химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

я окрашивания гелей солями серебра выпускаются компаниями Upjohn (гелькод) и Bio-Rad. Оба набора повышают чувствительность обнаружения с помощью кумаси в 250 и 50 раз соответственно. Гелькод позволяет обнаруживать белки при содержании 5—10 нг [154]. Как оттенок, так и интенсивность окрашивания солями серебра зависят от свойства анализируемого белка. Это свойство можно использовать для контроля за выделением исследуемого белка из сложной смеси. (Относительно методов обнаружения в геле см. разд. 8.19.) Поскольку метод обладает высокой чувствительностью, необходимо очень-

2*

20

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

Ш6

5-Ю5

го О

о та

о: га

о. 2-105

X

с; >. ж

I Ю5

5 104

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Относительная подвижность Rf

РИС. 1.1. Градуировочный график для градиентного (4—30%) ПААГ, построенный с использованием в качестве белков-маркеров тироглобулина, феррити-на, каталазы, лактатдегидрогеназы и бычьего сывороточного альбумина [101].

тщательно отмывать стеклянные пластинки (разд. 8.2). Если гель неплотно прилегает к стеклу (из-за жировых пятен), возможно затекание образца в образующийся зазор.

Фотографирование полученных электрофореграмм. После прокрашивания готовые электрофореграммы фотографируют на цветную или высококонтрастную черно-белую негативную или позитивную пленку (Agfa Copek или Kodak Recordak). Обычно съемку ведут с желтым фильтром № 16, зоны слабой интенсивности снимают с оранжевым фильтром № 2, интенсивные зоны можно снимать без фильтра, экспозиция составляет 1—6 с. Пленку проявляют соответствующим проявителем, например Agfa Rodinal (при разведении 1:25, 20°С, 3,5 мин). Свойства фотобумаги для получения отпечатков зависят от качества электрофореграммы и полученного негатива.

1.2.1.2. Анализ полученных результатов. При построении гра-дуировочного графика на оси абсцисс откладывают длину пробега (в миллиметрах) или относительную подвижность Rf белковых зон, а на оси ординат — молекулярную массу белков-маркеров (рис. 1.1). Относительная подвижность Rf определяется к пробегу красителя или белка-маркера. Молекулярную массу исследуемого белка находят по градуировочному графику, используя экспериментальные значения Rf. Во избежание ошибок из-за вариабельности свойств геля рекомендуется проводить электрофорез исследуемого белка и стандартной смеси на одной

1.2. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОЛИГОМЕРОВ

21

пластине. Ошибка определения молекулярной массы по градуи-ровочному графику достигает 25% [98]. Большие отклонения наблюдаются в том случае, если олигомер в процессе электрофореза распадается на мономеры или если белок не обладает глобулярной структурой, как, например, фибриноген — фибриллярный белок, имеющий больший по сравнению с глобулярными белками равной молекулярной массы гидродинамический объем.

1.2.2. Гель-фильтрация

При гель-фильтрации разделение белков происходит главным образом по размерам белковой глобулы [6, 59]. В настоящей главе рассматривается хроматография на открытых колонках, хотя сегодня в связи с созданием новых колонок, приборов, методов набивки более важным методом является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ; см. гл. 6). Вместе с тем принципы разделения на открытых и закрытых колонках полностью идентичны.

Гель-фильтрацию проводят на колонках, заполненных частицами набухшего геля, имеющими поры определенного диаметра. Общий объем столбика геля обозначают Vt. Общий объем можно найти расчетным путем по форме колонки или же экспериментально по объему заполняющей ее воды. В процессе элюирования крупные молекулы, не проникающие в гранулы геля, перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем, находящимся между гранулами, и элюируются в виде узкой зоны. Объем элюента, соответствующий появлению этой зоны, обозначают v0 (свободный объем). Менее крупные молекулы проходят через колонку не так быстро, так как они проникают в гранулы геля и их выход с колонки занимает продолжительное время. Поскольку степень диффузии в гранулы геля зависит от размеров молекул, вещества элюируются с колонки в порядке уменьшения их молекулярной массы. Молекулярная масса М исследуемого белка определяется путем сравнения объема элюирования Ve с аналогичным параметром для белков-маркеров. Этому вопросу посвящены исчерпывающие обзоры [1, 59] и проспекты фирмы Pharmacia [134].

1.2.2.1. Методики. Для получения удовлетворительных результатов необходимо использовать хроматографические колонки соответствующих размеров и подходящей конструкции. Такие колонки выпускаются фирмой Pharmacia (Швеция). Аналитические эксперименты проводят в колонках диаметром ~15 мм, препаративные — в колонках диаметром 25—50 мм. Длина колонок составляет 500—1000 мм; если позволяет жесткость гранул геля используются колонки и большей длины. Кроме того,

22

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

необходимы также фракционный коллектор, перистальтический пасос и проточный денситометр.

Для хроматографических экспериментов подбирают гель с такими свойствами, чтобы зона исследуемого белка приходилась на середину профиля элюирования. Пористый носитель готовят па основе декстраиа, акриламида и/или агарозы (с различной степенью сшивки), позволяющих разделять вещества с разными молекулярными массами. Агарозные гели (сефароза, биогель А) используют для фракционирования крупных белков с молекулярной массой вплоть до нескольких миллионов. Путем соответствующей обработки агарозы получают сефарозу CL (поперечно-сшитую), которая обладает достаточной жесткостью и допускает высокие скорости элюирования. Белки с молекулярной массой < 1 000 ООО фракционируют на сефадексе, биогеле Р или ультрагеле (фирма LKB). Снижение степени сшивки уменьшает жесткость геля и допустимую скорость элюирования, но увеличивает предел исключения по молекулярной массе. Более прочный гель (сефакрил), позволяющий проводить элюироваппе при более высоких скоростях (5—10-кратных), получают сшивкой аллилдекстрапа 1М,1\т/-метиленбисакриламидом [89, 123J.

Для получения наилучших результатов рекомендуется следовать стандартным методикам [134]. Высушенные гранулы геля выдерживают (или автоклавируют) в рабочем буфере в течение трех суток. Гели, поставляемые в виде суспензий, например сефакрил, промывают рабочим буфером и готовят суспензию в этом буфере. В колонку наливают немного буферного раствора, а затем осторожно по стенке переносят деаэрированную суспензию гранул геля. На пористую пластинку в нижней част колонки можно предварительно поместить небольшой слон жесткого геля сефадекса G-25, что позволит исключить забивание пластинки обломками гранул при работе на мягких гелях. Если объем суспензии превышает объем колонки Vt, то колонку наращивают. При набивке колонки скорость потока жидкости (буфера) может быть несколько выше, чем при последующем фракционировании, однако скорость потока и гидростатическое давление не должны превышать величин, рекомендованных фирмами-изготовителями. После формирования столбика геля через колонку пропускают не менее двух объемов рабочего буферного раствора. При использовании длинных колонок поток элюента рекомендуется подавать снизу вверх. С этой целью колонки снабжают специальными приспособлениями (фирмы Pharmacia, LKB, Wright).

Обычно используют буферные растворы с рН 6ч-8 и ионной силой >0,1 (например, 0,1 М трис-НС1 —0,1 М NaCl, рН 8,0); иногда в зависимости от свойств исследуемого белка приходится изменять параметры буфера, например увеличить ионную силу

1.2. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОЛИГОМЕРОВ

23

с тем, чтобы воспрепятствовать агрегации олигомеров. Однако в случае сефарозы эффективность разделения зависит от концентрации солей и рН [104]. Хроматографию на сефакриле рекомендуется вести при ионной силе >0,5 или при рН 5,5, поскольку этот гель проявляет слабые ионообменные свойства [191.

Постоянную скорость элюирования задают с помощью перистальтического насоса. Элюат, собираемый на фракционном коллекторе, анализируют в потоке или выборочно по фракциям на содержание белка, для чего обычно регистрируют изменение оптической плотности при 280 нм. Другие методы детектирования используют при отсутствии в белке хромофоров (остатков триптофана и тирозина), при работе на микроуровне или при слишком высоком поглощении при 280 нм, например благодаря присутствию кофактора. В этих случаях можно определять оптическую плотность при 220 им, интенсивность флуоресценции или радиоактивность (при работе с мечеными белками) [14, 161]; наконец, при анализе белковых фракций можно использовать химическую модификацию (разд. 1.4.5.1). Например, определенные объемы (аликвотные части) отдельных фракций можно подвергнуть щелочному гидролизу и последующему анализу по реакции с нингидрином. Для обнаружения белков можно использовать реакцию Лоури или реакцию связывания красителя. Последний метод вполне можно рекомендовать как наиболее простой и чувствительный, причем этому определению не мешает присутствие химических реагентов. Кроме того, состав фракций можно определять с помощью электрофореза в по-лиакриламидиом геле.

Свободный объем Vo обычно определяют по объему элюирования голубого декстрана 2000 (фирма Pharmacia), суспензии вируса табачной мозаики, ферритина или других объектов с высокой молекулярной массой, не проникающих в гранулы геля. Теоретически Vo составляет 35% полного объема столбика геля Vt. Получение хорошо образованной (неразмытой) зоны синего декстрана служит критерием качества набивки колонки. В качестве маркера готовят раствор голубого декстрана (1 мг/мл) или белка (5—20 мг/мл) в буферном растворе, содержащем 10% (масс/об) сахарозы (плотность образца должна быть выше плотности элюирующего буфера). Образец маркера аккуратно наносят на колонку с помощью шприца или крана с дозирующей петлей. С целью уменьшить сорбцию голубого декстрана на сефадексе и сефарозе рабочий буфер должен иметь рН>5, а при работе на сефакриле — рН>7. Объем образца не должен превышать 1—2% общего объема геля Vt. По завершении эксперимента определяют объем элюирования Ve исследуемого белка (по максимуму поглощения на

24

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

графике оптическая плотность — объем элюирования). В случае превышения рекомендованного оптимального объема образца на кривой элюирования формируется плато, что затрудняет определение истинного значения Ve. Объем элюирования Уе можно найти по скорости элюирования, которую либо измеряют непосредственно в потоке или находят косвенным методом, измеряя количество элюата, собранного в единицу времени. Поскольку Ve пропорционален времени элюирования, в основу расчетов может быть положено время выхода с колонки исследуемого белка.

1.2.2.2. Анализ полученных результатов. При определении молекулярных масс методом гель-фильтрации для конкретной хро-матографической колонки предварительно строят градуировоч-пый график. На оси абсцисс откладывают объем элюирования или связанные с ним параметры, а на оси ординат молекулярную массу (в логарифмической шкале) известных белков. Наборы белков-маркеров фирмы Pharmacia включают рибонуклеа-зу (М 13 700), химотрипсиноген А (М 25 000), овальбумин (М 43 000), альбумин (М 67 000) или альдолазу (М 158 000), каталазу (М 232 000), ферритин (М 440 000), тироглобулин (М 669 000). Часто в расчетах используют величину VCt однако более удобен коэффициент распределения Kav между жидкой фазой и фазой геля, поскольку этот параметр не зависит от объема колонки:

vt-v0

На рис. 1.2 приведен градуировочный график в координатам \gM—Kav для сефадекса G-200. Удобно также использовать график \g(100'Kav) от #2/з (где N — число аминокислотных остатков в белках-маркерах), который имеет линейную форму. При градуировке колонки рекомендуется использовать такие белки-маркеры, которые обеспечивают хорошее разрешение и определение Kav с высокой точностью.

Параметры большинства белков вписываются в градуировочный график. Отклонения возможны в тех случаях, когда олигомер склонен к агрегации или диссоциации на мономеры или же не относится к глобулярным белкам [12]. Белки не должны сорбироваться в гранулах геля и порождать тем самым ложные зоны (пики), принимаемые за иизкомолекулярные примеси. Известно, что белки с высоким содержанием ароматических аминокислот или олигосахаридных цепей сорбируются на сефадексе. Потери белка на колонке по причине выпадения в осадок или сорбции можно оценить, сопоставляя суммарное содержание белка (по поглощению при 280 нм) в элюате и исходном образце, нанесенном на колонку.

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

25

0,2 0.4 0,6 0,8 1,0 Коэффициент распределения Каи

РИС. 1.2. Градуировочный график для сефадекса G-200, построенный с использованием белков-маркеров фирмы Pharmacia (из методического руководства фирмы).

1.3. Идентификация мономеров

В большинстве случаев первым шагом в идентификации мономеров является диссоциация исходного олигомера. Диссоциацию целесообразно проводить в мягких условиях, иногда для этого достаточно изменения рН, но чаще всего необходимо присутствие денатурирующих агентов — мочевины, гуанидингидрохло-рида, додецилсульфата натрия (ДСН). Диссоциации олигомера за счет электростатического отталкивания мономеров способствует химическая модификация олигомера, например обработка ангидридами дикарбоновых кислот (разд. 1.4.3 и 1.4.4).

При идентификации мономера необходимо учитывать возможное присутствие в нем дисульфидных связей. При наличии в мономере тиольной группы в определенных условиях может наблюдаться как внутри-, так и межцепочечный дисульфидный обмен, что приводит к искажению хроматографических или электрофоретических характеристик. Подобные осложнения возникают и в том случае, если мономеры с восстановленными ди-

26

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

сульфидными связями находятся в растворе, не содержащем восстановителя (например, 0,05 М 2-меркаптоэтанола). После восстановления дисульфидных связей рекомендуется перевести остатки цистеипа в стабильные производные путем алкилиро-вапия (разд. 1.5.1) иодоацетамидом без изменения суммарного' заряда белка или иодоуксусной кислотой, несущей отрицательный заряд (разд. 2.2.1). Введение дополнительного отрицательного заряда повышает растворимость белка при нейтральных рН и вместе с тем вносит различный вклад в суммарный заряд мономеров. Алкилирование цистеипа — реакция необратимая, и, следовательно, модифицированные остатки цистеина препятствуют сборке исходного олигомера (разд. 1.4.4). Поскольку при хранении в растворе белки склонны к агрегации, целесообразно работать только со свежеприготовленными растворами.

1.3.1. Методы определения молекулярной массы мономеров

Для определения молекулярной массы мономеров используют электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии ДСН и гель-фильтрацию в классическом и современном (ВЭЖХ) вариантах. Предпочитают использовать электрофорез в ПААГ или ВЭЖХ, однако в настоящее время ВЭЖХ уступает электрофорезу по качеству разрешения близких по молекулярной массе белков (гл. 6). Белки, содержащие более 10% углеводов, рекомендуется хроматографировать па агарозных ге

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
экран для проектора в аренду в мытищах
Рекомендуем компанию Ренесанс - lestnicatmp ru - цена ниже, качество выше!
кресло клио цена
Выгодное предложение от интернет-магазина KNSneva.ru на Canon PF-04 - офис в Санкт-Петербурге, ул. Рузовская, д.11, КНС Нева.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)