химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

(сорбент И). Сорбент II и соответствующий конъюгат пространственная группа — агароза удерживают 35% и 22% рецепторов и 12% и 9% белков. Анализ адсорбционных свойств различных конъюгатов пространственная группа — агароза показал, что пространственная группа, содержащая ароматическое кольцо и днаминодипропиламшюгруппу (сорбент IV), сорбирует наибольшее количество (—) [3Н]дигидроальпренололсвязывающих участков и белка. Такое специфическое связывание значительно снижается при замене ароматической группы па метильиую (сорбент V) и увеличении гидрофильностн алифатического компонента пространственной группы (т. е. путем замены диаминодипропил-ампногруппы на Ь1-ацетилдиамниопропан-2-олгруппу, сорбент VI). Ацетампд-ное и N-ацетилцистамидное производные диаминопропан-2-олагарозы (сорбенты VII и VIII) являются практически инертными. Эти данные свидетельствуют о том, что присутствие ароматического кольца или гидрофобных участков в пространственной группе приводит к увеличению неспецифического связывания р-рецепторов и белков. Сорбент III связывает 88% рецепторов, а соответствующая пространственная группа (сорбент VIII) удерживает лишь 4%. Оба сорбента связывают 9% и 6% белка.

Из трех классов аффинных сорбентов только конъюгат альпреполол-ага-роза (сорбент III) обладает необходимыми адсорбционными свойствами: удерживает наибольшее количество рецепторов и незначительное количество белка. Процесс адсорбции на этом сорбенте биоспецпфпчен, т. е. обусловлен взаимодействием с иммобилизованным альпренололом, а не с пространственной группой. С использованием радиоактивно меченых пространственной группы или антагониста установлено, что па стадии инкубации с рецептором не происходит отщепления свободного или связанного с пространственной группой лиганда: фракции, полученные при обработке сорбентов буфером или дигитониновым экстрактом, не ингибируют связывание (—)-[3Н]дигидро-альпренолола со свеж ев ы деленным и мембранами.

Сорбент III был использован для выбора оптимальных условий очистки рецептора катехоламина из мембран эритроцитов индюка в статических ус-

194

5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

Табл. 5.1. Сорбция солюбилизированных р-рецепторов и белков агонистамп, антагонистами катехоламинов и пространственными группами, иммобилизованными на агарозе. Дигитониновый экстракт эрнтроцитарных мембран (0,9 мл) инкубируют с 100 мг каждого сорбента при 30 °С в течение 10 мин. В сунсрнатантных фракциях, полученных после центрифугирования, определяют (—)-[3Н]дигидроальпренололсвязывающую активность и содержание белка. Степень сорбции определяют как разность между активностью и содержанием белка в исходном дигитониновом экстракте и в полученных супернатантных фракциях. (ИП) — изопротеренол, НЭ — норэпинефрин и АП — альпренолол. Немодифицированная агароза сорбирует <2% солюбилизированных рецепторов и белков [9].

Г

Пространственная группа

Лиганд

Степень сорбции

%

II

III

IV

V VI VII VIII

NH^CH^-NM-tCHjVNH-C-^^^j^^O)"0" (ИП)

1 СНОН снгин-сн(Сн,)А

9 9J

1 ^0>°"

(НЭ)

NH-CM3-CHOH-CHi-NM-C-CHсн, (АП)

СИОН

CM,-NH-CH(?H \

^-l-NH-CHj-CHOM-CHi-NH-^-'-CH, j

CH-CMfCHj-SHj NH-COCH, I

62

35

ее

67 22 30 8 4

25

12

23 9

16 о 6

ловиях, на колонке или сочетанием обоих методов: сорбцию проводят в статических условиях с последующей промывкой и элюированием на колонке. Показано, что использование смешанного метода анализа полученных фракций является предпочтительным, так как значительно упрощает процесс промывки и позволяет также стандартизировать процесс элюции. Далее приводится детальное описание этой методики.

Очищенный препарат солюбилизированных дигитонином мембран, содср-

5.7. СТРАТЕГИЯ ОЧИСТКИ РЕДКИХ БЕЛКОВ

195

жащнй 1,5 мг белка или 4 пкмоля рецептора в 1 мл, наносят на 0,5 мл аффинного сорбента, помещенного в колонку, которую промывают 3 мл 0,01 М трис-HCl буфера, содержащего 0,09 М NaCl. Процесс нанесения и сорбции проводят в термостатированных условиях (30 °С), а затем промывают 2 мл буфера, содержащего 1 М NaCl. Элюирование проводят 5 мл концентрированного раствора [3Н]дигидроальпренолола, содержащего или 1 М NaCl, или, согласно более поздним работам, 0,05% дигитонина. Рецеп-торную активность определяют либо методом осаждения полиэтиленгликолем на стекловолоконных фильтрах [9], либо методом гель-фильтрации на сефадексе G-150, на котором происходит отделение радиоактивной метки от несвязанного лиганда.

Использование сорбента III позволяет осуществить 20 000-кратную очистку рецепторов плазматической мембраны эритроцитов за один хроматогра-фический цикл. Выход составляет 25—30%. Метод был также успешно применен для очистки р-рецептора эритроцитов лягушки [3].

5.7. Стратегия очистки редких белков

Обзор литературных данных и результатов, полученных авторами, позволяет констатировать, что наиболее эффективная стратегия выделения редких белков должна включать следующие стадии:

1) получение малых количеств редкого белка с помощью специфической аффинной хроматографии с использованием на-тивного или синтетического лиганда с последующим определением биологической активности;

2) иммунизация мышей полученным материалом;

3) получение моноклональных антител с использованием спленоцитов иммунизированных мышей;

4) препаративная иммуноаффинная хроматография выделяемого белка на носителе, содержащем специфические монокло-нальные антитела.

Литература

1. Avrameas S.t Temynck 7\, J. Biol. Chem., 242, 1651—1659 (1967).

2. Beeckmans S.t Kanarek L., Eur. J. Biochem., 117, 527—535 (1981).

3. Caron M. G., Srinivasa Y., Pitha J.t Kocolek K., Lefkowitz R. J. Biol. Chem., 254, 2923—2927 (1979).

4. Cheng W. C, Fraser K. F, Haber E., J. Immunol., Ill, 1677—1689 (1973).

5. Douzou P., Trends Biochem. Sci., 1, 25—27 (1976).

6. Lefkowitz R. J., Haber O'Hara D.t Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2828— 2832 (1972).

7. Sunderland'C. A., McMaster W. R., Williams A. F,t Eur. J. Immunol., 9, 155—159 (1979).

8. Vauquelin G., Geynet P., Hanoune J., Strosberg A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 3710—3714.

9. Vauquelin G., Geynei P., Hanoune /., Strosberg A. Z)., Life Sci., 23, 1791 — 1796 (1978).

10. Venter J. C, Ross J. Jr., Kaplan N. O., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 824—828 (1975).

11. Yong M. S.t Science, 182, 157—158 (1973).

296

5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

Рекомендуемая литература

Hoffman-Osterhof О., Breiienbach M.t Koller F., Kraft D., Schelner A. (Eds.), Affinity Chromatography, Pergamon, Oxford, 1978.

Jacoby W. В., Wilchek M. (Eds.), Methods in Enzymology, vol. 34, Affinity Techniques. Enzyme Purification, part B, Academic Press, New York, 1974.

Lowe C. An Introduction to Affinity Chromatography, North-Holland, Amsterdam, 1979.

Lowe C. R., Dean P. D. G.y Affinity Cheomatography, Wiley, London, 1974. Schoit //., Affinity Chromatography, Chromatographic Science Series, vol. 27,

Marcel Dekker, New York and Basel, 1984. Scouten W. Affinity Chromatography, Wiley, New York, Chichester, Brisbane,

Toronto (1981).

Wilchek M., Hexter C. S.t in: Methods of Biochemical Analysis, vol. 23, Glick D. (Ed.), Wiley, New York, 1976, pp. 347—385.

Глава 6

РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСЕЙ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

М. Д. УОТЕРФИЛД (М. D. WATERFIELD, Protein Chemistry Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, Lincoln's Inn Fields, London WC23A 3PX, U.K.)

6.1. Введение

Появление новой аппаратуры для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) значительно расширило возможности очистки белков и пептидов с целью их последующего функционального и структурного изучения. Используемые в настоящее время сорбенты позволяют проводить разделение чаще всего по одному из следующих признаков: размеры молекул, заряд, гидрофобность.

Фракционирование по размеру разделяемых молекул (гель-хроматография) происходит при перемещении по колонке в потоке элюента смеси веществ разного молекулярного веса; при этом внутренний объем пор частиц сорбента доступен лишь молекулам, имеющим размеры, не превышающие диаметр пор. Эти молекулы участвуют в процессе распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами системы. В отличие от них молекулы, не проникающие внутрь гранул сорбента, слабо участвуют в процессах распределения и элюируются быстрее малых молекул.

В адсорбционной хроматографии результат разделения определяется процессами сорбции — десорбции молекул на поверхности носителя. Сорбция обусловлена совокупностью взаимодействий молекул разделяемых веществ и растворителей с поверхностью сорбента (дипольные взаимодействия, водородные связи, вандерваальсовы силы, ионные взаимодействия). В ходе разделения молекулы растворенного вещества и растворителя конкурируют с участками связывания на поверхности адсорбента. Степень сорбции вещества можно регулировать, меняя либо характеристики распределяемого вещества (например, заряд присутствующих в растворе частиц), либо свойства элюента. В результате этих изменений происходит конкурентное образование (или разрушение) множественных контактов между растворенным веществом, растворителем и сорбентом.

Силы гидрофобного взаимодействия проявляются в распределительной обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии, прово-

198

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

димой на носителях с химически привитыми гидрофобными остатками С8, Ci8.

Реальные хроматографические процессы проходят по смешанным механизмам. Например, современные колонки для гель-хроматографии заполнены отнюдь не инертным сорбентом и разделение в них происходит не только по размеру молекул, но включает и адсорбцию, и распределение.

Благодаря появлению ОФ-хроматографии стало возможным проводить разделения веществ быстро и с высокой эффективностью. В последнее время в литературе часто описываются методики ОФ-разделения больших пептидов. Очевидно, дальнейшие достижения в этом направлении зависят от успехов в разработке новых носителей.

Для препаративной и даже для промышленной ВЭЖХ пептидов имеется коммерческое оборудование. Появились также высокочувствительные микроколоночные системы, предназначенные для анализа следовых количеств вещества. Большинство современных приборов не рассчитано на работу при малых скоростях потока, необходимых при разделениях на микроколонках. Однако нет сомнения в том, что вскоре появятся методы разделения пикомольных количеств пептидов и белков.

Информативность анализа резко повышается при использовании детекторов, имеющих диодную линейку. Эти детекторы способны быстро (до 10 раз/с) сканировать спектры компонентов, элюируемых с колонки; включение в установку также мини- или микрокомпьютеров нового поколения позволяет контролировать чистоту разделяемых веществ и проводить селективное определение пептидов и белков, обладающих уникальными характеристиками поглощения.

Кроме того, можно ожидать, что в недалеком будущем будут созданы комплексы, включающие масс-спектрометр и микроколоночный хроматограф, что позволит не только обнаруживать небольшие пептиды, но и определять их структуру.

6.2. Гель-хроматография

При использовании мягких гелей (сефадекс, биогели) разделение по размерам молекул занимает много времени. Появление жестких носителей для гель-хроматографии дало возможность сократить время, необходимое для разделения белков и пептидов этим методом. Применение сорбентов, устойчивых к сжатию (ультрагель, сефароза), помогло добиться большей эффективности разделения, проводимого в обычных (насыпных) колонках.

Для получения носителей, обладающих параметрами, необходимыми для высокоэффективной гель-хроматографии, фирмы-

6.2. ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ

199

производители ищут способы получения сорбентов в форме однородных частиц малого диаметра (5—10 мкм), имеющих небольшой разброс размера пор (не более нескольких процентов).

Поведение белка (пептида) в ходе гель-хроматографии зависит от физических и химических свойств образца, элюента и, конечно, типа используемого носителя.

6.2.1. Параметры разделения

Обзор физических параметров разделения можно найти в работах [19, 33]. Рассмотрим основные понятия гель-хроматографии. Общий объем подвижной фазы Vt складывается из объема внутри частиц Vi и объема, заключенного между частицами сорбента Уо, упакованного в колонке. Перемещение растворителя внутрь пор и наружу происходит по законам диффузии. Распределение растворенного вещества между внутренним и внешним объемами растворителя определяется коэффициентом распределения Ко:

KD = VC- V0/ Vi =(Vo— V0)/( Vt - V0) где Ve — объем элюирования данного вещества, Vo— свободный объем (занимаемый жидкостью между частицами носителя), Vt — общий объем подвижной фазы.

Молекулы, размер которых не позволяет им проникать в поры сорбента и вступать в равновесие с жидкостью, находящейся в порах (Kd — О), элюируются в объеме Ve=V0- Небольшие молекулы, проникающие в поры (/G>=1), выходят из колонки в виде одного пика в объеме Ve, равном общему объему Vt. Ко может меняться в пределах O^/C^l. Большие молекулы проходят через колонку быстрее маленьких. В идеальном случае минимальный объем элюирования равен Vot а максимальный— Vo + Vi. Свободный объем V0 можно найти экспериментально, пропуская через колонку вещества, размер молекул которых не позволяет проникать в поры, например ферритин (М 467-103) или декстран голубой (М 2-Ю6). Общий объем Vt можно определить, хроматографируя инертные низкомолекулярные вещества ([ИС]глюкозу или 3Н20), не взаимодействующие с матрицей носителя. Следует помнить, что использование небольших пептидов или модифицированных аминокислот (например, ДНФ-Lys) для измерения Vt может привести к неверным результатам из-за взаимодействия этих веществ с сорбентом. Степень разделения К двух веществ описывается следующим уравнением (р—ширина пика):

к _ Ve(2) — Veil)

Эффективность колонки оценивается с помощью такого понятия, как высота, эквивалентная теоретической тарелке

200

6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖД

(ВЭТТ). Этот термин заимствован из теории процессов разделения, которые можно провести в виде отдельных стадий.

Поскольку в хроматографическом процессе фазы находятся в постоянном движении, то высоту колонки, эквивалентную теоретической тарелке, определяют лишь расчетным путем. ВЭТТ или общее число теоретических тарелок вычисляют по результатам хроматографии эталонных соединений. Фирмы, производящие колонки, часто используют в качестве эталонов вещества, отличающиеся от применяемых в лаборатории. Число теоретических тарелок зависит от природы используемого эталона, характеристик колонки, рабочих условий; поэтому сравнивая колонки разных фирм, надо проявлять осторожность при оценке опубликованных результатов разделения. По мере разработки все более эффективных коммерческих сорбентов и методов упаковки ВЭТТ уменьшается, что повышает общее число тарелок в колонке.

В уширение полосы вносят вклад несколько физических факторов (относительно химических см. разд. 6.2.2); среди них— линейная скорость подвижной фазы, вихревая диффу

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить букет с подсолнухами
Фирма Ренессанс цена на лестницу на второй этаж - качественно и быстро!
стул для посетителей изо хром
склад ответственного хранения личных вещей

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2016)