химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

я электрофоре-тически на диазотированную бумагу, с которой они связываются ковалентно, или на нитроцеллюлозу, где осуществляется некова-леитное взаимодействие. При наличии соответствующей антисыворотки или моноклональных антител фрагменты белка могут быть обнаружены на реплике с высокой степенью чувствительности. Так, смесь гидролизатов субъединиц ацетилхолинового рецептора из трех различных видов животных удалось разделить с помощью одномерного электрофореза [29] и затем полипептиды перенести па бумагу, содержащую диазофенилтиоэфириые группировки [56, 63]. Для обнаружения фрагментов конкретной субъединицы в смеси были использованы антисыворотки и мо-ноклональные антитела, полученные к каждой индивидуальной субъединице рецептора, что значительно упростило их сравнительный анализ (рис. 7.2, а—ж). Пептидные карты оказались различными, но на карте ж с помощью моноклональных антител был обнаружен фрагмент с одинаковой подвижностью в каждом из трех треков — 4, 5 и 6. Это свидетельствовало о том, что рецепторы каждого вида обладают некоторой степенью гомологии, проявившейся в образовании фрагмента одного размера с идентичной линейной антигенной детерминантой во всех трех случаях.

Нет сомнения в том, что картирование по Кливленду в дальнейшем будет развиваться и совершенствоваться. Уже сейчас, например, становятся общедоступными эксперименты, в которых на основе содержащихся в клетке в очень малом количестве мРНК получают кДНК, клонируют ее и определяют нуклеотид-ную последовательность. Поли- и моноклональные антитела к синтетическим пептидам из выведенной последовательности используют для идентификации соответствующих белков на элект-рофореграммах.

7.3.2. Двумерное картирование пептидов

Очищенные белки подвергают гидролизу трипсином (иногда сс-химотрипсином) в растворе, в суспензии [26] или в геле [19]. При небольшом количестве исходного материала необходимо проводить предварительно радиоактивное мечение [6, 19, 20]. Немеченые пептиды могут быть обработаны после разделения флуоресцентными реагентами, причем образующиеся производные в некоторых случаях по чувствительности обнаружения не уступают радиоактивной метке [21, 55, 60, 70].

232

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

123 4 56 J 2 3 4 5 6 1 2 3 4 56 \ 2 3 456

антисывороткз к антисыворотка антисыворотка антисыворотка

а,р,7,5-су6ъедини- к а-субъедлнице кр-субъединице ку-субьединице

«зм д еж

1 2 3 4 5 G 1 2 3 4 56 1 2 3 4 5 $ антисыворотка МКАТ 155 МКАТ 124 к 5-субъединице

РИС. 7.2. Интактные субъединицы ацетилхолинового рецептора из Torpedo (I), Electrophorus (II), мышц быка (III) и их гидролизаты протеазой V8 разделены на 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН и перенесены электрофоретически на диазотированную бумагу. / — I (10 нг); 2—II (20 нг); 3—III (50 нг); 4 — гидролизат I (40 нг, 1 : 10 по массе); 5 — гидролизат II (80 нг, 1 : 10); 6 — гидролизат III (100 нг, 1:10). Обнаружение с помощью смеси равных количеств антисывороток к а,р,ч,6-субъединицам I (а), антисывороток к а,р,ч,б-субъединицам соответственно (б—д) и моноклональных антител (МКАТ) к а- и р-субъединицам (е и ж) [8]. (С разрешения Chemical Society.)

Образцы белков, предназначенные для пептидного картирования, часто находятся в больших объемах. Для их концентрирования и одновременного удаления нежелательных компонентов буферов белок осаждают обработкой 50%-ной (масс/об.) трихлороуксусной кислотой (для осаждения большинства белков достаточно 2 ч при 4°С) и отделяют центрифугированием. При работе с очень небольшими количествами радиоактивно меченных белков для «затравки» и полноты осаждения добавляют немеченный («холодный») белок-носитель (например, иммуноглобулин). Поскольку ни белок-носитель, ни протеаза не

7.3. КАРТИРОВАНИЕ НА ПРАКТИКЕ

233

содержат метки, их содержание в растворе лимитируется только объемом нанесения образца на пластинку (0,25—5 мкл). Общее содержание белка >100 мкг в пробе нежелательно, поскольку приводит к образованию размытых полос на карте и достаточно большая доля радиоактивного материала может остаться на старте.

Образец белка растворяют или суспендируют в летучем буфере (0,5 мл 50 мМ бикарбоната аммония), к которому добавляют фермент (для радиоактивных образцов 1—50 мкг, для немеченых белков в соотношении 1 : J00). Смесь оставляют на 6— 24 ч при 37 °С. Иногда для полноты гидролиза бывает необходимо добавить вторую порцию трипсина, поскольку вследствие автопротеолиза этот фермент теряет активность во времени.

Радиоактивно меченные белки в кусочках геля уравновешивают аммонийбикарбонатным буфером и проводят протеолиз, как описано выше. Согласно некоторым методикам до ферментативного гидролиза, предлагается провести стадию алкилиро-вания или окисления белка [26, 61]. Образующиеся небольшие фрагменты, более растворимые, чем исходный белок, пассивно элюируются с геля. Супернатантную жидкость концентрируют лиофилизацией, при этом удаляются летучие компоненты буфера.

Высушенную смесь коротких пептидов затем растворяют в небольшом объеме (10 мкл) электрофоретического буфера и наносят на стеклянные пластинки, покрытые слоем силикагеля или целлюлозы толщиной 0,1 — 1 мм. К сожалению, коммерчески доступные пластинки часто имеют неровное покрытие, что может быть обнаружено просматриванием пластинки па свет (темные полосы или пятна свидетельствуют о различной толщине слоя носителя). Забракованные пластинки можно использовать для предварительных проб: установления времени пробега, величины рН в электрофорезе или состава хроматографической системы растворителей. В качестве носителя могут быть использованы листы бумаги ватман 3 ММ [36, 37]. Несмотря на значительные потери пептидов в результате адсорбции, хроматография па бумаге применяется для контроля гомогенности пептидов (разд. 7.3.2.1).

Раствор образца следует наносить маленькими порциями (0,25 мкл) так, чтобы стартовая точка была как можно более компактной. Каждая порция раствора быстро высушивается с помощью фена или вентилятора. На пластинку наносят также несущие заряд окрашенные соединения, они мигрируют на определенное расстояние и служат для визуальной оценки процесса. Для электрофореза применяют буферы, содержащие пиридин, уксусную кислоту, воду, иногда бутанол [26, 60] (табл. 7.1). Для получения различных разделяющих систем можно варьиро-

234

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

Таблица 7.1. Условия двумерного разделения триптнческих пептидов на пластинках с тонким слоем силикагеля

Пластинки 200X200 мм с толщиной слоя 0,1—0,25 мм.

Первое направление: электрофорез

рН 3,5 пиридин — уксусная кислота —вода (2:20:978), 1000 В , 45 мин рН 6,5, пиридин —уксусная кислота —вода (100:3:897), 1000 В, 40 мин рН 4,7, бутанол — пиридин — уксусная кислота — вода (2:1:1:18)

Второе направление: хроматография при 25 °С

Хлороформ — метанол — аммиак (2:2:1) Пропанол — аммиак (7:3)

ГЗ\танол — пиридин — уксусная кислота — вода (97:75:15:60), рН 5,3

вать рН раствора. Удобно операции осуществлять в следующей последовательности: сначала электрофорез, а потом хроматографию; однако такой порядок не обязателен.

Электрофоретическая пластинка осторожно увлажняется соответствующим буфером так, чтобы не смазались точки нанесения образца, и включается напряжение 1000 В на 40—90 мин (для пластинки 200x200 мм). Следует указать, что этот эксперимент небезопасен и все электрические приборы время от времени должны проверять квалифицированные специалисты. По окончании электрофореза пластинку снимают и высушивают в течение ночи в вытяжном шкафу. Поскольку используемые растворители летучи, при полном высушивании не должно оставаться запаха уксусной кислоты. При сравнительном анализе нескольких образцов очень важно, чтобы электрофоретическая и хроматографическая процедуры повторялись в абсолютно одинаковых условиях.

Характер поведения пептидов в хроматографическом процессе определяется составом применяемой системы растворителей. Повышение содержания в ней органических компонентов увеличивает относительную подвижность гидрофобных пептидов, поскольку стационарная фаза гидрофильна. Широкое применение нашли несколько систем растворителей [26, 60], но для оптимизации условий разделения в конкретных случаях используются разнообразные варианты (табл. 7.1).

Для хроматографироваиия во втором направлении пластинки помещают в стеклянные камеры. Точки нанесения образцов должны быть на ~1 см выше уровня растворителя. Процесс продолжают до тех пор, пока растворитель достигнет или почти достигнет верхнего края пластинки (для пластинки размером 200x200 мм на это требуется около 5 ч). После высушивания на воздухе, если анализировались меченые образцы, проводят авторадиографию прямым путем или в случае изотопов с низ-

7.3. КАРТИРОВАНИЕ НА ПРАКТИКЕ

235

кой энергией опрыскивают хроматограмму раствором сцинтил-лятора с последующей флуорографией [3].

Детекция немеченых пептидов осуществляется различными способами [55], но чаще всего с помощью флуорескамина в ацетоне [60]; образующиеся флуоресцирующие пятна далее исследуют под УФ-светом (366 нм) (гл. 8). Может проводиться непрерывная регистрация результатов в виде авторадиографических оттисков на рентгеновской пленке или фотографирования пластинок после обработки флуоресцентным реагентом (в течение <24 ч).

Если в результате сравнения полученных карт возникают сомнения относительно гомологичпости двух белков, процедуру повторяют, нанося па одну пластинку равное количество каждого образца. После проявления хроматограммы совпадения или различия в положении пятен становятся более очевидными.

Проблемы, которые возникают при двумерном картировании, связаны с низким качеством пластинок (неравномерное покрытие), неправильным нанесением образца (избыточное количество белка или слишком малая его радиоактивность) и неоптимальными условиями проведения гидролиза белка и собственно процессов хроматографии и электрофореза. Следует иметь в виду, что хотя большинство пептидов в электрофоретическом буфере заряжены положительно, в смеси могут находиться и пептиды с отрицательным зарядом. Поэтому рекомендуется выполнить дополнительный эксперимент, для чего образец наносят по центру в нижней части пластинки и проводят электрофорез в течение 30 мин. Затем описанными приемами определяют подвижность пептидов в первом направлении и оптимальную продолжительность процесса в препаративном опыте. На рис. 7.3 приведено несколько двумерных пептидных карт для демонстрации результатов, которые могут быть достигнуты этим методом.

7.3.2.1. Контроль степени чистоты пептидов. Гомогенность пептидов может быть определена двумерным разделением на большом листе бумаги ватман 3 ММ (460X570 мм). Б первом направлении — электрофорез в системе: пиридин—уксусная кислота —вода (10:100:2800), рН 3,6, 2,2 кВ, 80 мин (могут быть использованы системы с другими рН). Во втором направлении — хроматография в системе «-бутанол— пиридин уксусная кислота — вода (150:100:30:120). Локализация пятен флуорескамином или реагентом нипгидрин-кадмий.

7.3.3. Пептидное картирование

с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Известно три варианта аналитического картирования пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): обращенио-фазовая (ОФ-ВЭЖХ), ионообменная и гель-проникающая хроматография.

236

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

а______ б

д е

РИС. 7.3. Разделение триптических пептидов актинов моллюска и кролика на пластинках с тонким слоем силикагеля G. Триптические пептиды актинов моллюска (а) и кролика (б); стрелками отмечены уникальные пептиды; электрофорез, рН 3,5; хроматография: хлороформ — метанол — аммиак (2:2:1); в и г — триптические пептиды актинов моллюска (в) и кролика (г); стрелками отмечены уникальные пептиды, стрелкой со звездочкой — различие в положении пятен; электрофорез, рН 6,5; хроматография: пропанол — аммиак (7:3). д — гидролизат актина кролика, протеолиз и картирование в присутствии ДСН; е — тот же гидролизат в обычных условиях; некоторые пятна (обведены кружком) менее интенсивны в присутствии ДСН, в то же время другие (стрелки) более отчетливы; электрофорез, рН 3,5; хроматография: пропанол — аммиак (7:3). Все образцы нанесены в количестве 1 нмоль в 2,5 мкл (табл. 7.1) [60]. (С разрешения Academic Press.)

7 3. КАРТИРОВАНИЕ ИЛ ПРАКТИКЕ

237

7.3.3.1. ВЭЖХ на обращенной фазе (ОФ-ВЭЖХ) с использованием градиентного элюирования [22, 57]. В настоящее время это наиболее широко используемый и наиболее эффективный метод разделения пептидов. Он основан на применении колонок, упакованных небольшими (3—10 мкм) пористыми частицами, поверхность которых покрыта алифатическими или фениль-иыми группами, играющими роль пеполярпой стационарной фазы. Смесь небольших пептидов, полученных в результате ферментативного [8, 22, 49] или химического [68] расщепления белка, наносится на колонку в растворителе, выбранном таким образом, чтобы все или по крайней мере большинство компонентов гидрофобно связались с поверхностью упаковки. Затем через колонку пропускают подвижную фазу —водный раствор какого-нибудь органического растворителя с повышающимся градиентом концентрации (по объему). Пептиды элюируются в чрезвычайно узких зонах, первыми сходят гидрофильные, наиболее слабо взаимодействующие с гидрофобной стационарной фазой пептиды. Метод особенно эффективен в применении к пептидам, содержащим до —50 аминокислот, и менее пригоден для разделения более крупных фрагментов.

Перед анализом ВЭЖХ па обращенной фазе белок гидро-лизуют трипсином или другим ферментом обычно в аммонийби-карбопатном буфере. Затем смесь пептидов может быть обработана специальными реагентами для повышения чувствительности обнаружения после фракционирования [8]. Недостатком пред-колоночной модификации является то, что вводимые флуоресцентные или поглощающие при определенной длине волны группы нивелируют структурные различия пептидов и таким образом снижают эффективность разделения.

В качестве стационарной фазы наиболее часто используют носители с углеводородными цепями С8 и С18, по коммерчески доступны и другие носители [57].

Решающее значение для процесса разделения имеет выбор подвижной фазы; предложено множество различных смесей растворителей и условий хроматографии для решения конкретных задач (более подробное обсуждение см. в работе [57]). Описаны попытки с помощью расчетных методов предсказывать времена удерживания пептидов для данной системы растворителей и упаковки колонки [5, 46, 71], но, как правило, в общем случае для установления степени сходства исследуемых образцов бывает достаточно качественного сравнения кривых элюирования.

В практике очень широко используют несколько систем растворителей. Так для уравновешивания колонки служит 0,1%-ный (об./об.) (0,013 М) водный раствор трифтороуксусной кислоты (ТФУ) [44]. После введения пептидной смеси для контроля связывания всех или большинства компонентов смеси пропускают

238

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

Т5 т2

РИС. 7.4. Разделение пептидов трпп-тических гидролизачов (0,8 мг] р-це-пей гемоглобинов человека методом ВЭЖХ на обращенной фазе: а — нормальный

страница 34
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
прикроватные тумбочки стекло
картинка нельзя пользоваться телефоном
stone sour заказ билетов
насос тре 40/230/2 grundfos цена

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.07.2017)