химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ептиды небольшой молекулярной массы. Далее они разделяются в растворе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе (ОФ-ВЭЖХ) или на ионообменнике (ИО-ВЭЖХ). В первом случае применяют колонки, упакованные смолой на основе силикагеля с «пришитыми» к нему углеводородными цепями различной длины, во втором носителем служит также силика-гель, на поверхности которого расположены способные к ионизации группы. Разделение пептидов происходит вследствие различий во времени их удерживания на колонках. Главные преимущества метода заключаются в высокой скорости процесса (время разделения одного гидролизата может составлять <30 мин), чувствительности и получении пептидов в форме, удобной для проведения дальнейшего анализа (определение аминокислотного состава и последовательности). Для определения содержания пептидов измеряется оптическая плотность элюата на одной или нескольких длинах волн, а при работе с радиоактивно меченными препаратами регистрируют радиоактивность (в потоке или в дискретных пробах). Для повышения чувствительности обнаружения в пептиды может быть введена флуоресцентная метка.

7.2. ТИПЫ АНАЛИЗИРУЕМЫХ СТРУКТУР

225

7.2. Пептидное картирование — типы анализируемых структур

Ниже описаны наиболее вероятные ситуации, с которыми приходится встречаться при сравнительном анализе методом картирования двух белков.

1) Идентичные структуры: аминокислотные последовательности и посттраисляционные модификации (если они есть) полностью гомологичны.

2) Аминокислотные последовательности гомологичны, но имеются различия в модификации боковых цепей или концевых остатков (ацетилирование, гликозилирование, фосфорилирова-пие и т. д.). См. обзор по модификации белков [72].

3) Аминокислотные последовательности одинаковы, но один белок короче другого с N- или С-конца или с обоих концов.

4) Часть последовательности в обоих белках полностью совпадает, но есть полные или частичные различия в другой части.

5) Значительные участки последовательности гомологичны, по по цепи нерегулярно расположены вставки или делеции.

6) Полное несовпадение структур.

Естественно могут быть различные варианты этих основных типов.

Простейшими из всех рассмотренных ситуаций являются первая и последняя, где получаются соответственно полностью идентичные или абсолютно несовпадающие карты. Следует отметить, что сравнительный анализ тем более достоверен, чем больше компонентов содержит исследуемый образец, поскольку он дает больше информации для исследования.

Белки, имеющие гомологичные аминокислотные последовательности, но различающиеся посттрансляциониыми изменениями (тип 2), дают сходные карты, исключение составляют лишь те фрагменты, подвижность которых изменена вследствие соответствующей модификации. Аналогичная картина (совпадение части хроматограммы) наблюдается и в ситуации 4. Обнаружить любые различия в структуре с помощью одномерного электрофореза в гелях, где анализируются крупные полипептиды менее вероятно, чем с помощью пептидных карт, поскольку при небольшой молекулярной массе изменения гидрофобности или заряда сказываются на поведении пептида в значительно большей степени.

Если один из двух белков является частью другого (тип 3), то пептидная карта укороченного образца будет отличаться отсутствием лишь одного или нескольких фрагментов. Кроме того, один фрагмент в каждой из карт не будет общим, а именно тот, который примыкает к точке расщепления или образуется в результате него. В случае если белок укорочен по сравнению с

15-703

226

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

другим как с N-, так и с С-конца, таких несовпадающих фрагментов будет по два в каждой карте.

Вероятно, наиболее сложная ситуация возникает при сравнении пептидных карт белков, имеющих сходные аминокислотные последовательности, по содержащих нерегулярные замещения, вставки или делецин (тип 5), как результат изменений в процессе дупликации гена. Естественно, пептидные карты двух таких молекул будут иметь тем больше сходства, чем меньше произошло такого рода изменений. Однако даже значительная гомология этого типа не всегда очевидна. Так, аминокислотные последовательности субъедипиц ацетилхолинового рецептора обнаруживают — 40% гомологии [51] и дают различные пептидные карты [32] (рис. 7.1). Следует иметь в виду, что в таких случаях возможности метода ограниченны и необходима тщательная интерпретация результатов во избежание возможных ошибок.

7.3. Картирование пептидов на практике

7.3.1. Картирование по Кливленду

Искомый белок (меченый или без метки) может быть выделен из смеси с помощью традиционных биохимических методов (осаждение сульфатом аммония, хроматография па открытых колонках) или более современных подходов (например, имму-нопреципитация [13] и аффинная хроматография [18, 29]). Однако часто очистка белка до гомогенного состояния этими методами бывает затруднена и на завершающей стадии используют систему с наиболее высокой разрешающей способностью — электрофорез в ПААГ — ДСП. В первоначальном варианте методики Кливленда [12] применялось слабое окрашивание белка в геле кумасси голубым [14] и затем быстрое обесцвечивание и вырезание соответствующей полосы мокрого геля.

В случае радиоактивно меченных белков гель извлекают из прибора для электрофореза, промывают его ~ 20 объемами дистиллированной воды для удаления компонентов буфера и затем высушивают без предварительной фиксации (если гель фиксировался в уксусной кислоте или метаноле, то элюирование иитактного белка с регидратироваииого геля часто бывает затруднено). Высушенный гель затем подвергают радиоавтографии и вырезают нужную полосу белка, используя рентгеновскую пленку в качестве подложки.

Второй ДСН-гель готовят с такой концентрацией акрилами-да, в которой подвижность исследуемого белка составляет —0,2 относительно положения фронта красителя (бромофенолового синего) (рис. 7.1). Применяются также гели, приготовленные с градиентом концентрации акриламида; они особенно полезны в

7.3. КАРТИРОВАНИЕ ПА ПРАКТИКЕ

227

Молекулярная масса -

•кГ3

40 Г

30

If-

ill

20

10

* it

40 г 30

20

/234 5 6 7 8 9 Ю It 1213 14/5 /?/7 /8 /5202/

IV: Л.

t

-4 t

10

/ 2 3 4 5 G 7 8 9 Ю 1П2 13 14 15 16 17 ?в 19 2021

РИС. 7.1. Картирование на ПААГ в присутствии ДСН субъединиц ацетилхо-линового рецептора, а — гидролиз протеазой V8: 1—4 — 5 мкг а-, р-, f- и 6-субъединиц, 5 — белки-маркеры; 6—9 — а, 10—13 — р, 14—17 — 7 и 18— 21—6-субъединицы, гидролизованные протеазой V8 в количестве 0,0005, 0,005, 0,05 и 0,25 мкг соответственно; б — гидролиз папаином: 1—4—5 мкг а-, р-, ^ и б-субъединиц, 5 — белки-маркеры, 6—9 — а-, 10—13 — р-, 14—17 — f-и 18—21—б-субъединицы, гидролизованные папаином в количестве 0,0001 0.001, 0,01 и 0,1 мкг соответственно. Стрелки указывают на полосы, обработанные реагентом Шиффа для обнаружения углеводов [32]. (С разрешения American Chemical Society.)

15*

228

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

тех случаях, когда трудно предсказать размер образующихся фрагментов. Концентрирующий гель должен иметь сравнительно низкое содержание акриламида, чтобы не ограничивалась подвижность интактного белка или протеолитического фермента (если он используется), и достаточную длину для того, чтобы образец образовал компактную полосу до достижения разрешающего геля. Ячейки должны быть настолько широкими и глубокими, чтобы вместить куски регидратированпого геля с белком и раствор фермента и обеспечить их свободный контакт.

Выбор способа расщепления зависит от природы белка-субстрата и осуществляется экспериментатором па основании своего опыта. Широко применяются протеолитическис ферменты и среди них можно отметить протсазу V8, выделенную из фильтрата культуры Staphylococcus aureus [15]. Этот фермент расщепляет пептидную цепь по С-концу остатков глутаминовоп и аспарагиновой кислот, по в соответствующем буфере гидролиз протекает только по остаткам глутаминовоп кислоты [34]. В обычных буферных растворах ступенчатого гель-электрофореза по Лсммли [40] протеаза V8 расщепляет связи, образованные обеими дикарбоиовыми аминокислотами. Поскольку гидролиз осуществляется в концентрирующем геле, соответствующий фермент должен сохранять активность в 0,1%-ном (масс./об) растворе ДСН, а желательно и при более высокой концентрации детергента. В этих условиях активны и могут быть использованы протеаза V8 [4, 30], папаин [32], эластаза, а-химотрипсин [29], трипсин [4].

Если белок-субстрат находится в растворенном состоянии, то фермент добавляют к нему непосредственно и инкубируют смесь в течение определенного времени до нужной степени расщепления. Затем гидролизат переносят в гель и разделяют обычным путем [30, 31]. При этом пет необходимости инактивировать протеазу, поскольку она будет отделена от субстрата в разделяющем геле. Обычно после завершения гидролиза добавляют восстанавливающий агент и образец нагревают в течение 2— 5 мин при 100 °С. Эта процедура способствует образованию более четких полос при электрофорезе и одновременно инактиви-рует фермент.

Чаще белок гидролизуют в зоне полиакриламида: раствор фермента (оптимально —10 мкл) помещают в соответствующую лунку, которая уже содержит электродный буфер. Раствор фермента по составу должен быть аналогичным тому, в котором находится концентрирующий гель, но иметь несколько большую плотность, для чего добавляют 10—20% глицерина или сахарозы. Кусочек геля, содержащий белок-субстрат, осторожно опускают в лупку над раствором протеазы так, чтобы не нарушить компактность слоя. Полезно для приготовления второго

7.3. КАРТИРОВАНИЕ НА ПРАКТИКЕ

229

геля использовать более широкие спейсеры, чем для первого, но обычно несложно поместить кусочки геля в лунку пластины геля того же размера, при этом желательно достичь плотного прилегания, чтобы избежать возможности падения кусочка геля в раствор фермента и его разбрызгивания. Расположение геля с субстратом, как на «подушке» более плотного раствора фермента, способствует более эффективному гидролизу, поскольку при этом достигается равномерное распределение протеазы по всей поверхности трека.

При подаче напряжения белок-субстрат из геля и протеаза концентрируются, образуя узкие, прилегающие друг к другу зоны; после этого ток выключают (обычно на 30—60 мин) для прохождения ферментативного гидролиза. Активная нативная протеаза расщепляет некоторые из наиболее «чувствительных» связей денатурированного развернутого субстрата. Затем вновь подают напряжение и образовавшиеся фрагменты разделяются в разрешающем геле.

Для обнаружения пептидов па электрофореграмме в ПААГ — ДСН применяют несколько методов. В белок может быть предварительно введена радиоактивная метка (с использованием клеточного метаболизма или in vitro), в этом случае разделенные фрагменты детектируют методом авторадиографии или флуорографии [2]. Специфическая идентификация достигается при использовании аффинной метки (такой, как природный лиганд и его синтетические аналоги) [29] или с помощью ферментов, в частности киназ, способных вводить радиоактивные группы (при условии, что они играют роль субстратов). В более общем случае включение метки осуществляется иодированием доступных остатков тирозина [11, 53, 54, 45]j и метаболически в культуре ткани [13] или органа [59] в среде, содержащей одну или несколько меченных аминокислот. При специфическом мечении радиоактивность вводится только в некоторые пептидные фрагменты; метод может быть очень информативным при исследовании локальной гомологии, такой, как, например, окружение лигандсвязывающего центра [29] или участков фосфо-рилирования.

Для окрашивания гелей применяют также реагенты общего типа — кумасси голубой [14], комплексы серебра [47, 48, 52] или более специфичные, например для идентификации гликопеп-тидов [17, 28, 69] — реагент Шиффа [32], модифицированный вариант окрашивания комплексами серебра [16], лектины, содержащие радиоактивную [39] или флуоресцентную метку [23] (см. также гл. 8).

Полипептиды могут быть перенесены с геля на нитроцеллю-лозные пластинки [7, 25, 67], положительно заряженные мембраны [24], диазотированную бумагу [10, 56] и обнаружены по

230

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

специфическому связыванию с меченными антителами [29] или лектинами [27, 33], С помощью антисыворотки можно идентифицировать все фрагменты белка, а моноклональные антитела или лектины специфически связываются с одним или некоторым ограниченным числом фрагментов. Поскольку посредством антител можно обнаружить индивидуальный белок в смеси, эта методика позволяет провести сравнение двух белков, один из которых не был ранее выделен в очищенном состоянии. По Кливленду картируют обычно пептиды относительно больших размеров, и применение иммунных методов для их обнаружения целесообразно, поскольку высока вероятность содержания в нихне-расщепленных линейных антигенных детерминант.

Для получения оптимального набора фрагментов белка с помощью протеолиза (по величине составляющих компонентов) испытывают различные нагрузки фермента при фиксированном количестве субстрата [12] (рис. 7.1). При отсутствии данных о чувствительности к протеолизу исследуемого белка (она может варьировать в широких пределах) начинают с нагрузки фермента 1 мкг на лунку геля. Затем уменьшают или соответственно увеличивают ее в 10 раз, если позволяет имеющееся в распоряжении количества белка. На основании полученных результатов выбирают оптимальные условия эксперимента.

Могут быть использованы также химические методы расщепления полипептидной цепи: обработка бромоцианом (по остаткам метионина) [9, 43, 50], муравьиной кислотой (по связям аспарагиновая кислота — пролин) [41, 58] или N-хлоросук-цииимидом (по остаткам триптофана) [42]. В этих случаях кусочек геля с белком обрабатывается в пробирке реагентом, а затем образовавшаяся смесь фрагментов наносится для разделения на второй гель. Преимущество химических методов очевидно, когда исследуется небольшое количество немеченного белка и необходимо для проявления применять высокочувствительное окрашивание серебром, которому не мешает присутствие протеаз.

Опубликовано множество вариантов картирования пептидов в гелях. С помощью электрофореза в первичном геле можно разделить несколько белков, после чего из геля вырезают полоску, накладывают ее на другой гель, проводят ферментативный гидролиз, как описано выше, и вторично разделяют электрофо-ретически образовавшиеся фрагменты.

Таким образом, с небольшой затратой усилий могут быть получены пептидные карты нескольких белков, находящихся в смеси (при условии, что они обладают разными относительными подвижностями в первичном геле) [4, 41, 65]. Осложнения, возникающие при использовании этой методики, связаны с тем, что концентрация компонентов в исходной смеси может быть раз-

7.3. КАРТИРОВАНИЕ НА ПРАКТИКЕ

231

личной, а гидролиз проводится с одной нагрузкой фермента. Это может привести к неодинаковой степени расщепления белков и ошибочным выводам при анализе электрофореграммы.

В случае если белок доступен лишь в очень малых количествах, его фрагменты могут быть перенесены с гел

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
подъемный механизм для кровати 200х200
В магазине KNS digital solutions 90PT01G1-M01080 - корпоративные поставки по всей России.
lion sabatier international сковорода цена
сетка арматурная кладочная

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.06.2017)