зия, вызываемая нарушением потока фазы по мере прохождения через слой частиц, продольная диффузия. Использование частиц малого размера (5—10 мкм), имеющих незначительный разброс по диаметру частиц и по размерам пор, в сочетании с хорошей упаковкой колонки помогает уменьшить размывание зон. Последнее явление вызывается также пристеночными эффектами, и поэтому увеличение диаметра колонки до 7,5—8,0 мм снижает влияние этих эффектов. При выборе колонки надо искать компромисс между стоимостью упакованного носителя и размерами колонки (длина, диаметр).

Поскольку коэффициент диффузии для больших белков существенно меньше, чем для пептидов, то для белков увеличение линейной скорости подвижной фазы гораздо сильнее влияет на ширину зоны и на эффективность колонки, чем в случае пептидов. Увеличение длины колонки положительно сказывается на ее эффективности только при оптимальной скорости потока (относительно кажущегося размера молекул анализируемых соединений). Колонки для гель-фильтрации, производимые разными фирмами, имеют различные (рекомендуемые фирмами) оптимальные скорости потока для разделения смеси одних и тех же белков. Например, в инструкции фирмы Toyo Soda для колонки Blue column, продаваемой фирмой LKB, рекомендуемая скорость потока составляет —0,05 мл/мин. Такую малую скорость подачи растворителя не могут обеспечить большинство насосов многих фирм, и работа при таких объемных скоростях ведет к удлинению времени анализа. Оптимальная скорость для колонки 1-125 (фирмы Waters) составляет

6.2. ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ

201

0,25 мл/мин (по опыту нашей лаборатории). На разделяющую способность влияет также отношение общего объема пор Vi к свободному объему колонки У0: чем больше отношение Vi/Vo, тем лучше разделение. Проще всего для увеличения отношения Vi/Vo удлинить колонку; для большинства разделений длина колонки 600 мм оказывается достаточной. При приобретении колонок для гель-фильтрации рекомендуется сравнивать продукцию разных фирм, используя указанное отношение.

6.2.2. Химические факторы

Гели на основе полисахаридов или полиакриламида, используемые в обычной гель-фильтрации, очень слабо взаимодействуют с белками и пептидами. Иная картина наблюдается при работе на носителях, применяемых в ВЭЖХ.

На поверхности сорбентов на основе диоксида кремния присутствуют кислые силанольные группы, которые могут взаимодействовать как с положительно заряженными группами белка, вызывая его адсорбцию, так и с отрицательно заряженными группами, что приводит к отталкиванию молекул белка. В результате таких взаимодействий снижается эффективность проникновения молекул в поры геля. Для предотвращения этого силанольные группы модифицируют нейтральными соединениями, содержащими гидрофильные цепи. Обычно модификация бывает неполной, и поэтому непрореагировавшие силанольные или другие заряженные группы влияют на элюирование белка, и степень этого влияния зависит от состава подвижной фазы и р/ данного белка.

В настоящее время чаще всего используются колонки двух фирм Waters (колонки для анализа белка 1-60, 1-125, 1-250) и Toyo Soda серии TSKSW (2000, 3000, 4000), продаваемые по лицензиям многими фирмами. Кроме того, существуют колонки Synchropak GPC (Synchrom), Lichrosorb и Lichrosphere DIOL (Merck), Glycophase GPC (Pierce), Aquapore-OH (Brownlee). Superose (Pharmacia) и Spheron (Lachema).

Проводилась оценка колонок с учетом влияния химических факторов, особенно в отношении сорбента Synchropak [19]. Опубликованы результаты детального исследования колонок Lichrospere DIOL [27]. Выводы, полученные при изучении этих колонок, в разной степени применимы к колонкам других фирм. Следует иметь в виду, что для предотвращения разрушения носителя колонки на основе диоксида кремния следует использовать только при 2<рН<7,7.

Влияние ионной силы на объемы элюирования четырех белков, имеющих разные р/, показано на рис. 6.1. Хроматографи-ческому разделению подвергались пепсин (р/ 1), лизоцим (р/ 11,0), овальбумин (р/ 4,7), химотрипсиноген (р/ 9,5); рабо-

202

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

5 -

JLI, моль/л

РИС. 6.1. Влияние ионной силы на объемы элюирования белков с различными значениями р/ при гель-хроматографии на колонке Lichrosorb DIOL. Ионную силу создавали при помощи ацетата и сульфата натрия при рН 5 [27].

та проводилась на Lichrosphere DIOL при рН 5. По мере увеличения ионной силы снижалось влияние ионного отталкивания на кислый белок пепсин и ионной адсорбции — на основные бел-ки-химотрипсиноген и лизоцим, тогда как объем элюирования овальбумина (р/ 4,7) остался неизменным. Для солей, создающих более высокую ионную силу( при одинаковых молярных концентрациях), подавление ионных эффектов носителя выражено сильнее, чем для растворов с меньшей ионной силой (например, фосфат более эффективен по сравнению с ацетатом).

При отсутствии взаимодействия между сорбентами и белком должна наблюдаться линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюирования, что подтверждается для колонки Lichrosphere DIOL (рис. 6.2) [27]. В этом случае анализ проводили в растворе с ионной силой и, = 0,36 моль/ /л. Изданных, представленных па рис. 6.2, следует, что лизоцим и химотрипсиноген при указанной ионной силе элюируются в объеме, не соответствующем общей закономерности [27]. Такое отклонение отчасти можно объяснить гидрофобными взаимодействиями, так как добавление этиленгликоля к подвиж-

6.2. ГЕЛЬ - ХРОМАТОГРАФ И Я

203

500

100

50

10

и-1-[-1-1-1-Г"

• р-галактозидаза

«глюкуронидаза лей цинаминопептидаза

«эльдолаза -f- глобулин

П-1-!-Г

трансферрин • сывороточный альбумин

овальбумин *\в лепсиноген

р-ламоглобулии Фч^ пепсин гемоглобин *\

\ трипсиноген

\* • химотрипсиноген

inrui^T тпипгмн

химотрипсин*

мио глобин

рибонуклеаза •

лизоцим

цитохром с

_1_

22

?4

2.6

2,8

10

3,2

РИС. 6.2. Корреляция объемов элюирования и кажущихся молекулярных масс разных белков при гель-хроматографии. Условия анализа см. в подписи к рис. 6.1 (ионная сила 0,36 моль/л) [27].

ной фазе снижает W Наблюдаемое аномальное элюирование цитохрома с и гемоглобина связано с агрегацией белков. Так, для цитохрома с (0,05 М фосфат натрия, 0,1 М хлорид натрия, рН 7,5) Ve соответствует М 12,5-103, тогда как при рН 5 (0,1 М ацетат натрия) Ve коррелирует с М 20-Ю3. Для сравнения приведены также градуировочные графики для разделения некоторых эталонных белков (с указанием условий разделения) на колонках Synchropak GPC, Waters (серия I), Toyo Soda (рис. 6.3—6.5).

204

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

РИС. 6.3. Градуировочные графики, полученные при гель-хроматографии белков на колонках Synchropak ТРС 100 (а) и 500 (6"). Элюент — 0,1 М КН2Р04 (рН 7); скорость потока 0,5 мл/мин [19].

Зная природу сил физического и химического взаимодействия белков с поверхностью носителя и учитывая факторы, влияющие на кажущиеся величины молекулярных масс М белков в растворе, можно определять на колонках (при неденату-рирующих условиях) кажущиеся М белков с точностью до ~ 10%. В этих условиях при достаточно высоких выходах белка сохраняется его биологическая активность.

6.2.3. Определение истинных молекулярных масс

Определение М белка невозможно до тех пор, пока его молекулы не примут форму беспорядочного клубка. Для этого надо разрушить дисульфидные связи либо путем восстановления или окисления надмуравьиной кислотой, либо проведения сульфито-лиза. Хроматографию можно проводить в 0,1%-ном водном растворе ДСН, но лучшие результаты получаются при использовании 6 М гидрохлорида гуанидина (Gu-HCl). Влияние этих детергентов на разделение показано на рис. 6.6 и 6.7 [7—9]. При этом обнаруживается хорошая корреляция между значениями М и коэффициентами распределения белков Ко- Детально изучались особенности работы колонок TSKSW 3000 и 4000 (фирмы Toyo Soda) в 6 М Gu-HCl [28]. Полученные при этом данные хорошо совпадали с результатами разделения в агароз-ных гелях [10]. Обычно не рекомендуется использовать Gu-HCl

100 80

60 40

20

1,0

0,8

0,6 0,4

0,2

\

BCAfp/ 4,9)

альбумин ( р/ 4,6 )

.химотрипсиноген А(р/ 9,1) •соерый трипсиновый ингибитор(р7" 4,5) \рибонуклеаза А(р/ 9.5)

"цитохром с • инсулин(р/5,4)

(р/ )0,7)

>АТР

•дитиотреит

J_I_L

0,2 0,4 О.Б 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 к '

10е

ю5

ю4

голубой декстран

> ферритин

колонка. 1-250 подвижная фаза. 0,05М NaH2P04/ Na2HP04,pH6.8

• каталаза альдолаза

'IgG

ГЛЮКОЭО-»

оксидаза

БСА> ЧСД * овальбумин*

трипсиновый ингибитор

миоглобин

I I

_L

»рибонуклеаза А

0,12 0,24 0,36 0,48 0,60 0,72 0,84

РИС. 6.4. Градуировочные графики гель-хроматографии белков на колонках Waters 1-125 (а) и 1-250 (б).

а — две последовательно соединенные колонки Waters 1-125; буфер 0,1 М КН2Р04, рН 7, скорость потока 2 мл/мин [6]; б— буфер — 0,05 М NaH2P04, рН 6,8. (С разрешения фирмы Waters Accociates.)

206 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ II ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

j_i__1_i_I__i_I_I__l.

20 30 40 20 30 40 20 30 40 bq

Объем элюирования, мл

РИС. 6.5. Разделение белков гель-фильтрацией на сорбентах TSK SW с pa i личными размерами нор. Эталонные смеси белков содержали: / — тиреоглобулнн, 2 — БСА, 3 — р-лактоглобулин, 1 — миоглибии, J — циiо-хром с, 6 — тетраглицип [7].

в хроматографах, так как хлорид-ионы вызывают коррозию нержавеющей стали. Однако если по окончании работы тщательно промывать все стальные части, бывшие в контакте с раствором Gu-HCl, то последний можно использовать в работе на хроматографе. Вместо Gu • IIC1 авторы использовали в качестве подвижной фазы раствор 6 М мочевины, содержащей 0,2 М муравьиную кислоту [31]. Наблюдалось хорошее соответствие между М и Кпу но предел исключения колонки (в данном случае Ы25) снизился до М 65 000, что обусловлено разворачиванием полипептидной цепи. Растворы мочевины полезно использовать в структурных исследованиях для подавления взаимодействия белков с носителем, а также в случае плохой растворимости белка. Мочевину удаляют, сорбируя пептиды на патроне Sep-Pak и промывая патрон 0,08%-ной трифтороуксусиой кислотой (ТФУ) или 10 мМ*ацетатом аммония. Затем элюируют пептиды 50%-ным водным ацетонитрилом, содержащим 10 мМ ацетат аммония или 0,08%-ную ТФУ. Если пептиды достаточно велики по размеру и не сорбируются на диализных трубках, то мочевину удаляют, используя трубки Spectropor. Большинство образцов хорошо очищается в трубках, задерживающих вещества с М 1000—3500.

6.3. АДСОРБЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

207

105

103

20 30 40

Объем элюирования,мл

РИС. 6.6. Градуировочные графики разделения белков гель-фильтрацией в растворе ДСН на колонках TSK SW. Буфер 0,1 М NaIbP04f рН 7 содержащий 0,1% ДСН [8].

На колонках, предназначенных для гель-фильтрации, можно работать в режиме распределительной или адсорбционной хроматографии. При этом неполнота модификации носителя используется для сорбции белка. Ниже обсуждается разделение белков рассмотренными методами.

6.3. Адсорбция и распределение полипептидов и белков

Обращешю-фазовая (ОФ) ВЭЖХ пептидов и белков получила широкое распространение с 1970 г. [4, 18]. Попытки перенести методологию разделения малых пептидов в хроматографию больших полипептидов до сих пор чаще всего не приносили большого успеха. При разделении смесей белков или полипептидов на обычных ОФ-сорбентах сталкиваются с проблемами, вытекающими из свойств этих сложных молекул.

Молекулы белков могут иметь на поверхности несколько участков с противоположными свойствами. Эти участки по-разному взаимодействуют с носителями; многие из этих взаимодействий вызывают потерю биологической активности, а необходимость ее сохранения резко ограничивает выбор хроматографиче-ских условий. При выделении белка следует избегать взаимо-

т

62000SW 63000SW G4000SW j_i_i_

208 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

j_1_I__I_I_i__I_I-L

10 15 20 10 15 20 Ю 15 20

Объем элюирования, мл

5

104

1 1 IN 1 ' 1

\

\

д ч -

> Чч G4000SW

62000SW

63000SW I 1

10 15 20

Объем элюирования ,мл

РИС. 6.7. Гель-хроматография белков на колонках TSK SW в растворах Gu-HCl. Белки восстановлены и алкилированы иодоацетамидом [9]. а—использованы три колонки TSK SW. Элюент — 6 М Gu-HCl, содержащий 0,1 М NaH2P04, рН 6. Эталонные смеси белков содержали: 1 — тиреоглобулин, 2 БСА, 3— овальбумин, 4 — миоглобин, 5 — цитохром с, 6 — инсулин; б—гра-дуировочные графики для белков, разделенных в 6 М Gu*HCl на колонках TSK SW.

6.3. АДСОРБЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

209

действия компонентов разделяемой смеси с носителем и органическими растворителями; опасны экстремальные рН и резкие изменения концентрации солей. Все эти ограничения не имеют большого значения в тех случаях, когда белок выделяют для изучения его аминокислотной последовательности.

Часто обнаруживается, что белок или полипептид существует в виде нескольких четко различимых форм, которые (часто по непонятным причинам) разделяются при помощи ОФ-ВЭЖХ. Такие неожиданности, конечно, осложняют фракционирование. Поскольку хроматография даже в наши дни все еще остается экспериментаторским искусством, то остается только посоветовать тщательно подбирать условия очистки образца, позволяющие получить материал в гомогенном состоянии.

Обзор текущей литературы дает ключ к выбору исходной стратегии разделения, способной принести успех. Почти всегда приходится опробовать разные режимы разделения методом проб и ошибок, и, конечно, для этой работы потребуется довольно много изучаемого материала. Во многих случаях гораздо выгоднее сначала использовать быструю жидкостную хроматографию белков, а не ОФ-ВЭЖХ. Ниже приводится краткое описание методов, которые, возможно, привлекут к себе внимание биохимиков.

Существует несколько систематических и оригинальных подходов к проблемам разделения больших полипептидов и белков. Изучалось хроматографическое поведение больших пептидов в системах, содержащих триалкиламмоний- и тетраэтиламмо-нийфосфаты и формиаты [21]. Докладывалось об изучении поведения 32 полипептидов [13, 15]; в ходе этой работы удалось разделить с высоким разрешением такие белки, как миоглобин, цитохром с, лизоцим, используя 0,1 М фосфат (рН 2,1, суммарное содержание электролитов 0,2 моль/л) и градиент концентрации ацетонитрила. Для оптимального разделения оказалось необходимым использовать и солевые эффекты, и низкие рН; большую роль сыграла концентрация органического растворителя. В кислых буферах (рН ~2) боковые цепи Asp и Glu остаются незаряженными, что увеличивает гидрофобность полипептида. Добавление солей приводит к подавлению ионных взаимодействий с носителем. Ацетонитрил как органический растворитель и фосфат как солевой фон использованы неслучайно; это дает возможность регистрировать в элюате пептиды по поглощению пептидной связи при 215 нм.

Недостатком такой системы является необходимость последующего обессоливания образцов, предназначенн