химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ых для структурных исследований. Сообщалось об использовании кислых буферов, содержащих добавки солей, для очистки полипептидных гормонов, а также о применении мини-колонок для концентри-

1-1-703

210

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

рования образцов [14]. Большие пептиды (М <10000) фракционировали в буфере на основе ТФУ, а при разделении бромоци-ановых фрагментов коллагена, (М 3000—60 800) использовали буфер, содержащий гептафторомасляную кислоту (ГФМК) [1]. Для подготовки образца к разделению его концентрируют путем адсорбции в верхней части колонки Vydac С18 [30], причем ГФМК предпочтительнее, чем ТФУ и фосфорная кислоты; показано также преимущество широкопористых носителей (поры 30 нм) перед сорбентами с малым размером пор (6—10 нм). Большой размер пор позволяет молекулам с большой молекулярной массой проникать внутрь частиц сорбента.

В качестве примера оптимизации условий ВЭЖХ больших фрагментов белков можно привести разделение бромоциановых пептидов фетального гемоглобина человека. В ходе исследования изучалось влияние формы частиц носителя, размера пор, природы неподвижной фазы на эффективность разделения [16]. Было показано, что применение буферов на основе ТФУ и я-про-панола в случае сорбентов с размерами пор 30 или 100 нм увеличивает выход пептидов в 1,7—2 раза по сравнению с выходами, полученными для сорбентов с порами 10 нм [16]. Высказано предположение, что на результаты разделения влияет и геометрическая форма частиц сорбента, так как для разных сорбентов одной фирмы (Lichrosphere и Lichrosorb), имеющих поры одного размера (10 нм), получены разные выходы больших пептидов.

К сожалению, испытания по указанным параметрам проводили для очень узкого набора колонок, что затрудняет интерпретацию результатов исследования. Можно предположить, что увеличение размера пор облегчает доступ молекул полипептида во внутренние каналы частиц, и, по-видимому, это подтверждается в работах, посвященных данному вопросу. По мере накопления экспериментальных данных складывается впечатление, что главным фактором, влияющим на ВЭЖХ полипептидов на широкопористых носителях, является площадь доступной поверхности, а не размер пор частиц. При уменьшении размера колонки до 50 мм сохраняется ее разрешающая способность, что свидетельствует об участии адсорбции в процессе разделения полипептидов. Опубликована работа по выбору условий ОФ и нормально-фазовой (НФ) ВЭЖХ применительно к полипептидам и белкам [23]. Для очистки [5-липотропина [24], р-эндорфи-на [25] использовали Lichrosorb RP-18, а для очистки лейкоцитарного интерферона — Lichrosorb RP-8 в сочетании с Lichrosorb DIOL [23]. Средний размер пор двух последних сорбентов составляет 10 нм. В качестве органического модификатора был выбран я-пропанол.

В некоторых работах (включая очистку интерферона) при-

6.3. АДСОРБЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

меняли двухстадийное фракционирование в разных буферах (рН 4 и 7,5). Ионные взаимодействия, выявленные в случае носителя RP-8, подавляли формиатом пиридиния или ацетатом аммония. Так как при использовании этих буферов невозможно регистрировать изменение поглощения элюата при 215 нм, то применяли автоматизированные послеколоночные методы флуоресцентного детектирования [2]. Результаты разделения на RP-8 приведены на рис. 6.8. Образец наносили на колонку RP-8 (4,6x250 мм, размер зерна сорбента 10 мкм) в 62,5 мл 4 М раствора мочевины, содержащего 0,1 М ацетат натрия (рН 7,5). Колонку промывали 1 М ацетатом натрия (рН 7,5). Пептиды элюировали в градиенте концентрации я-пропанола (1 ч, 0— 20%; 3 ч, 20—40%) при скорости потока 0,25 мл/мин. Элюат контролировали на присутствие интерферона, нужные фракции объединяли (рис. 6.8,а).

Таким образом, нанося па колонку образец в большом объеме буфера, содержащего мочевину и ацетат, можно значительно ускорить процесс концентрирования и разделения образцов благодаря адсорбции полипептидов на ОФ-сорбеитах. Пептиды отделяют от мочевины на патронах Sep-Pak [31] или на мипи-колонках [14]; Sep-Pak использовали и для концентрирования образца перед ВЭЖХ [1].

Иногда ОФ-колопки применяют для проведения нормально-фазовой (НФ) хроматографии [23]. При последующем элюирования в ОФ-режиме с колонки RP-8 выделены фракции, содержащие интерферон. К объединенным фракциям добавляли я-пропанол (до концентрации 80%), раствор наносили на колонку Lichrosorb DIOL. Понижая концентрацию я-пропанола во время разделения, получили очищенный интерферон (рис. 6.8, б). Для полной очистки образца его пропустили еще через две ОФ-колопки (рис. 6.8, в и г). НФ-хроматография особенно полезна при очистке гидрофобных белков, растворимых в системах с высоким содержанием органических растворителей. В таких системах вместе с гидрофобными белками могут соосаждаться многие другие белки, однако последние можно отделить ОФ-хроматографией, что позволяет получить гидрофобные объекты в растворенном состоянии [23]. Ранее уже обсуждалось применение сорбента Lichrosorb DIOL для гель-фильтрации полипептидов (разд. 6.2.2). Недавно фирмы LKB и Toyo Soda предложили использовать фенил-Т5К-колонку для НФ-хромато-графии пептидов.

Проводились сравнительные испытания сорбента Lichrosphere (размер пор 50 нм) с носителями, покрытыми фазой Cs, имеющими поры 10 нм. Сравнение показало, что в случае носителей, имеющих большие поры, емкость колонки по большим белкам (бычий сывороточный альбумин, коллаген) увеличивается, а ши-

14*

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Фракция

РИС. 6.8. Очистка интерферона на Lichrosorb RP-8 с использованием ОФ- и НФ-ВЭЖХ. а — на колонку нанесли 63 мл раствора интерферона в 4 М. мочевина — 0,1 М ацетат натрия; колонка промыта 1 М ацетатом натрия, рН 7,5; белок элюировали в градиенте н-пропанола (см. текст); б — фракции элюата, содержащие интерферон из а, объединяли и доводили содержание н-пропанола до 80%; наносили на колонку, элюировали н 0,1 М ацетате натрия с градиентом концентрации н-пропанола (72,5 — 50%); скорость потока 0,25 мл/мин [26]; в — фракции из НФ-разделения, содержащие интерферон, объединяли и разделяли ОФ-ВЭЖХ в пиридин-формиатных буферах в градиенте концентрации н-пропанола; г — хроматография продукта, полученного из разделения в. Условия разделения аналогичны в.

Замечание. Измерения флуоресценции проводили в элюате с постколоночной обработкой фракций.

6.3. АДСОРБЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

213

рина зоны элюирования уменьшается. На сорбентах с порами 10 нм можно проводить разделение белков с М 10 000—20 000.

63.1. Подготовка к нанесению образца

ОФ-носители используют для предварительной очистки и концентрирования полипептидов. Описано применение мини-колонок, заполненных Partisil-10 ODS (10 мкм, размер пор 5,5— 6,0 нм, фирма Whatman, Англия), для крупномасштабного фракционирования клеточных экстрактов и культуральных сред [14]. Использование растворов с кислыми рН помогает инакти-вировать протеазы. Разделения проводят в растворах, содержащих хлорид натрия и ацетоиитрил. Например, клеточные экстракты хроматографировали па патронах Sep-Pak (носитель, си-ликагель, модифицированный октадецилхлоросиланом) в растворе 5%-ной (об./об.) муравьиной кислоты, содержащей 1% (масс/об.) хлорида натрия и 1% (об./об.) ТФУ [1]. Ткани де-липидировали обработкой ацетоном при —20 °С, экстрагировали гексаиом, ацетоном, сушили. После нанесения образца на колонку патрон промывали 0,1%-ной ТФУ; компоненты смеси элюировали 80%-ным ацетонитрилом, содержащим 0,1% ТФУ. Элюат разбавляли 0,1% ТФУ в соотношении 1 :4 и наносили на аналитическую колонку.

При выделении интерферона 60 мл раствора частично очищенного белка, полученного после фракционирования на сефадексе G-100 в 4 М мочевине, наносили на ОФ-колонку [26]. Патроны Sep-Pak применяли для отделения пептидов от мочевины после гель-фильтрации в растворах муравьиной кислоты [31]. Элюирование проводили в ацетате, содержащем ацетоиитрил.

Таким образом, используя специфическую сорбцию пептидов и белков, на ОФ-колонки можно наносить большие объемы экстрактов биологического материала. Правильный выбор природы и содержания органического растворителя помогает увеличить селективность разделения [23].

Условия нанесения образца па ОФ-колонку существенно влияют на результаты фракционирования. При выделении пептидов для структурных исследований практикуется нанесение образцов в растворах, содержащих мочевину или Gu-HCl. Это помогает растворить образцы, предотвращает агрегацию молекул, способствует адсорбции образца на носителе. Адсорбция образца, позволяющая нанести вещество ровным слоем и создать оптимальные условия для взаимодействий между подвижной фазой и растворенным веществом, является одним из важнейших условий успешного фракционирования полипептидов. При больших объемах наносимого образца повышается эффективность последующих хроматографических разделений.

214

G. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ 11 ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

6.3.2. Выбор колонки для обращенно-фазового разделения

Колонки, заполненные сорбентом с диаметром частиц 5— 10мкм> имеющих поры 10 нм, пригодны для разделения очень многих пептидов, но для выделения полипептидов большой молекулярной массы (^20 ООО) целесообразнее использовать сорбенты с диаметром пор ^50 нм. Применение кислых буферов с высоким содержанием солей предотвращает взаимодействие полипептидов с ^модифицированными силанольными группами. Некоторые колонки (Ultrapore RPSC, фирмы Altex, Vidac, Zorbax С8> Bioseries фирмы Dupont) имеют высокую степень дополнительной модификации, проводимой для удаления остаточных сила-иольных групп, что делает эти колонки предпочтительными для выделения пептидов. В настоящее время наиболее эффективны сорбенты, покрытые углеводородами С3, С4> Cs. На колонке Ultrapore RPSC (СЗ) удается добиться особенно хорошего разделения (рис. 6.9).

6.3.3. Подвижная фаза

Обычно разделения проводят в кислых буферах (рН —2), содержащих 0,1%-ную ТФУ или 0,1 М растворы фосфата или ацетата. Слабокислые (рН 4) и нейтральные (рН 7) буферы оказались удобными для последующего более тонкого фракционирования [23]. Из органических растворителей чаще всего применяют ацетонитрил и пропанол.

Для предварительной оценки условий разделения можно использовать одну из следующих систем:

1) 0,1 М NaH2P04—Н3РО4 (рН 2,1, общее содержание фосфата 0,2 моль/л), градиент концентрации ацетонитрила 10 — 40% [И];

2) 1 М пиридин — 2 М муравьиная кислота (рН 4,0), линейный градиент концентрации «-пропанола 20—40%+ 1 М ацетат натрия (рН 7,5) или линейный градиент концентрации w-пропа-нола 0—40% [23];

3) 0,1%-ная ТФУ или ГФМК с градиентом концентрации ацетонитрила 0—40% [1] (рис. 6.9). Использование этого раствора позволяет детектировать поглощение элюата при 206— 215 нм; препараты, содержащиеся в элюатс, легко лиофилизи-ровать.

6.4. Обращенно-фазовое разделение пептидов

Впервые ОФ-ВЭЖХ была использована для разделения смесей пептидов в 1976 г. сразу в нескольких лабораториях независимо друг от друга. С тех пор опубликовано очень много сообще-

6.4. ОБРЛЩЕННО-ФАЗОВОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

215

I—1—i—I—j—I—i—1—1_i_1_i_1 I i I I

О 8 16 24 32 40 48 56 64 мин

РИС. 6.9. Разделение нативных белков ( — 20 мкг каждого) при помощи ОФ-ВЭЖХ с использованием широкопористых сорбентов с короткими алкиль-ными цепями. Белки фракционировали в 0,01 М ТФУ с градиентом концентрации ацетонитрила (20—70%) при скорости потока 0,2 мл/мин. Использована колонка Ultrapore RPSC (4,6X75 мм). Определение по оптической плотности при 280 нм.

ний об использовании самых разных носителей и подвижных фаз для разработки методик быстрого высокоэффективного разделения биологически активных пептидов или фрагментов белков. Поскольку многие однотипные сорбенты обладали незначительными различиями в разделяющей способности, в литературе появилось множество сходных между собой методик.

На процесс разделения пептидов влияют: природа органического растворителя, содержание воды, ионная сила, рН, температура, способность системы к ион-парным и ионообменным взаимодействиям.

6.4.1. Выбор состава подвижной фазы

Состав подвижной фазы должен отвечать требованиям, предъявляемым к условиям выделения и состоянию очищенного препарата.

216

(i. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ II ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

1. Следует учитывать спектральные свойства элюента. Пептидная связь поглощает при 206—215 нм, поэтому можно количественно оценивать элюирование всех пептидов. При выборе состава подвижной фазы обязательно следует учитывать это обстоятельство. Органические кислоты довольно прозрачны при 206—215 нм, хотя при их высокой концентрации наблюдается подъем уровня базовой линии из-за поглощения света этими соединениями. Конкретный растворитель можно выбрать, пользуясь справочными таблицами, опубликованными в проспектах фирм или в учебниках. Чаще всего применяют ацетонитрил, метанол, н-пропанол, этанол. Чистота растворителя влияет на смещение базовой линии, происходящее при градиентном элюи-ровании. Выпускаются растворители, позволяющие работать при длине волны 200—215 им.

2. Необходимо принимать во внимание размер, заряд, гидрофобность пептидов. До последнего времени разделение больших пептидов (содержащих более 30—40 остатков) проводили по размеру молекул. На ОФ-носителях пептиды разделяются благодаря гидрофобным взаимодействиям, поэтому увеличение гидрофобности пептидов вызывает увеличение времени удерживания. Поскольку диапазон рН ограничен областью 2,0—7,5 (из-за неустойчивости носителя к гидролизу), то изменение рН буфера влияет в основном на карбоксильные и а-аминогруппы пептидов. Поэтому при рН<р/ боковых цепей Asp и Glu возрастет гидрофобность пептида, так как карбоксилы боковых цепей будут в основном незаряженными. Гидрофобность пептидов можно изменять, используя ионно-парные взаимодействия заряженных боковых цепей. Например, при рН 4 соли аммония образуют ионную пару, что позволяет подавить ионные взаимодействия карбоксильных групп. Ионно-парные взаимодействия с анионами или катионами боковых цепей используют как для повышения, так и для понижения полярности пептидов. Время удерживания на колонке пептида, вступившего в ионно-парное взаимодействие, зависит от способности комплекса к участию в распределительной хроматографии или от адсорбции ионно-парного реагента неподвижной гидрофобной фазой, что приводит к ионообменным взаимодействиям.

Для большинства разделений бывает достаточно использовать фазы, содержащие ТФУ, фосфорную кислоту или ацетат аммония. В особых случаях (например, разделение смесей пептидов, имеющих повышенное содержание кислых групп) используют более сложные ионно-парные системы [4].

3. Если необходимо отделить пептид от всех сопутствующих компонентов раствора, то вместо обессоливания, сопровождающегося большими потерями образца, следует проводить лиофи-лизацию. При этом обычно отдают предпочтение легко удаляе-

6.4. ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

217

мым в вакууме ацетату и бикарбонату аммония, формиату три-этиламмопия, ТФУ, ГФМК, муравьиной и уксусной кислотам.

4. Условия выделения образца не должны мешать последующему определению ег

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
услуги проектор москва
Рекомендуем компанию Ренесанс - покраска лестницы деревянной - цена ниже, качество выше!
кресло ch 797
теплое хранение

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)