химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

гемоглобин; б — гемоглобин Cocody (р/ 7,205); в — гемоглобин Avicenna (р/ 7,225); г —гемоглобин Korle Bu (р/ 7,210) [1]. (С разрешения Elsevier/North Holland, Biomedical Press.)

несколько объемов колонки 0,1%-ной ТФУ. Затем для элюирования индивидуальных пептидов па колонку подается линейный градиент концентрации ацетонитрила в 0,1%-пой ТФУ. Почти все пептиды, исследованные в этой системе, сходят с колонки ко времени повышения концепт-рации ацетонитрила до 60%. Для того чтобы избежать, возможного изменения коэффициента преломления из-за неполного смешения растворов в качестве второго растворителя применяют водный ацетон итрил (60% ацетонитрила + 40% воды), содержащий 0,1 ТФУ. Все используемые растворители должны быть высокой степени чистоты, поскольку даже незначительные примеси могут сконцентрироваться на колонке и затем элюн-роваться соответствующей концентрацией ацетонитрила. Оптимальная скорость потока 1 мл/мин, более медленное элюирование не улучшает разрешения. По окончании градиентного режима колонку вновь уравновешивают стартовым буфером, чтобы она была готова для нанесения следующего образца. Могут быть использованы другие буферные системы, такие, как ацетат аммония или фосфат натрия, при нейтральном рН, дающие другие результаты разделения.

В качестве практически осуществленного примера применения ОФ-ВЭЖХ для картирования пептидов можно привести сравнительный анализ молекул нормального и мутантных гемоглобинов [1, 62]. При исследовании ?-цепей нескольких гемоглобинов человека их триптические гидролизаты были разделены на колонке С18, уравновешенной аммонийацетатным буфе-

7.3. КАРТИРОВАНИЕ НА ПРАКТИКЕ

239

ром в градиенте ацетонитрила [1]. В каждой хроматограмме пик одного пептида был смещен относительно положения пиков фрагментов нормального гемоглобина (рис. 7.4). Фракции пептидов с необычными временами удерживания были собраны и проанализированы их аминокислотные составы и последовательности. В каждом случае был найден единственный аминокислотный остаток, отличающийся от соответствующей аминокислоты нормального гемоглобина. Время разделения составило всего 80 мин.

7.3.3.2. Ионообменная ВЭЖХ. Второй метод, весьма часто применяемый в аналитических целях — ионообменная ВЭЖХ (ИО-ВЭЖХ), где связывание пептидов с попогеппыми группами носителя происходит в результате взаимодействия зарядов. Элюирование осуществляется путем повышения ионной силы или изменения рМ подвижной фазы, иногда одновременно с увеличением содержания органических растворителей [38, 64]. Эта методика дает наилучшие результаты в случае относительно небольших молекул, хотя определенные возможности имеются и для разделения белков [57]. Ионообменная ВЭЖХ основана на ионных взаимодействиях, которые «работают» и в «открытых» колонках классической иоппообмепиой хроматографии. Образец наносится па колонку в растворе с низкой ионной силой и рН, при котором стационарная фаза и образец ионизованы, но обладают различными зарядами. Для элюирования пептидов через колонку пропускается раствор с повышающимся градиентом ионной силы или изменяющимся рН. Преимущество метода ИО-ВЭЖХ по сравнению с обычной ионообменной хроматографией заключаются в минимальном разбавлении образца во время разделения и очень чувствительных методах обнаружения. Как и в ВЭЖХ на обращенной фазе, па ионообменную колонку образец в случае необходимости может быть нанесен в большом объеме, поскольку пептиды должны связаться с носителем до начала градиентного элюирования.

7.3.3.3. Гель-проникающая ВЭЖХ. Третий метод — гель-проии-кающая ВЭЖХ — реже используется для аналитического картирования пептидов [66] главным образом из-за отсутствия колонок этого типа, пригодных для разделения сложных смесей небольших пептидов (М<5000). Однако имеются колонки, на которых можно фракционировать пептиды большего размера и белки; они применяются па стадиях очистки или обессоливания белков.

7.3.3.4. Методы обнаружения. Измерение оптической плотности флуоресцентного излучения и радиоактивности — эти методы применяются во всех видах ВЭЖХ при картировании пепти-

240

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

дов; значительно реже используют измерение коэффициента преломления и электрохимические методы [57].

Измерение оптической плотности при определенной длине волны до настоящего времени остается наиболее распространенным методом обнаружения пептидов в ВЭЖХ. Единственное условие его успешного применения — отсутствие поглощения в выбранной области у растворителя (особенно для второго, создающего градиент компонента). Система ТФУ — градиент концентрации ацетонитрила особенно удобна в этом отношении, поскольку делает возможным проведение измерения поглощения вплоть до 210 им [44]. Определение можно осуществлять одновременно при нескольких длинах воли, что позволяет селективно идентифицировать пептиды, содержащие определенные аминокислотные остатки (тирозин, триптофан). В настоящее время фирмы предлагают детекторы, с помощью которых можно получать точные профили индивидуальных пиков хроматограммы, что облегчает оценку степени гомогенности и идентичности соединений.

При наличии очень небольших количеств пептидных фрагментов проводят их модификацию о-фталевым альдегидом или флуорсскамииом для последующего измерения флуоресценции [35]. Методика основана па том, что сфокусированное УФ-излу-чение определенной длины волны возбуждает флуорогеппып реагент в проточной ячейке, а испускаемая при этом флуоресценция концентрируется линзой, расположенной под углом 90° к источнику света. Чувствительность обнаружения в этом случае повышается по сравнению с измерением поглощения на два порядка, но для модификации компонентов смеси после выхода с колонки требуется установка дополнительного насоса (разд. 8.16.3.1).

Радиоактивные пептиды идентифицируют с помощью проточных счетчиков или чаще измерением радиоактивности во фракциях с помощью подходящих гамма- или жидких сциициляциоп-ных счетчиков.

7.4. Заключение

Наиболее эффективным методом разделения пептидов в настоящее время является ВЭЖХ на обращенной фазе. Этот метод отличается экспериментальной простотой, скоростью, высокой чувствительностью (особенно для немеченых образцов) и очень хорошей разрешающей способностью. Разделенные компоненты находятся в растворе, что облегчает их дальнейший анализ — определение аминокислотного состава и последовательности.

ЛИТЕРАТУРА

241

Литература

1. Boissel J.-P., Wajctnan H., Fabrltlus IL, Cabannes R.t Dominique L.} Biochem. Biophysica Acta, 670, 203—206 (1981).

2. Bonner W. Af, Laskey R. A.} Eur. J. Biochem., 46, 83—88 (1974).

3. Bonner W. M., Stedman J. D., Anal. Biochem., 89, 247—256 (1978).

4. Bordier C, Crettol-Jarvinen Л., J. Biol. Chem., 254, 2565—2567 (1979).

5. Browne C. A., Bennett H. P. Solomon S., Anal. Biochem., 124, 201—208 (1982).

6. Bryant M. L., Nalewaik R. P,, Tibbs V. L., Todaro G. /., Anal. Biochem., 96, 84—89 (1979).

7. Burneite W. A'., Anal. Biochem., 112, 195—203 (1981).

8. Chang J.-Y., Knecht R., Ball R.} Alkan S. S., Braun D. G., Eur. J. Biochem., 127, 625—629 (1982).

9. Chen-Kiang S.t Stein S., Udenfriend 5., Anal. Biochem., 95, 122—126 (1979).

10. Christophe D., Brocas II., Vassart G., Anal. Biochem., 120, 259—261 (1982).

11. Christopher A. R., Nagpal M. L., Carroll A. R., Brown J. C, Anal. Biochem., 85, 404—412 (1978).

12 Cleveland D. W., Fischer S. G., Kirschner M. W.t Laemmli U. K., J. Biol. Chem., 252, 1102—1106 (1977).

13. Copper J. A., Reiss N. A.t Schwartz R. Hunter 7\, Nature (Lond.), 302, 218—223 (1983).

14. Diezel W.f Kopperschlager G., Hoffmann ?., Anal. Biochem., 48, 617—620 (1972).

15. Drapeau G. R., Boilq Y., Houmard /., J. Biol. Chem., 247, 6720—6726 (1972).

16. Dubraij G.t Bezard G., Anal. Biochem., 119, 325—329 (1982).

17. Eckhardt A. E., Hayes С. ?., Goldstein 1. /., Anal. Biochem., 73, 192—197 (1976).

18. Einarson В., Gullick W., Conti-Tronconi B.t Ellisman M., Lindstrom Biochemistry, 21, 5295—5302 (1982).

19. Elder У. H.t Pickett R. A., Hampton F, Lerner R. Л., J. Biol. Chem., 252, 6510—6515 (1977).

20. Feitelson M. A., Wetistein F. O., Stevens J. G., Anal. Biochem., 116, 473— 479 (1981).

21. Fishbein J. C, Place A. R., Ropson I. J.t Powers D. A,, Sofer W„ Anal. Biochem., 108, 193—201 (1980).

22. Fullmer C. S., Wasserman R. H.t J. Biol. Chem., 254, 7208—7212 (1979).

23. Eurlan M., Perret B. A., Beck E. A., Anal. Biochem., 96, 208—214 (1979).

24. Gershoni J. M.t Palade G. ?., Anal. Biochem., 124, 396—405 (1982).

25. Gershoni J. M, Palade G. ?., Anal. Biochem., 131, 1 — 15 (1983).

26. Gibson W., Virology, 62, 319—336 (1974).

27. Glass W. F., Briggs R. C, Hnilica L. S., Anal. Biochem., 115, 219—224 (1981).

28. Green M. R., Pastewka J. V., Anal. Biochem., 65, 66—72 (1975).

29. Gullick W. J., Lindstrom J. Af., Biochemistry, 21 4563—4569 (1982).

30. Gullick W. J.. Lindstrom J. M.t J. Cell. Biochem., 19, 223—230, (1982).

31. Gullick W. /., Lindstrom J. Л1, Biochemistry, 22, 3312—3320 (1983).

32. Gullick W. J., Tzartos S., Lindstrom /., Biochemistry, 20, 2173—2180 (1981).

33. Hawkes R., Anal. Biochem., 123, 143—146 (1982).

34. Houmard J., Drapeau G. R,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 3506—3509 (1972).

35. Hughes G. J., Winterhalter К. H., Wilson K. /., FEBS Letts., 108, 81—86 (1979).

36. Ingram V. Al, Nature (Lond.), 178, 792—794 (1956).

37. Ingram V. AL, Nature (Lond.), 180, 326—328 (1957).

16-703

242

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

38. Isobe Т., Takayasu 7\, Takai N., Okuyama Т., Anal. Biochem., 122, 417— 425 (1982).

39. Koch G. L., Smith M. /., Eur. J. Biochem., 128, 107—112 (1982).

40. Laemmli U. K.f Nature (Lond.). 227, 680—685 (1970).

41. Lam K. S., Kasper C. B„ Anal. Biochem., 108, 220—226 (1980).

42. Lischwe M. A., Ochs D.t Anal. Biochem., 127, 453—457 (1982).

43. Lonsdale-Eccles J. D.} Lynley A. M. Dale B. A., Biochem. J., 197, 591 — 597 (1981).

44. Mahoney W. C, Hermodson Af. J. Biol. Chem., 255, 11199—11203 (1980).

45. Markwell M. A. /0, Anal. Biochem., 125, 427—432 (1982).

46. Meek J. L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 1632—1636 (1980).

47. Merril C. R„ Switzer R. C, Van Keuren Al. L., Proc, Nail. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4335_4339 (1979).

48. Merril C. R., Dunau' M. L.t Goldman D.t Anal. Biochem., 110, 201—207 (1981).

49. Nelson N. C., Taylor 5. S.t J. Biol. Chem., 256, 3743—3750 (1981).

50. Nikodem V., Fresco F Anal. Biochem., 97, 382—386 (1979).

51. Noda M., Takahashi H.t Tanabe T.} Toyosato M., Kikyotani S., Hirose Т., Asai M., Takashima H.t Inayama S., Miyaia Т., Numa 5., Nature (Lond.), 301, 251—255 (1983).

52. Oakley B. R.t Kirsch D. R.} Morris N. R.t Anal. Biochem., 105, 361—303 (1980).

53. Parsons R. G„ Kowal R.t Anal. Biochem., 95, 568—574 (1979).

54. Salacinski P. R. P., McLean C., Sykes J. E. C., Clement-Jones V. V., Lov-rtf P. R., Anal. Biochem., 117, 136—146 (1981).

55. Schittz ?.. Schnackerz K. D., Gracy R. W., Anal. Biochem., 79, 33—41 (1977).

56. Seed В., Nucleic Acids Res., 10, 1799—1810 (1982).

57. Snyder L. R., Kirkland J. J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, Wiley, New York, 1979.

58. Sonderegger P., Jaussi R.t Gehring H., Brunschweiler K.t Christen P., Anal. Biochem., 122,298—301 (1982).

59. Stein В., Sussman H. //., J. Biol. Chem., 258, 2668—2673 (1983).

60. Stephens R. E., Anal. Biochem., 84, 116—126 (1978).

61. Stephens R. ?., Biochemistry, 20, 4716—4723 (1981).

62. Sughihara JImamura T.t Imoto Т., Yanase 7\, Biochem. Biophvs. Acta, 669, 105—108 (1981).

63. Symington J., Green Al, Bruckmann K., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 177—181 (1981).

64. Takahashi N., Isobe T.f Kasai H„ Seta K-, Okuyama Г., Anal. Biochem. 115,

181 — 187 (1981).

65. Tijssen P., Kurstak Anal. Biochem., 128, 26—35 (1983).

66. Tomono Т., Suzuki Т., Tokunaga ?., Anal. Biochem., 123, 394—401 (1982).

67. Towbin H.. Staehelin Г., Gordon Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4350— 4354 (1979).

68. Van Der Rest M., Bennett H. P. J., Solomon S., Glorieux F. //., Biochem. J., 191, 253—256 (1980).

69. Weber P., Hof L., Biochem. Biophys. Res. Comm., 65, 1298—1302 (1975).

70. Whittaker R. G., Moss В. Anal. Biochem,, 110, 56—60 (1981).

71. Wilson K. J-, Honegger A., Stotzel R. P., Hughes G. /., Biochem. J., 199, 31—41 (1981).

72. Wold F.t Ann. Rev. Biochem., 50, 783—814 (1981).

Глава 8

АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

А. ДАРБРЕ (A. DARBRE, Department of Biochemistry, King's College London, Strand, London WC2R 2LS, U.K.), с участием Дж. P. КЛАМПА (J. R. CLAMP, Department of Medicine, Medical School, University of Bristol, University Walk, Bir-tol BS8 1TD, U.K.)

8.1. Введение

В этой главе рассматриваются аналитические приемы, получившие широкое применение в химии белка (если они не обсуждаются в других разделах книги). Неискушенному читателю может показаться, что здесь дано слишком много альтернативных методов и в некоторых случаях вполне достаточно было бы привести один из них. Автор признает возможность такого рода критических замечаний, но подчеркивает, что нет такого метода» который оказался бы в одинаковой степени пригодным для всех белков, поскольку, с одной стороны, весьма различны природа исследуемых объектов и их доступность в количественном отношении; с другой — лаборатории, занимающиеся изучением белков, резко отличаются друг от друга по оснащенности реактивами, приборами и другими техническими средствами. В целях сокращения объема рассматриваемого здесь материала некоторые из методов, например изотахофорез и хроматофокусирование, не обсуждаются.

Все большее значение в химии белка приобретают проблемы загрязнения образцов посторонними примесями, поскольку чувствительность методов анализа повышается, а исследователю часто приходится иметь дело с очень малыми количествами вещества. Было показано, что источниками примесей при анализе аминокислот газожидкостной хроматографией могут быть отпечатки пальцев, грязное стекло, вода, соляная кислота, резиновые перчатки и более очевидные загрязнения — слюна, кусочки кожи, сигаретный дым [310]. Более 150 пептидов было обнаружено в одном отпечатке пальцев [242] (разд. 8.19.2.2).

Вполне вероятно, что в будущем применение высокочувствительных методов анализа аминокислот (на уровне ниже пико-мольного) потребует проводить приготовление растворов всех реагентов и буферов и все операции по разделению белков в асептических условиях. Однако требования сегодняшнего дня касаются прежде всего стекла, воды и реагентов, которые должны быть высокой степени чистоты.

16*

244

8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

8.2. Стекло

Стекло, в частности трубки, используемые для гидролиза, должно быть очищено обработкой в течение ночи горячей смесью серная кислота — азотная кислота (3:1)*, отмыто и высушено в вертикальном положении в воздушном термостате при 110°С. Не рекомендуется для очистки стекла использовать хромовую кислоту из-за возможного образования продуктов окисления, остающихся на поверхности. Перед использованием пробирок или трубок следует прокалить их в течение не

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ставрополь обучение по ремонту настенных котлов
vwti.56.0904
qaf81.3
обувь для игры в волейбол

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.01.2017)