех примесей. Для полного удаления аминокислот и аммиака рекомендуется кипятить воду перед дистилляцией с нингидрииом (2—4 г/л). Для разрушения аминокислот может быть использован также гипохлорит, избыток которого восстанавливают и воду перегоняют [142].

Методика. К 2500 мл воды в 5 л сосуде для перегонки добавляют 0,5 г NaOH (гранул.), 6,5 мл 4—6% (масс/об.) раствора NaOCl и кипятят в течение ночи. Приливают 4 мл концентрированной H2S04 (осторожно!) и 2 г SnCh-2H20. Перегоняют в колбу, защищенную ловушкой с лимонной кислотой. Проверяют присутствие ионов хлора добавлением 1 г KI к 10 мл воды, если появляется желтое окрашивание, добавляют еще хлорид олова. Собирают 2 л дистиллированной воды. Лучше использовать в анализе свеже-перегнанную воду. См. в разд. 8.16.1 определение чистоты цитратных буферов [142].

8.4. Соляная кислота

Некоторые партии коммерческой соляной кислоты содержат примеси аминокислот, которые могут быть удалены трехкратной перегонкой. Хранить очищенную НС1 рекомендуется в небольших запаянных стеклянных ампулах, поскольку в большом объеме, который часто открывают, кислота быстрее загрязняется. Соляная кислота (12 М) может быть приготовлена также пропусканием газообразного НС1 (через предохранительную склянку с серной кислотой) в воду до насыщения (сосуд с водой, в которую пропускают НС1, должен быть защищеь ловушкой с лимонной кислотой).

246

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Кипящая при постоянной температуре НС1 (5,7 М) получается перегонкой концентрированной НС1, к которой добавлена очищенная вода (9:11). См. разд. 8.6.1 — использование НС1 для гидролиза белков.

Тест на чистоту НС1. Выпаривают 1 мл НО на роторном испарителе в потоке азота. Остаток растворяют в 100 мкл раствора с рН 2 (1 мл 6 М НС1 в 100 мл воды) и 50 мкл его вводят в колонку аминокислотного анализатора. Для проверки на присутствие загрязнений пептидной природы нагревают 1 мл ИС1 при 150 °С 25 мин, выпаривают и анализируют, как описано выше. Для сравнения проводят «глухой» опыт с 50 мкл раствора с рН 2 [142],

8.5. Концентрирование растворов белков

Для концентрирования белков из разбавленных растворов применяется осаждение солями, кислотами и органическими растворителями (ацетон, метанол), ультрафильтрация, диализ, выпаривание, лиофилизация. Осуществлять эти операции тем сложнее, чем меньшее количество белка находится в растворе, например трихлороуксусная кислота не осаждает белок при его содержании 1—25 мкг [17].

Белки эффективно концентрируются с помощью электрофореза в ПААГ [63, 196, 276, 277, 382] или изотахофореза [283J. Применение электрофоретической процедуры для концентрирования макромолекул путем осаждения [308] или извлечения белков из неионных растворов с использованием мембран [3] может осложняться необратимой сорбцией белка на мембране. С этой проблемой сталкиваются также и при работе с жидкими мембранами [384, 385] (см. дальше). Белки из разбавленного раствора (100—800 нг/мл) были выделены осаждением после введения радиоактивной метки с помощью [3Н]-1-фторо-2,4-ди-нитробензола [280]. Для «снятия» белков с ДЭАЭ-целлюлозы в высококонцентрированной форме использовался карбоксиметил-дскстран [367].

Наиболее распространена как метод концентрирования растворов белков лиофилизация. При интенсивном охлаждении (ацетон, этанол или изопропанол в смеси с твердой углекислотой) раствор замораживают и удаляют воду и летучие буферы в вакууме масляного насоса, снабженного специальной ловушкой. Ловушка заполняется щелочью, если упариваются кислые растворы; концентрированная муравьиная кислота перед замораживанием должна быть разбавлена водой до 30%-поп концентрации.

Для быстрого удаления воды, органических растворителей и летучих буферов может быть использован специальный концентратор фирмы Savant (Speed-Vae Concentrator), в котором упа-

8.5. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ РАСТВОРОВ БЕЛКОВ

247

ривание происходит под вакуумом в низкоскоростной центрифуге с контролируемым температурным режимом. В наборе имеются центрифужные пробирки разного объема. Метод особенно удобен для концентрирования фракций с хроматографических колонок или секвенатора, он быстрее и удобнее, чем упаривание отдельных образцов в потоке азота.

Осадки белков, полученные после экстракции неполярными растворителями или в результате высушивания при высокой температуре, могут быть трудно растворимыми. Если белок находится в виде тонкой пленки, то для его растворения используют 1 М NaOH [1 ч, комнатная температура или 10-минутное (и более) нагревание до 100 °С].

Эффективны как растворители белка водный гексафтороаце-тон [48, 82] и трифтороуксусная кислота [236]. Структурированные белки типа коллагена и кератина после обработки Н2О2 легко растворимы в 0,05%-ном ДСН в 1 М NaOH при 100°С (что используется при определении концентрации этих белков с помощью биуретовой реакции) [130].

При высушивании в высоком вакууме замороженных растворов, содержащих микроколичества свободных аминокислот, коротких пептидов или других низкомолекулярных соединений, существует опасность значительных потерь вещества, приводящая к невозможности количественной оценки процесса в целом. Например, было обнаружено, что за 90 мин лиофилизации при вакууме 5—10 мм рт. ст. (охлаждение смесью С2Н5ОН-Т-твердый С02) терялось 89% 2-[14С]-ь-фенилаланина и 86% N-феру-лоилглицил-ь-фенилаланина [378].

Для удаления нелетучих буферов, солей, надмуравьиной кислоты и других компонентов растворов белков используют диализ в диализных трубках (типа Visking). В распоряжении исследователей имеется также широкий набор коммерчески доступных целлюлозных фильтров, рассчитанных на диапазон молекулярных масс от 1000 до 50 000 (Spectrapor membrane, фирма Spectrum Medical Industries Inc.) Растворы белков могут быть сконцентрированы в аппаратах для ультрафильтрации. Следует иметь в виду, что существует вероятность потери белков в диализных трубках в результате адсорбции.

Для концентрации пептидов, растворенных в больших объемах натрийацетатного буфера (рН 7,5), содержащего 4 М мочевину, используют колонки с обращенной фазой типа Lichro-sorb Cs. Контроль элюата, содержащего соли уксусной и муравьиной кислот, обычно осуществляют с помощью флуоресцентного детектора. Быстрое обессоливание от мочевины и буферных компонентов достигается с помощью мини-колонок [278] или специальных патронов фирмы Waters [16, 392] (см. также разд. 6.2.3).

248

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Микроконденсатор, снабженный мембраной Centricon с малой адсорбционной способностью, позволяет быстро (30— 60 мин) концентрировать небольшие объемы (2 мл) до 25— 40 мкл в центрифуге с фиксированным угловым ротором. Обес-соливанис или замена буфера могут быть проведены одновременно с концентрированием (фирма Amicon — Scientific Systems Division).

Поскольку ДСН является денатурирующим агентом, часто возникает необходимость его полного удаления. Использование для этих целей электрофореза и анионообменной хроматографии приводит к низкому выходу белка. Рекомендовано проводить удаление ДСН путем так называемой ионопарной экстракции с помощью триэтил- или трибутиламмония, дающей высокие выходы (70—100%) в диапазоне от микрограммовых до миллиграммовых количеств белка [153].

8.5.1. Методики

Ниже приведено несколько примеров концентрирования белков различными методами.

8.5.1.1. Количественное извлечение белков из разбавленных растворов [396]. К 0,1 мл раствора белка приливают 0,4 мл метанола, перемешивают и центрифугируют 10 с при 9000 g (на этой и последующих стадиях). Добавляют 0,1 мл хлороформа (0,2 мл для образцов с высокой концентрацией фосфоли-пидов), перемешивают и центрифугируют 1 мин. Верхний слой отбрасывают^ к нижней хлороформсодержащей фазе приливают 0,3 мл метанола, перемешивают и центрифугируют 2 мин. Отделяют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.

Для электрофоретического контроля гомогенности выделенного образца растворяют его в 50—100 мкл ДСН (5%-ный раствор, масс/об.) или непосредственно в 50 мкл буфера, содержащего 5% ДСН,

Методика может быть использована как для растворимых, так и для гидрофобных белков, на получающиеся результаты не влияет присутствие в-исходном растворе детергентов, липидов, солей, 2-меркаптоэтанола. При содержании в исходном растворе 40—120 мкг белка в 0,1 мл выходы составляют 92—100%.

8.5.1.2. Электрофорез с использованием жидких мембран [384, 385]. Электрофорез с нелинейным градиентом рН позволяет осуществить концентрирование белков с различными зарядами быстрее, чем изоэлектрофокусирование. Два наложенных друг на друга слоя, один из аминокислот (гистидина или валина) и другой из амфолитов (Servalyte), создают жидкую мембрану, служащую барьером для белка. Таким образом 200 мл раствора рибонуклеазы было сконцентрировано в 48,3 раза за 4 ч, выход белка составил 96,6% [385]. В системе, состоящей из фармалитов (рН 2,5—5,0), гистидина (р/ 7,64) и амфолитов (рН 9—11), при напряжении 400 В за 5 ч были сконцентрированы на двух границах раздела фаз кислая и основная изоформы пероксида-зы хрена (р/ 4,0 и 8,4) [384].

8.5.1.3. Концентрирование микрограммовых количеств белка [237]. Выделение микрограммовых количеств белков из разбавленных растворов основано на осаждении трихлороуксусной кислотой с добавлением дезоксихолата. Детер-

8.(5. ИСЧЕРПЫВАЮЩИЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

249

гент, часто применяемый при выделении мембранных белков, затем удаляется экстракцией.

а) Осаждение белка

1. Добавляют 120 мкл дезоксихолата натрия (2%-ный, масс/об.) к раствору до конечной концентрации белка 80 мкг/мл. Перемешивают и оставляют стоять во льду 30 мин. Концентрация детергента может варьировать от 50 до 500 мкг/мл, не оказывая влияния па выход.

2. Приливают 10 мл холодной трихлороуксусной кислоты (24%, масс/об.) до конечной концентрации 6%. Оставляют стоять во льду в течение 1 ч до полного осаждения комплекса белок — детергент.

3. Центрифугируют при 2400 g и 4 °С в бакет-роторе 45 мин.

4. Осторожно отделяют супернатант отсасыванием.

5. Растворяют осадок в 0,5 мл 62,5 мМ трис-HCI (рН 6,8), содержащего 3% ДСН, доводят раствор до 0,5 М по NaHC03 (конечный рН 8,8).

6. Диализуют раствор в течение ночи при комнатной температуре против 2 л 6,25 мМ трис-HCI (рН 6,8), содержащего 0,3% ДСН.

7. Лиофилизуют раствор в склянках (7 мл) с завинчивающимися крышками или пробирках.

б) Экстракция детергента

1. Добавляют к высушенному образцу 1 мл экстракционной смеси: ацетон — уксусная кислота — триэтиламин (90 : 5 : 5).

2. Быстро переносят раствор в коническую центрифужную пробирку.

3. Оставляют стоять во льду в течение 1 ч для осаждения белка.

4. Центрифугируют в настольной центрифуге при комнатной температуре.

5. Удаляют супернатант отсасыванием.

6. Промывают осадок сначала 1 мл экстракционного раствора и затем 1 мл ацетона.

7. Высушивают под азотом. Выход 40—80%.

8.6. Исчерпывающий гидролиз белков для аминокислотного анализа

Гидролиз белков кислотой или щелочью приводит к потере некоторых аминокислот и их производных. В общепринятых условиях исчерпывающего гидролиза (6 М НС1, 18—24 ч, 110°С [266]) полностью разрушаются триптофан, аспарагин, глутамин, гликозиды, эфиры, образованные карбоксильными сульфо- и фосфорными группами, частично теряются серии, треонин и тирозин. Цистин и метионин частично разрушаются или окисляются до цистеиновой кислоты и метионинсульфона соответственно. Пептидные связи, включающие остатки валина, изолейцина и лейцина, гидролизуются трудно, и продолжительность гидролиза образцов, содержащих эти аминокислоты, увеличивают до 48, 72, 96 и даже 120 ч. Скорость высвобождения и деструкции индивидуальных аминокислот зависит в основном от природы белка и присутствия в нем солей и металлов (в металлопротеи-нах). Обычно кинетические кривые высвобождения серина, треонина и других лабильных остатков экстраполируют к нулевому времени гидролиза, а аминокислот с разветвленной боковой цепью — к бесконечному времени [372]. Однако может быть принято допущение, что за 24 ч теряется 10% серина и 5% трео-

250

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

нина. Окисление во время гидролиза метионина и частичное превращение тирозина в 3-хлоропроизводное может быть предотвращено добавлением к 6 М НС1 соответственно меркаптоэтано-ла и фенола. Гидролиз бе

страница 36
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
держатель туалетной бумаги с полкой
справки на оружие юзао
сигнализация с обратной связью цена
концерт филиппа киркорова волгоград 2017

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)