химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

зия, вызываемая нарушением потока фазы по мере прохождения через слой частиц, продольная диффузия. Использование частиц малого размера (5—10 мкм), имеющих незначительный разброс по диаметру частиц и по размерам пор, в сочетании с хорошей упаковкой колонки помогает уменьшить размывание зон. Последнее явление вызывается также пристеночными эффектами, и поэтому увеличение диаметра колонки до 7,5—8,0 мм снижает влияние этих эффектов. При выборе колонки надо искать компромисс между стоимостью упакованного носителя и размерами колонки (длина, диаметр).

Поскольку коэффициент диффузии для больших белков существенно меньше, чем для пептидов, то для белков увеличение линейной скорости подвижной фазы гораздо сильнее влияет на ширину зоны и на эффективность колонки, чем в случае пептидов. Увеличение длины колонки положительно сказывается на ее эффективности только при оптимальной скорости потока (относительно кажущегося размера молекул анализируемых соединений). Колонки для гель-фильтрации, производимые разными фирмами, имеют различные (рекомендуемые фирмами) оптимальные скорости потока для разделения смеси одних и тех же белков. Например, в инструкции фирмы Toyo Soda для колонки Blue column, продаваемой фирмой LKB, рекомендуемая скорость потока составляет —0,05 мл/мин. Такую малую скорость подачи растворителя не могут обеспечить большинство насосов многих фирм, и работа при таких объемных скоростях ведет к удлинению времени анализа. Оптимальная скорость для колонки 1-125 (фирмы Waters) составляет

6.2. ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ

201

0,25 мл/мин (по опыту нашей лаборатории). На разделяющую способность влияет также отношение общего объема пор Vi к свободному объему колонки У0: чем больше отношение Vi/Vo, тем лучше разделение. Проще всего для увеличения отношения Vi/Vo удлинить колонку; для большинства разделений длина колонки 600 мм оказывается достаточной. При приобретении колонок для гель-фильтрации рекомендуется сравнивать продукцию разных фирм, используя указанное отношение.

6.2.2. Химические факторы

Гели на основе полисахаридов или полиакриламида, используемые в обычной гель-фильтрации, очень слабо взаимодействуют с белками и пептидами. Иная картина наблюдается при работе на носителях, применяемых в ВЭЖХ.

На поверхности сорбентов на основе диоксида кремния присутствуют кислые силанольные группы, которые могут взаимодействовать как с положительно заряженными группами белка, вызывая его адсорбцию, так и с отрицательно заряженными группами, что приводит к отталкиванию молекул белка. В результате таких взаимодействий снижается эффективность проникновения молекул в поры геля. Для предотвращения этого силанольные группы модифицируют нейтральными соединениями, содержащими гидрофильные цепи. Обычно модификация бывает неполной, и поэтому непрореагировавшие силанольные или другие заряженные группы влияют на элюирование белка, и степень этого влияния зависит от состава подвижной фазы и р/ данного белка.

В настоящее время чаще всего используются колонки двух фирм Waters (колонки для анализа белка 1-60, 1-125, 1-250) и Toyo Soda серии TSKSW (2000, 3000, 4000), продаваемые по лицензиям многими фирмами. Кроме того, существуют колонки Synchropak GPC (Synchrom), Lichrosorb и Lichrosphere DIOL (Merck), Glycophase GPC (Pierce), Aquapore-OH (Brownlee). Superose (Pharmacia) и Spheron (Lachema).

Проводилась оценка колонок с учетом влияния химических факторов, особенно в отношении сорбента Synchropak [19]. Опубликованы результаты детального исследования колонок Lichrospere DIOL [27]. Выводы, полученные при изучении этих колонок, в разной степени применимы к колонкам других фирм. Следует иметь в виду, что для предотвращения разрушения носителя колонки на основе диоксида кремния следует использовать только при 2<рН<7,7.

Влияние ионной силы на объемы элюирования четырех белков, имеющих разные р/, показано на рис. 6.1. Хроматографи-ческому разделению подвергались пепсин (р/ 1), лизоцим (р/ 11,0), овальбумин (р/ 4,7), химотрипсиноген (р/ 9,5); рабо-

202

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

5 -

JLI, моль/л

РИС. 6.1. Влияние ионной силы на объемы элюирования белков с различными значениями р/ при гель-хроматографии на колонке Lichrosorb DIOL. Ионную силу создавали при помощи ацетата и сульфата натрия при рН 5 [27].

та проводилась на Lichrosphere DIOL при рН 5. По мере увеличения ионной силы снижалось влияние ионного отталкивания на кислый белок пепсин и ионной адсорбции — на основные бел-ки-химотрипсиноген и лизоцим, тогда как объем элюирования овальбумина (р/ 4,7) остался неизменным. Для солей, создающих более высокую ионную силу( при одинаковых молярных концентрациях), подавление ионных эффектов носителя выражено сильнее, чем для растворов с меньшей ионной силой (например, фосфат более эффективен по сравнению с ацетатом).

При отсутствии взаимодействия между сорбентами и белком должна наблюдаться линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюирования, что подтверждается для колонки Lichrosphere DIOL (рис. 6.2) [27]. В этом случае анализ проводили в растворе с ионной силой и, = 0,36 моль/ /л. Изданных, представленных па рис. 6.2, следует, что лизоцим и химотрипсиноген при указанной ионной силе элюируются в объеме, не соответствующем общей закономерности [27]. Такое отклонение отчасти можно объяснить гидрофобными взаимодействиями, так как добавление этиленгликоля к подвиж-

6.2. ГЕЛЬ - ХРОМАТОГРАФ И Я

203

500

100

50

10

и-1-[-1-1-1-Г"

• р-галактозидаза

«глюкуронидаза лей цинаминопептидаза

«эльдолаза -f- глобулин

П-1-!-Г

трансферрин • сывороточный альбумин

овальбумин *\в лепсиноген

р-ламоглобулии Фч^ пепсин гемоглобин *\

\ трипсиноген

\* • химотрипсиноген

inrui^T тпипгмн

химотрипсин*

мио глобин

рибонуклеаза •

лизоцим

цитохром с

_1_

22

?4

2.6

2,8

10

3,2

РИС. 6.2. Корреляция объемов элюирования и кажущихся молекулярных масс разных белков при гель-хроматографии. Условия анализа см. в подписи к рис. 6.1 (ионная сила 0,36 моль/л) [27].

ной фазе снижает W Наблюдаемое аномальное элюирование цитохрома с и гемоглобина связано с агрегацией белков. Так, для цитохрома с (0,05 М фосфат натрия, 0,1 М хлорид натрия, рН 7,5) Ve соответствует М 12,5-103, тогда как при рН 5 (0,1 М ацетат натрия) Ve коррелирует с М 20-Ю3. Для сравнения приведены также градуировочные графики для разделения некоторых эталонных белков (с указанием условий разделения) на колонках Synchropak GPC, Waters (серия I), Toyo Soda (рис. 6.3—6.5).

204

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

РИС. 6.3. Градуировочные графики, полученные при гель-хроматографии белков на колонках Synchropak ТРС 100 (а) и 500 (6"). Элюент — 0,1 М КН2Р04 (рН 7); скорость потока 0,5 мл/мин [19].

Зная природу сил физического и химического взаимодействия белков с поверхностью носителя и учитывая факторы, влияющие на кажущиеся величины молекулярных масс М белков в растворе, можно определять на колонках (при неденату-рирующих условиях) кажущиеся М белков с точностью до ~ 10%. В этих условиях при достаточно высоких выходах белка сохраняется его биологическая активность.

6.2.3. Определение истинных молекулярных масс

Определение М белка невозможно до тех пор, пока его молекулы не примут форму беспорядочного клубка. Для этого надо разрушить дисульфидные связи либо путем восстановления или окисления надмуравьиной кислотой, либо проведения сульфито-лиза. Хроматографию можно проводить в 0,1%-ном водном растворе ДСН, но лучшие результаты получаются при использовании 6 М гидрохлорида гуанидина (Gu-HCl). Влияние этих детергентов на разделение показано на рис. 6.6 и 6.7 [7—9]. При этом обнаруживается хорошая корреляция между значениями М и коэффициентами распределения белков Ко- Детально изучались особенности работы колонок TSKSW 3000 и 4000 (фирмы Toyo Soda) в 6 М Gu-HCl [28]. Полученные при этом данные хорошо совпадали с результатами разделения в агароз-ных гелях [10]. Обычно не рекомендуется использовать Gu-HCl

100 80

60 40

20

1,0

0,8

0,6 0,4

0,2

\

BCAfp/ 4,9)

альбумин ( р/ 4,6 )

.химотрипсиноген А(р/ 9,1) •соерый трипсиновый ингибитор(р7" 4,5) \рибонуклеаза А(р/ 9.5)

"цитохром с • инсулин(р/5,4)

(р/ )0,7)

>АТР

•дитиотреит

J_I_L

0,2 0,4 О.Б 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 к '

10е

ю5

ю4

голубой декстран

> ферритин

колонка. 1-250 подвижная фаза. 0,05М NaH2P04/ Na2HP04,pH6.8

• каталаза альдолаза

'IgG

ГЛЮКОЭО-»

оксидаза

БСА> ЧСД * овальбумин*

трипсиновый ингибитор

миоглобин

I I

_L

»рибонуклеаза А

0,12 0,24 0,36 0,48 0,60 0,72 0,84

РИС. 6.4. Градуировочные графики гель-хроматографии белков на колонках Waters 1-125 (а) и 1-250 (б).

а — две последовательно соединенные колонки Waters 1-125; буфер 0,1 М КН2Р04, рН 7, скорость потока 2 мл/мин [6]; б— буфер — 0,05 М NaH2P04, рН 6,8. (С разрешения фирмы Waters Accociates.)

206 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ II ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

j_i__1_i_I__i_I_I__l.

20 30 40 20 30 40 20 30 40 bq

Объем элюирования, мл

РИС. 6.5. Разделение белков гель-фильтрацией на сорбентах TSK SW с pa i личными размерами нор. Эталонные смеси белков содержали: / — тиреоглобулнн, 2 — БСА, 3 — р-лактоглобулин, 1 — миоглибии, J — циiо-хром с, 6 — тетраглицип [7].

в хроматографах, так как хлорид-ионы вызывают коррозию нержавеющей стали. Однако если по окончании работы тщательно промывать все стальные части, бывшие в контакте с раствором Gu-HCl, то последний можно использовать в работе на хроматографе. Вместо Gu • IIC1 авторы использовали в качестве подвижной фазы раствор 6 М мочевины, содержащей 0,2 М муравьиную кислоту [31]. Наблюдалось хорошее соответствие между М и Кпу но предел исключения колонки (в данном случае Ы25) снизился до М 65 000, что обусловлено разворачиванием полипептидной цепи. Растворы мочевины полезно использовать в структурных исследованиях для подавления взаимодействия белков с носителем, а также в случае плохой растворимости белка. Мочевину удаляют, сорбируя пептиды на патроне Sep-Pak и промывая патрон 0,08%-ной трифтороуксусиой кислотой (ТФУ) или 10 мМ*ацетатом аммония. Затем элюируют пептиды 50%-ным водным ацетонитрилом, содержащим 10 мМ ацетат аммония или 0,08%-ную ТФУ. Если пептиды достаточно велики по размеру и не сорбируются на диализных трубках, то мочевину удаляют, используя трубки Spectropor. Большинство образцов хорошо очищается в трубках, задерживающих вещества с М 1000—3500.

6.3. АДСОРБЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

207

105

103

20 30 40

Объем элюирования,мл

РИС. 6.6. Градуировочные графики разделения белков гель-фильтрацией в растворе ДСН на колонках TSK SW. Буфер 0,1 М NaIbP04f рН 7 содержащий 0,1% ДСН [8].

На колонках, предназначенных для гель-фильтрации, можно работать в режиме распределительной или адсорбционной хроматографии. При этом неполнота модификации носителя используется для сорбции белка. Ниже обсуждается разделение белков рассмотренными методами.

6.3. Адсорбция и распределение полипептидов и белков

Обращешю-фазовая (ОФ) ВЭЖХ пептидов и белков получила широкое распространение с 1970 г. [4, 18]. Попытки перенести методологию разделения малых пептидов в хроматографию больших полипептидов до сих пор чаще всего не приносили большого успеха. При разделении смесей белков или полипептидов на обычных ОФ-сорбентах сталкиваются с проблемами, вытекающими из свойств этих сложных молекул.

Молекулы белков могут иметь на поверхности несколько участков с противоположными свойствами. Эти участки по-разному взаимодействуют с носителями; многие из этих взаимодействий вызывают потерю биологической активности, а необходимость ее сохранения резко ограничивает выбор хроматографиче-ских условий. При выделении белка следует избегать взаимо-

т

62000SW 63000SW G4000SW j_i_i_

208 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

j_1_I__I_I_i__I_I-L

10 15 20 10 15 20 Ю 15 20

Объем элюирования, мл

5

104

1 1 IN 1 ' 1

\

\

д ч -

> Чч G4000SW

62000SW

63000SW I 1

10 15 20

Объем элюирования ,мл

РИС. 6.7. Гель-хроматография белков на колонках TSK SW в растворах Gu-HCl. Белки восстановлены и алкилированы иодоацетамидом [9]. а—использованы три колонки TSK SW. Элюент — 6 М Gu-HCl, содержащий 0,1 М NaH2P04, рН 6. Эталонные смеси белков содержали: 1 — тиреоглобулин, 2 БСА, 3— овальбумин, 4 — миоглобин, 5 — цитохром с, 6 — инсулин; б—гра-дуировочные графики для белков, разделенных в 6 М Gu*HCl на колонках TSK SW.

6.3. АДСОРБЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

209

действия компонентов разделяемой смеси с носителем и органическими растворителями; опасны экстремальные рН и резкие изменения концентрации солей. Все эти ограничения не имеют большого значения в тех случаях, когда белок выделяют для изучения его аминокислотной последовательности.

Часто обнаруживается, что белок или полипептид существует в виде нескольких четко различимых форм, которые (часто по непонятным причинам) разделяются при помощи ОФ-ВЭЖХ. Такие неожиданности, конечно, осложняют фракционирование. Поскольку хроматография даже в наши дни все еще остается экспериментаторским искусством, то остается только посоветовать тщательно подбирать условия очистки образца, позволяющие получить материал в гомогенном состоянии.

Обзор текущей литературы дает ключ к выбору исходной стратегии разделения, способной принести успех. Почти всегда приходится опробовать разные режимы разделения методом проб и ошибок, и, конечно, для этой работы потребуется довольно много изучаемого материала. Во многих случаях гораздо выгоднее сначала использовать быструю жидкостную хроматографию белков, а не ОФ-ВЭЖХ. Ниже приводится краткое описание методов, которые, возможно, привлекут к себе внимание биохимиков.

Существует несколько систематических и оригинальных подходов к проблемам разделения больших полипептидов и белков. Изучалось хроматографическое поведение больших пептидов в системах, содержащих триалкиламмоний- и тетраэтиламмо-нийфосфаты и формиаты [21]. Докладывалось об изучении поведения 32 полипептидов [13, 15]; в ходе этой работы удалось разделить с высоким разрешением такие белки, как миоглобин, цитохром с, лизоцим, используя 0,1 М фосфат (рН 2,1, суммарное содержание электролитов 0,2 моль/л) и градиент концентрации ацетонитрила. Для оптимального разделения оказалось необходимым использовать и солевые эффекты, и низкие рН; большую роль сыграла концентрация органического растворителя. В кислых буферах (рН ~2) боковые цепи Asp и Glu остаются незаряженными, что увеличивает гидрофобность полипептида. Добавление солей приводит к подавлению ионных взаимодействий с носителем. Ацетонитрил как органический растворитель и фосфат как солевой фон использованы неслучайно; это дает возможность регистрировать в элюате пептиды по поглощению пептидной связи при 215 нм.

Недостатком такой системы является необходимость последующего обессоливания образцов, предназначенн

страница 30
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обучение основам компьютерной грамотности чертаново южное
whirlpool art 9811/a /sf
стоимость выравнивания ваккумом
концерт аквариум в санкт-петербурге в 2016 году

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)