химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

о свойств. Для проведения многих видов биоиспытаний необходимо удалить органические растворители. Обычно это делают испарением в токе азота. Следует следить за тем, чтобы присутствующие соли и рН раствора не влияли на проведение испытаний.

6.4.2. Выделение пептидов с использованием фосфорной кислоты

Для контроля хода ферментативного расщепления кальцитонинсвязывающего белка использовали ВЭЖХ [15]. Гидролизат наносили на колонку без предварительной обработки. Фракционирование пептидов проводили в 0,1%-ной фосфорной кислоте (рН 2,2) в градиенте концентрации ацетонитрила. В ходе препаративного выделения пептидов регистрировали оптическое поглощение элюата при 210, 254, 280 нм. Фосфорная кислота, остающаяся после лиофи-лизации фракций, не мешала проведению аминокислотного анализа, определению N-концевых аминокислот при помощи дансилхлорида, автоматическому определению аминокислотной последовательности. Ферментативный гидролизат разделяли без предварительной обработки.

6.4.3. Разделение пептидов с использованием трифтороуксусной и гептафторомасляной кислот

ТФУ и ГФМК используются в анализе аминокислотной последовательности по Эдману и доступны в высокоочищенном состоянии. Буферы на основе этих кислот летучи и прозрачны при 215 нм. Описано применение ТФУ и ГФМК для разделения пептидов [1, 30]. Эти кислоты идеальны как растворители для выделения пептидов; типичным примером служит фракционирование триптического гндролнзата цитохрома с на колонке с сорбентом Vydac С18 в градиенте концентрации ацетонитрила (рис. 6.10).

6.4.4. Корреляция между удерживанием и структурой

Существует определенная взаимозависимость между гидрофоб-ностью пептидов и их удерживанием на ОФ-носителе. По результатам хроматографии ряда пептидов рассчитывались их коэффициенты гидрофобности с учетом коэффициентов распределения пептидов в системе октанол — вода [15]. Обнаружена зависимость между суммой коэффициентов гидрофобностей отдельных аминокислот и временем удерживания пептидов. Однако следует отметить, что в опубликованных данных имеются значительные противоречия.

Для снижения влияния конформационных эффектов и улучшения формы пика использовали хаотропный агент (0,1 М перхлорат натрия с добавкой 5 мМ фосфата натрия или 0,1% фосфорной кислоты для получения раствора с рН 7,4 или 2,1) и

218

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Li

UJulV

0,00

10,00

20,01

Время, мин

РИС. 6.10. Разделение триптических пептидов цитохрома с ОФ-ВЭЖХ. Гидро-лизат фракционировали на колонке Vydac RP (С 18) (4,6x75 мм) в 0,08%-ной ТФУ с градиентом концентрации ацетонитрила 1—40%. Поглощение элюата записывали при помощи детектора с диодной линейкой (Hewlett Packard 1040). а и б—определение оптического поглощения при 215 (а) 280 нм (б); в — результаты сканирования фракций, не содержащих ароматических аминокислот (/), содержащих Туг (2), Тгр (3) и гем (4). По результатам сканирования отбирали отдельные пептиды для последующего анализа.

градиент концентрации ацетонитрила [12]. При этом получено хорошее соответствие между изменением коэффициентов удерживания и временем элюирования выделяемых пептидов. Проводилось детальное исследование теории равновесного распределения [5, 11]; в ходе этой работы показана возможность разумного предсказания последовательности элюирования пептидов с использованием суммы коэффициентов гидрофобности боковых цепей аминокислот. Многочисленные убедительные примеры использования ОФ-ВЭЖХ для препаративного и аналитического

РИС, 6.10. в

to

3

220

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

фракционирования пептидов показали несомненную ценность-этого метода.

Особенно привлекательно для анализа пептидов использование многоволнового детектирования для оценки чистоты или селективного выделения отдельных пептидов. В настоящее время несколько фирм производят оптические сканперы, снабженные компьютерами, записывающими базовую линию, наклон и уровень сигнала при сканировании пика (рис. 6.10). В некоторых случаях полезно использовать отношения поглощения на разных длинах волн.

6.5. Скоростная жидкостная хроматография белков

Скоростная жидкостная хроматография белков (СЖХБ) получила широкое применение при исследовании биополимеров; рассмотрим основные достоинства этого метода [20].

Фирма Pharmacia разработала колонку с частицами размером 9,8 (±2%) мкм, устойчивыми в области 2<рН<12. Сорбент доступен в форме катионита и аниопита, а также в виде носителя с поверхностью, модифицированной для проведения хроматофокусирования (колонки Mono Q, Mono S и Mono Р). Эти сорбенты обладают высокой емкостью, позволяют работать при больших скоростях потока (до 1 мл/мин), при умеренных давлениях (10—20 бар), создаваемых плунжерными насосами. Благодаря низким давлениям можно использовать стеклянные колонки. Химическая устойчивость носителей дает возможность применять широкий набор буферов, включая детергенты, хао-тропиые агенты (например, Gu-HCl). Фирма Pharmacia разработала ряд буферов, с помощью которых можно добиться оптимального разделения в определенных диапазонах рН, без изменений рН, присущих обычной ионообменной хроматографии. Время разделения чрезвычайно мало (1—5 мин), потому что степень разделения зависит от времени разделения значительно меньше, чем в других ионообменных процессах. Данные о элюи-ровании белков, полученные на обычных ионообмеиииках, можно переносить на эксперименты СЖХБ, и обычно это приводит к улучшению разделения. При отсутствии информации о свойствах белковой смеси, подлежащей фракционированию, проводят оптимизацию условий разделения, ставя несколько экспериментов по СЖХБ с использованием разных буферов; результаты этих экспериментов представляют в виде кривых элюирования. В периодических изданиях фирмы Pharmacia описаны широкие возможности потенциального применения колонок этой фирмы, предназначенных для СЖХБ. Принципиально возможно (но не рекомендуется самой фирмой) использовать эти колонки на обычных хроматографах, снабженных соответствующими со-

6.6. ИОННЫЙ ОБМЕН

221

единениями и клапанами сброса давления, превышающего заданную величину. Последнее устройство необходимо для защиты стеклянных колонок от разрушения под действием больших давлений.

При работе па таких колонках в присутствии хлорид-ионов при экстремальных рН не следует использовать насосы, изготовленные из нержавеющей стали.

Хроматофокусированис с применением колонок MonoQ — это новый метод, который характеризуется высоким разрешением; он может оказать большое влияние на разработку схем разделения смесей белков. Большим достоинством метода является возможность использовать различия в заряженности белков при рН, близких к р/ этих же белков. Детальное описание принципиальных основ разделения по этому методу можно найти в литературе фирмы Pharmacia.

6.6. Ионный обмен

Разработка ионообменных носителей, пригодных для ВЭЖХ, началась с работ отдельных исследователей и фирм, главным образом фирмы Pharmacia [17, 18].

В настоящее время известно четыре типа носителей:

1. Гликофазы — стеклянные частицы, с пленкой эпоксиполи-мера на поверхности, ковалентно связанного с силанольными группами стекла глицерилпропильными связями. Поставляются в виде диэтиламиноэтильных, карбоксиметильных и сульфопро-пильиых производных, а также в виде четвертичных аммониевых производных под названием CPG-гликофазы.

2. Пеяликулярные сорбенты содержат в боковых цепях остатки ДЭАЭ. Поставляются фирмами в виде колонок Synchro-pak (Synchrom Incorp.).

3. Ионообменные сорбенты фирмы Toyo Soda (Япония) представляют собой носители для гель-хроматографии, модифицированные для проведения ионообменных процессов.

4. Носители для СЖХБ (Pharmacia, Швеция).

Эти иоиообмепники можно использовать для проведения быстрых разделений, по назначению сходных с теми, которые проводятся па обычных мягких гелях. Носители для СЖХБ применяли для разделения сложных смесей [17].

Детально испытывались аниопообменные колонки, в частности Synchropak АХ-300. При нагрузке 10 мг белка на колонку размером 4,1 x250 мм при скорости потока 0,5 мл/мин и градиенте концентрации ацетата натрия (0—0,5 моль/л) в трис-буфе-ре (рН 8) в течение 90 мин выход различных ферментов составлял 90—100% [29].

Несомненно, в ближайшие годы будут продолжаться интенсивные исследования свойств сорбентов такого типа и можно

222

G, РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

ожидать, что быстрые ионообменные разделения станут общепринятыми. В настоящее время метод СЖХБ предпочтителен для высокоэффективного ионообменного разделения фракций, полученных при помощи ВЭЖХ.

Литература

1. Bennett Н. P. J., Browne С. A. Solomon S., J. Liquid Chromatogr., 3, 1353— 1365 (1980).

2. Bohlen P., Stein S.t Stone J., Udenfricnd S., Anal. Biochem, 67, 438—445 (1975).

3. Fullmer C. S., Wasserman R. Ft., J. Biol. Chem., 254, 7208—7212 (1979).

4. Hearn M. T. W., Advances in Chromatogr., 20, 1—82 (1982).

5. Hearn M. T. W., Grego В., J. Chromatogr., 218, 497—507 (1981).

6. Jenik R. A., Porter J. Anal. Biochem., Ill, 184—188 (1981).

7. Kato Y., Komiya K., Sasaki Hashimoto T. J. Chromatogr., 190, 297— 303 (1980).

8. Kato Y., Komiya K., Sasaki H., Hashimoto Т., J. Chromatogr., 193, 29—36 (1980).

9. Kato Y., Komit/a K., Sasaki H., Hashimoto T.f J. Chromatogr, 193, 458— 463 (1980).

10. Mann K. G., Fish W. W., Methods Enzymol., 26, 28—42 (1972).

11. Meek L F,y Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 1632—1636 (1980).

12. Meek J. L., Rosetti Z. L.y J. Chromatogr., 211, 15—28 (1981).

13. Nice E. С., O'Hare M. Л, J. Chromatogr., 162, 401—407 (1979).

14. Nice E. С., Capp Af., O'Hare M. /., J. Chromatogr., 185, 413—427 (1979).

15. O'Hare Af. F, Nice E. C, J. Chromatogr., 171, 209—226 (1979).

16. Pearson J. D., Mahoney W. C., Hermodson M. A., Regnier F. J. Chromatogr., 207, 325—332 (1981).

17. Regnier F. Anal. Biochem., 126, 1—7 (1982).

18. Regnier F. Methods Enzymol., 91, 137—190 (1983).

19. Regnier F. E., Gooding K. M.% Anal. Biochem., 103, 1—25 (1980).

20. Richey /., Technical Review Series, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden (1982).

21. Rivier J. J. Liquid Chromatogr., 1, 343—366 (1978).

22. Rivier F E.t Spiess F, Perrin M.r Vale W., In Biological/Biomcdical Applications of Liquid Chromatography, Hawk G. L. (Ed.), Chromatographic Science Series, vol. 12, Marcel Dekker, New York, Basel, pp. 223—241 (1979).

23. Rubinstein M.y Anal. Biochem., 98, 1—7 (1979).

24. Rubinstein M.t Stein S.t Gerber L. D., Udenfriend S Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 74, 3052—3055 (1977).

25. Rubinstein M., Stein S., Udenfriend S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 4969—4972 (1977).

26. Rubinstein M.f Rubinstein S., Famitletti P, C.f Miller R. S., Waldman A. A.. Pestka S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 640—644 (1979).

27. Schmidt D. E. Jr., Giese R. W., Conron D., Karger B. L., Anal Chem 52, 177—182 (1980).

28. Vi JV., Anal. Biochem., 97, 65—71 (1979).

29. Vanecek G., Regnier F. Anal. Biochem., 109, 345—353 (1980).

30. Van der Rest M., Bennett H. P. J., Solomon S., Glorieux F. Biochem. J., 191, 253—256 (1980).

31. Waterfield M. D., Scrace G. 7\, In Biological/Biomedical Applications of Liquid Chromatography, Hawk G. L. (Ed.), Chromatographic Science Series, vol. 18, Marcel Dekker, New York, Basel, pp. 135—158 (1981).

32. Yau W. W.. Kirkland J. J., Ely D. D., In Modern Size-Exclusion Chromatography, Wiley, New York, p. 27 (1979).

Глава 7

ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

У. Дж. ГУЛЛИК (W. J. GULLICK, Protein Chemistry Laboratory, Imperial Cancer Research Fund. Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PX, U.K.)

7.1. Введение

Получение пептидных карт обычно преследует две цели: выяснение структурного сходства молекул белков, выделенных из разных источников, и идентификация изменений в структуре индивидуального белка, возникших в результате нормального или патологического метаболизма. В первом случае это:

1) Сравнение белков с одной и той же функцией, полученных из различных тканей или организмов.

2) Сравнение продуктов трансляции in vitro с эквивалентными им соединения ми, выделенными из клеток.

3) Сравнение субъединиц сложных белков.

Изучаемые с помощью картирования индивидуальные белки в свою очередь можно разделить па две группы: белки, превращающиеся в зрелые клеточные формы по посттрансляционным механизмам (ограниченный протеолиз, гликозилирование, присоединение простетических групп), и белки, претерпевающие обратимые структурные изменения (такие, как фосфорилирование или ацетилироваиие), которые могут влиять на их активность.

Пептидное картирование основано на сравнении физико-химических характеристик отдельных пептидов или их смесей, полученных в результате фрагментации белковой молекулы. Для фрагментации может быть использован любой, приводящий к воспроизводимым результатам метод — расщепление пептид-пых связей протсолитическими ферментами или химическими реагентами. Эффективность пептидного картирования в каждом конкретном случае определяется выбором оптимальных условий разделения и обнаружения смеси фрагментов и достоверной интерпретацией результатов.

Ниже описываются три общепринятых метода разделения пептидов. Первый из них ПААГ — ДСН-элсктрофорез в поли-акриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), обычно в одномерном варианте. Разрешение пептидных фрагментов достигается благодаря различиям в их относительных подвижностях, не всегда отражающих истинные молекулярные массы. Очень важно, что элсктрофореграмму фрагментов одного белка можно сравнивать с электрофореграм-

224

7. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

мои пептидов, полученных из другого белка. Этот метод известен как картирование по Кливленду (по имени первого автора статьи, где он был описан) [12]. В ПААГ в присутствии ДСН могут быть разделены полипептиды с диапазоном молекулярных масс от 103 до 106, но наиболее достоверные результаты получаются при анализе белков с истинными молекулярными массами от 104 до 106, поэтому для белков с молекулярной массой <С104 метод обычно не применяется.

Второй метод — двумерное картирование, известное как метод «отпечатков пальцев», (finger printing), он был предложен Ингремом [36, 37] для локализации и последующей идентификации единственного аминокислотного остатка, отличающего полипептидные цепи нормального и серповидноклеточного гемогло-бинов. Белок обычно гидролизуют трипсином или а-химотрипси-ном (Ингрем проводил гидролиз 12 М НС1 при 37 °С в течение 2—3 дней), при этом образуется смесь неперекрывающих друг друга коротких (10—20 аминокислот) пептидов. Эта смесь далее разделяется с помощью электрофореза в первом направлении и жидкостной хроматографии — во втором. Пептидные карты— более эффективный способ картирования, чем электрофорез в гелях, поскольку анализируется большое число компонент, образующих определенный набор пятен (рисунок), характерный для каждого индивидуального белка.

В третьем методе, разработанном для картирования пептидов, так же как и в предыдущем, первоначально проводится фрагментация белка на п

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
http://help-holodilnik.ru/info/Remont_xolodilnikov_v_Krasnoznamenske
сколько стоит оформление точки у палыча
купить билет концерт в екатеринбурге сентябрь
рамка для плазменного телевизора

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.08.2017)