химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ченном аффинном сорбенте. Десорбцию проводят концентрированным раствором антигена или его фрагментов (гапте-нов). В случае отсутствия последних в достаточном количестве для элюирования используют буферные растворы с низким рН, а также растворы, содержащие гуанидин-HCl или мочевину. Такой вариант иммуноаффинной хроматографии приводит к получению гетерогенной популяции антител или лимфоцитов, содержащих антитела. При этом для приготовления иммуносор-бента и для элюирования требуется значительное количество очищенного антигена.

В том случае, когда количество исследуемого антигена достаточно только для первоначальной иммунизации, используют другой вариант иммуноаффинной хроматографии, разработанный сравнительно недавно. Полученные антитела иммобилизуют на нерастворимом носителе и экстракт, содержащий антиген, наносят на колонку. Десорбцию осуществляют обычным способом. Однако при приготовлении сорбента, сорбции и элюирова-нии необходимо иметь в виду высокую лабильность антител в присутствии денатурирующих агентов.

Моноспецифичность антител — важный фактор при использовании их в качестве лиганда. Такие антитела можно получить только путем иммунизации животных высокоочищенными препаратами антигена. Недавно был разработан новый более эффективный вариант метода, позволяющий исключить эти трудности. Мышь иммунизируют смесью антигенов, отбирают клетки селезенки, продуцирующие антитела, и проводят слияние с трансформированными клетками миеломы. Таким образом, получают устойчивые гибриды клеток, продуцирующие антитела, так называемые гибридомы. Каждый отдельный клон таких клеток продуцирует антитела только против одной антигенной детерминанты определенного антигена, т. е. обладает строгой моноспецифичностью. Продуцируемые гибридомой моноклональ-ные антитела могут быть получены в больших количествах в трансформированных клетках in vitro или in vivo в брюшной полости мыши. Полученные этим методом антитела использованы для выделения и очистки различных поверхностных антигенов лимфоцитов методом аффинной хроматографии.

Эффективность применения моноклональных антител может быть продемонстрирована на примере выделения общего лейкоцитарного антигена (L-C-антигена) тимоцитов крысы [7]. На первом этапе с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине чечевицы и гель-фильтрации в присутствии дезоксихолата получают частично очищенный препарат мембранного гликопротеина тимоцитов с молекулярной массой

5.5. ОБЩИЕ ПРИЕМЫ

189

100 000 (400—900-кратная степень очистки). После иммунизации мыши полученным препаратом отбирают клетки селезенки, продуцирующие антитела к L-C-антигену, и получают гибридо-мы с клетками миеломы. Клоны клеток, продуцирующие моно-клональные антитела, отбирают методом непрямого связывания с радиоактивной меткой и ингибирования частично очищенным препаратом антигена. Аффинная хроматография на иммобилизованных моноклональных антителах позволяет получить препарат L-C-антигена с высокой степенью очистки по данным электрофореза. Достаточно высокий выход антигена после элюирования с колонки в работе [7] объясняется тем, что мо-ноклональные антитела взаимодействуют только с одной антигенной детерминантой в молекуле антигена в отличие от обычных антител, специфичных к различным детерминантам. Необходимо также отметить, что моноклональные антитела мыши отличаются более низким сродством к антигену по сравнению с гипериммунными антителами кролика.

5.5.3. Иммобилизованные субстраты, ингибиторы и кофакторы ферментов

Оптимальными лигандами для аффинной хроматографии ферментов являются соответствующие субстраты, однако в общем случае их применению мешает быстрое превращение в продукты ферментативной реакции и как следствие снижение эффективности и деструкция сорбентов. Тем не менее субстраты могут быть использованы в качестве лигандов, если при определенных условиях скорость каталической реакции понижена, а связывание с ферментом остается достаточно сильным. Такие условия могут быть созданы путем понижения температуры (от —2 до —50 °С), когда прочность фермент-субстратного комплекса достаточна для удерживания фермента на колонке, в то время как его десорбция легко достигается при повышении температуры [5].

В более общем случае лигандами служат ингибиторы, а также эффекторы, не затрагивающие при связывании активный центр фермента. Весьма специфическим ингибитором иногда может служить иммобилизованный субстрат. Выбор того или иного ингибитора полностью зависит от соотношения скоростей его ассоциации и диссоциации с ферментом, что определяет условия проведения адсорбции и десорбции.

Для того чтобы избежать необходимости синтеза новых и новых сорбентов, всякий раз, когда требуется выделить тот или иной индивидуальный фермент, были проведены поиски «универсальных» аффинных лигандов. Наиболее подходят для этой цели адениннуклеотидные коферменты, такие, как 5'-АМР, 2', 5'-ADP, NAD+, NADP+, поскольку примерно третья часть из

5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

2000 известных ферментов проявляют активность в присутствии кофакторов указанного типа. В качестве структурного аналога ЫАО^-содержащих носителей для синтеза сорбентов с групповой специфичностью был использован голубой декстран.

Характерно, что применение групповых лигандов способствовало лучшему пониманию механизма действия кофакторов, а также влияния солей и сопутствующих белков, определяющих силу биоспецифического взаимодействия и условия адсорбции и элюирования фермента. Таким образом, несмотря на сравнительно низкую специфичность групповых лигандов, путем подбора соответствующих условий можно достичь высокой степени очистки выделяемого фермента.

Изящный вариант «каскадной» методики такого типа был продемонстрирован недавно на примере выделения цитрат-син-тетазы (К. Ф. 4.1.3.7) и фумаразы (К. Ф. 4.2.1.2) с использованием одной и той же аффинной колонки, содержащей пиромел-литовую кислоту (ПМК), присоединенную к сефарозе 4В через пространственную группу диаминопропанола. Экстракт ткани наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,3), содержащем 0,01 М меркаптоэтанол. Цитрат-синтетаза сорбируется полностью, в то время как связывание фумаразы в присутствии фосфата подавляется (фосфат — конкурентный ингибитор этого фермента). Цитрат-синтетазу элюи-руют тем же буфером, содержащим 0,01 М лимонную кислоту. Полученный элюат наносят на колонку с гелем голубой сефа-розы 4В, где фермент связывается количественно, и далее элюи-руют 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,3), содержащим меркаптоэтанол (но не содержащим лимонной кислоты). Фракцию фумаразы, не сорбированную на ПМК-сефарозе 4В в условиях элюирования фосфатом и содержащую 100% ферментативной активности, подвергают диализу против 0,01 М трис-ацетатного буфера (рН 7,3), содержащего 0,014 М меркаптоэтанол и наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в указанном буфере. При этом наблюдается количественное связывание фермента, элюирование которого проводят в присутствии ь-яблочной кислоты и далее, после удаления последней, фумаразу сорбируют на колонке с голубой сефарозой, а затем проводят элюирование, вновь добавляя яблочную кислоту в рабочий трис-ацетатный буфер.

5.6. Примеры

5.6.1. Выделение и очистка антител

Аффинная хроматография успешно применяется для выделения и фракционирования популяции антигенов, характеризующихся структурной гетероген-шостыо. Например, после гипериммунизации кролика обработанными форма-

5.6. ПРИМЕРЫ

191

аффинный сорбент

сефадекс G-25 среднего размера

стекловолокно

РИС, 5.3. Простой способ изготовления колонки для аффинной хроматографии.

лином микроорганизмами Pneumococcus (штамм VIII) были получены антитела, специфические к антигену клеточной стенки, и синтезирован ряд иммунных сорбентов на основе полисахарида из клеточных стенок. Наиболее простой способ получения сорбента заключается в конденсации полисахарида с еефарозой 4В после введения аминогрупп в одно из этих соединений, имеющих полисахаридную природу. Активация бромоцианом неаминированного компонента и его взаимодействие с полиаминопроизводным приводит к получению сорбента. Обработка таких сорбентов в кислой и щелочной средах позволяет получить ряд аффинных сорбентов, которые могут быть использованы для разделения различных популяций антител.

В то же время было показано, что прямая конденсация нативного антигена па носителе приводит к получению сорбента со слишком сильным сродством и элюирование антител возможно только в жестких условиях [4], например в присутствии б М гуанидин-HCl. В таких условиях наблюдается денатурация или нежелательные изменения в структуре антител. Для уменьшения сродства аффинных сорбентов в качестве исходного материала целесообразно использовать клеточные стенки родственных микроорганизмов, дающих перекрестную реакцию с исследуемым микроорганизмом, или изменить структуру исходного полисахарида путем обработки в кислых или щелочных условиях, аминированием и т. п.

На рис. 5.2 приведен простой способ изготовления аффинной колонки на основе обыкновенного шприца объемом 5 мл. Стенки шприца обрабатывают ацетоном, резиновый наконечник поршня используют в качестве верхней насадки. Перед заполнением колонки аффинным сорбентом (3 мл) на слой стекловолокна помещают 2 мл сефадекса G-25 среднего размера. Слой сефадекса препятствует смешиванию аффинного сорбента со стекловолокном.

Полученный сорбент проверяют на примере хроматографии функции иммуноглобулинов, выделенной из сыворотки путем высаливания сульфатом аммония. Элюирование специфически сорбированных антител проводят, последовательно сменяя различные буферные растворы. С целью оценки эффективности полученного аффинного сорбента на каждой стадии подсчитывают выход иммуноглобулинов. Для постепенной десорбции различных фракций:

192

5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

антител обычно используют плавный градиент концентрации соли, гаптена или обоих компонентов. На завершающем этапе сорбент, как правило, промывают кислотным буфером (0,2 М глицин-HCI, рН 2,2) или растворами 6 М мочевина-HCl или 4 М гуанидин-HCl. Следует обратить внимание на необходимость немедленной нейтрализации и промывки сорбента после элюирования, а также нейтрализации и диализа полученных белковых фракций.

Концентрированные солевые растворы, например 3 М NaCl, не относят к специфическим элюентам, но они могут быть использованы для ослабления электростатических взаимодействий между антителами и иммобилизованным на носителе антигеном. В качестве более специфичных элюептов используют гаптсны, например моносахариды (фукоза, манноза), дисахарнды (целло-биоза, лактоза) или смесь олигосахаридов, полученных в результате мягкого кислотного гидролиза полисахарида.

5.6.2. Очистка рецепторов гормонов

Рецепторы гормонов являются минорными компонентами плазматической мембраны клетки, и в связи с этим для их выделения необходимо располагать высокоспецифическим методом. Применение аффинной хроматографии в этом случае более предпочтительно, так как метод основан на использовании функциональных, а не общих физико-химических свойств рецепторов. Однако для успешного применения аффинной хроматографии следует принимать во внимание следующие рекомендации:

1) необходимо исключить неспецифическое взаимодействие рецепторов и других белковых компонентов с пространственной группой или материалом-носителем, затрудняющее биоспецнфическую десорбцию свободным лигандом н снижающее степень очистки рецептора;

2) иммобилизованный лиганд должен узнавать специфический участок рецептора и связываться с ним. Этот критерий приобретает особое значение при использовании низкомолекулярных лигандов (стероидов, холинэргических п адренэргических наркотиков), так как возможно взаимодействие групп лиганда, участвующих в связывании с рецептором, с пространственной группой носителя. Такое взаимодействие может значительно изменить химические, физические и пространственные характеристики лиганда и таким образом существенно снизить специфическое связывание;

3) элюирование рецептора с аффинного сорбента проводят в мягких условиях, причем константа связывания (ассоциации) должна быть выше 109—1010 М/л. Обработка в жестких условиях приводит в большинстве случаев к потере биологической активности (часто это единственный параметр, по которому определяют содержание рецептора);

4) для количественного определения рецептора необходимо использовать простую методику, легко воспроизводимую в различных условиях.

Далее приводится анализ синтеза различных аффинных сорбентов для очистки рецептора катехоламина из плазматических мембран эритроцитов индюка. Этот рецептор находится в тесном взаимодействии с аденилатцик-лазной системой. Агонистами являтся эпинефрин или изопреналин (изопроте-рниол), антагонистами — альпренолол или пропранолол. В обоих случаях происходит быстрое и обратимое связывание.

Первые попытки получить эффективный сорбент были осуществлены путем прямого присоединения норэпинефрина к агарозе или через аминогруппу агониста к пространственной группе агарозы [6]. Однако очистка на таких сорбентах невозможна вследствие блокирования аминогруппы, которая играет основную роль в фармакологической активности агониста.

По другому варианту катехоламины присоединяют с помощью ароматического кольца к диазотированным пространственным группам кремнезема {макропористого стекла). Иммобилизованный гормон активизирует аденнл-

5.6. ПРИМЕРЫ

193

атциклазную систему в тканях, клетках и плазматических мембранах [10]. Однако дополнительные исследования показали, что участки связывания рН1порэпинефрина не идентичны участкам связывания р-адренэргического рецептора [11]. Биологическая активность, приписываемая гранулам кремнезема, связана с присутствием свободного лиганда в препарате кремнезема, которое можно объяснить, в частности, как результат гидролиза связи лиганд— носитель в присутствии веществ, содержащих аминогруппы, например трпс-НС1 или альбумина.

Описан синтез трех классов аффинных сорбентов и исследованы их следующие свойства: высвобождение свободного лиганда из гранул сорбента, эффективность сорбции рецепторов и степень неспецифической сорбции [9] (табл. 5,1):

1) агонист изопротеренол присоединен через ароматическое кольцо к ди-азотированным пространственным группам агарозы (сорбент I);

2) агонист норэпинефрин присоединен через боковые группы этаноламн-на с помощью амидной связи (сорбент II);

3) антагонист альпреполол обрабатывают N-бромосукцитншидом и полученный бромогндрип конденсируют с тиол группа ми пространственных групп агарозы (сорбент III). Адсорбционные характеристики указанных сорбентов приведены в табл. 5.1.

Сорбент I удерживает 62% рецепторов и 25% солюбилнзнрованных белков. Соответствующий конъюгат пространственная группа—агароза (сорбент IV) удерживает 67% рецепторов и 23% белков. Таким образом, наблюдаемый процесс связывания рецепторов в большей степени обусловлен структурой пространственной группы, чем свойствами иммобилизованного лиганда. Аналогичное явление наблюдается при сравнении сорбентов, содержащих иммобилизованный с помощью аминогрупп норэпинефрин

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы по базам данныз москва
участки по новорижскому шоссе до 100 км недорогие
государственные курсы медсестра в косметологии
фото металич скамеек и столиков

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)