химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

с высокой концентрацией соли

неспецифическое элюирование в жестких условиях (кислота, 6 М мочевина или гуанидин-HCl)

/ промывка колонки, 1 определение содер-I жания исследуе-I мого белка в J полученных J фракциях V , специфическое элюирование в линейном или ступенчатом градиенте г\ концентрации лиганда Л. 1 отделение несорбирован-ных белков,т.е. примесных или инактивированных компонентов возможное разделение белков с различным сродством к сорбенту г Время

неспецифически сорбированные белки или белки с низким сродством к лигандам

регенерация сорбента: элюирование белков с высоким сродством к сорбенту или белков, не взаимодействующих с используемым для элюирования лигандом

РИС. 5.1. Основные этапы аффинной хроматографии.

вой молекулы, чувствительность к действию протеаз, присутствующих в исходном экстракте, или необходимость сохранения специфического микроокружения — фосфолипидов или других веществ, ассоциированных с белком.

Часто аффинную хроматографию с успехом применяют на завершающем этапе выделения после частичной очистки с помощью менее специфических рутинных методов, например осаждения сульфатом аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Специфическое элюирование целевого продукта в этом случае может служить критерием его чистоты, а также тестом на сохранение биологической активности.

Аффинная хроматография может также использоваться в качестве промежуточной стадии выделения, однако при этом не ставится задача обеспечить полноту очистки.

5.3. Методы приготовления аффинного сорбента

5.3.1. Понятие об аффинном сорбенте

Подбор сорбента с соответствующими характеристиками является в аффинной хроматографии вопросом первостепенной важности. Аффинный сорбент состоит из трех частей: носителя, пространственной группы и лиганда. Присутствие всех трех элементов иногда необязательно; например, для аффинной хроматографии лектинов носитель (сефадекс G-75, содержащий остат-

182

Е. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

Исходный экстракт

„специфическая" аффинная хроматография

высаливание,

гель-фильтрация и т.д.

„специфическая" аффинная хроматография

аффинная хроматография нэ иммобилизованных лигандах с групповой специфичностью (иммобилизованные лектины, антитела)

„специфическая" аффинная хроматография

РИС. 5.2. Различные варианты использования аффинной принципиальной схеме очистки белков.

хроматографии в

ки глюкозы и маннозы) сам по себе служит хорошим лигандом, узнаваемым лектином. В качестве другого примера можно привести очистку антидекстрановых антител на сефадексе G-100. Однако, как правило, лиганд фиксируют на носителе через промежуточную пространственную группу, роль которой заключается в том, чтобы отдалить лиганд от поверхности сорбента с целью устранения стерических препятствий при взаимодействии с исследуемым белком.

5.3.2. Материалы-носители

Носитель должен быть устойчив к действию биологических и химических факторов. В качестве носителей обычно используют агарозу, целлюлозу, полиакриламидные гели и пористое стекло (кремнезем).

5.3.2.1. Агароза. Агароза — линейный полисахарид, содержащий остатки D-галактозы и 3,6-ангидро-ь-галактозы. Это наиболее распространенный носитель для аффинной хроматографии, об-

5.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АФФИННОГО СОРБЕНТА

183

.ладающий рядом необходимых характеристик, в частности, ага-роза достаточно стабильна в обычных условиях. Кроме того, агароза выпускается в виде хорошо стандартизованного препарата.

Лиганды и пространственные группы легко присоединяются к агарозе после активации бромоцианом. В литературе приводится ряд модификаций этой методики. Активацию бромоцианом проводят в буферном растворе или в диметилформамиде. В процессе активации поддерживают рН 9—10, подтитровывая щелочью или концентрированным буферным раствором. Для лабораторий, не подготовленных к работе с токсичным бромоцианом (отсутствие приточно-вытяжной вентиляции и вакуумных насосов), выпускается бромоцианактивированная агароза. Однако этот коммерческий препарат не свободен от недостатков. Отметим некоторые из них;

1) Биодеградация. Агароза легко разрушается гидролитическими ферментами бактерий, присутствующих в исследуемых растворах. В качестве ингибитора протеаз используют 0,02%-ный раствор азида натрия.

2) Химическая деградация. Имеются сведения о том, что химическая связь между носителем и пространственной группой или лигандом гидролизуется под действием аминов, например в присутствии триссодержащих буферов. Аффинный сорбент может также разрушаться в кислой среде при элюировании прочно сорбированных белков.

3) Неспецифическая сорбция. Этот недостаток связан со способом активации. Обработка бромоцианом приводит к активации множества гидроксильных групп, однако не все они доступны для молекул лиганда. Избыточные гидроксильные группы инактивируют избытком первичного амина, лизина, этилен-диамина. Несмотря на это, может иметь место неспецифическое связывание. Нековалентная сорбция наблюдается также при нанесении на колонку концентрированных растворов белков, например сывороток, экстрактов клеток или семян. Для уменьшения неспецифической сорбции рекомендуется промывать сорбент концентрированными солевыми растворами, однако это может привести к десорбции белков, имеющих низкое сродство к лиганду.

5.3.2.2. Целлюлоза. Этот гетерогенный полимер глюкозы благодаря более низкой неспецифической сорбции, а также наличию простых методов иммобилизации лигандов часто используется для получения иммуносорбентов. Однако по гидродинамическим свойствам целлюлоза уступает другим носителям.

5.3.2.3. Полиакриламид. Преимуществом полиакриламида является низкая неспецифическая сорбция белков. Однако могут

184

5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

возникнуть трудности на стадии введения пространственных групп или конденсации с лигандом.

5.3.2.4. Пористое стекло. Пористое стекло с различным размером гранул и разнообразной пористостью доступно как коммерческий препарат. Оно обладает достаточно высокими механическими свойствами и проницаемостью, однако характеризуется недостаточной химической устойчивостью, особенно в щелочной среде. Кроме того, в большинстве случаев при хроматографии на пористых стеклах наблюдается неспецифическая сорбция.

5.3.2.5. Нерастворимые белки. Одним из первых типов аффинных сорбентов является полимер, полученный добавлением этилхло-роформиата к раствору белка, содержащего лиганд. При перемешивании реакционной смеси на магнитной мешалке выпадает нерастворимый гель в виде мелких частиц [1]. Для повышения гидродинамических свойств гель можно смешать с крупной фракцией сефадекса G-75.

5.3,3. Пространственные группы

Непосредственная конденсация лиганда с носителем может привести к стерическим ограничениям из-за относительной недоступности активных центров исследуемых белков, при этом эффективность аффинной хроматографии значительно снижается. Введение промежуточной пространственной группы увеличивает расстояние между носителем и лигандом и обеспечивает более высокую доступность лиганда. Решающими факторами в определении химической природы и размеров пространственной группы является природа лиганда и носителя.

5.3.4. Лиганд

При выборе лиганда учитывают различные факторы. Лиганд может быть связан с носителем непосредственно или через пространственную группу, причем оба компонента должны быть стабильны. Иммобилизованный лиганд должен связываться с исследуемым веществом достаточно прочно, чтобы обеспечить удаление примесей путем промывки сорбента соответствующим буферным раствором. В то же время связывание должно быть -достаточно обратимым, чтобы было возможно элюирование белка в мягких условиях. Выбор оптимального лиганда — наиболее сложная задача, которую удается решить лишь благодаря тщательному анализу положительных и отрицательных свойств намеченных структур.

5.4. АДСОРБЦИЯ И ЭЛЮИРОВАНИЕ

185

5.3.5. Конденсация

Способ конденсации лиганда, пространственной группы и носителя определяется свойствами реакционноспособных групп всех трех компонентов аффинного сорбента. Существенно, чтобы реакция конденсации проходила в условиях, обеспечивающих сохранение сродства лиганда к исследуемому белку.

5.4. Адсорбция и элюирование

Перед использованием аффинного сорбента рекомендуется отмыть его от 0,02%-ного азида натрия, который обычно добавляется в коммерческие препараты для предотвращения биодеградации носителя. Примеси белков или свободного лиганда удаляют кратковременной промывкой 1 М раствором уксусной кислоты с последующей тщательной промывкой обычным нейтральным буферным раствором. Перед нанесением образца на колонку необходимо определить специфическую активность исследуемого белка. Концентрацию белка целесообразно определять с помощью иммунохимического метода, например иммуно-ферментным или радиоиммунным анализом.

Как правило, выделение и очистку мембранных белков проводят в присутствии детергентов. Присутствие дигитонина или додецилсульфата натрия в небольших концентрациях не влияет на эффективность аффинной хроматографии. Однако в каждом конкретном случае необходимо учитывать влияние детергента на процесс сорбции, элюирования и особенно на метод определения биологической активности, применяемый до нанесения образца на колонку. Использование буферных растворов, не содержащих детергентов, может привести к неспецифической сорбции белка на сорбенте вследствие его агрегации, что существенно повлияет на степень очистки.

После нанесения образца колонку промывают сначала нейтральным буферным раствором, затем 3 М раствором NaCl. В полученных фракциях определяют биологическую активность. Следует по возможности избегать разведения полученных при промывке фракций, так как в них может быть обнаружено исследуемое вещество. Причиной этого может быть насыщение колонки или неудачно выбранные условия нанесения. В этом случае полученные фракции повторно наносят на колонку в тех же или иных условиях.

Существенным фактором при подборе условий элюирования является выбор состава элюента для десорбции связанного белка. В качестве элюента можно например, использовать свободный лиганд. Однако на практике этот вариант десорбции ветре-

186

5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

чается достаточно редко ввиду низкой растворимости лигандов в водном буфере или ввиду высокой стоимости лиганда. Кроме того, в случае неспецифической сорбции элюирование свободным лигандом может привести к ошибочным результатам. Более эффективную десорбцию обеспечивают лиганды иного строения, но с аналогичной специфичностью. В качестве элюентов обычно используют ингибиторы или кофакторы ферментов, гаптены, соответствующие фрагментам антигена, иммобилизованного на сорбенте, антагонисты рецепторов гормонов и т. д.

В некоторых случаях для разделения белковых компонентов, характеризующихся различным сродством к аффинному сор* бенту, используют элюирование в линейном или ступенчатом градиенте возрастающей концентрации элюента. Для десорбции1 белков, обладающих сильным сродством к сорбенту благодаря гидрофобным, электростатическим или другим взаимодействиям, рекомендуется вести элюирование в более жестких условиях, например, 1 М уксусной кислотой, 6 М мочевиной, 4 М гуанидин-HCl или 2 М роданидом железа. Однако в указанных условиях наблюдается десорбция неспецифически связанных белков, а также денатурация исследуемого белка и потеря его биологической активности. В таком случае следует использовать имму-нохимические методы идентификации. Другой недостаток элюирования в жестких условиях касается снижения общего числа хроматографических циклов, которые можно выполнить на данном аффинном сорбенте. Если белки элюируют в сильно денатурирующих условиях, то образец немедленно отделяют от денатурирующей смеси путем диализа. При десорбции в кислотных условиях используют минимальное количество кислоты, а фракции либо немедленно нейтрализуют, либо отбирают в пробирки с рассчитанным количеством нейтрального концентрированного фосфатного буфера.

Для оценки эффективности аффинной хроматографии су* щественное значение имеет выход исследуемого белка на каждой стадии элюирования. В связи с этим все полученные фракции сохраняют до окончания эксперимента. Выход исследуемого белка может варьировать в широком диапазоне. Добавление белка-носителя приводит к увеличению выхода биологически активного материала, но может также повлиять на степень очистки. При вымывании лиганда с сорбента наблюдается уменьшение выхода сорбированного белка или кажущегося выхода выделяемого биологически активного материала. Степень отщепления лиганда оценивают по содержанию лиганда во фракциях, полученных при промывке сорбента до нанесения образца [8], или по отщеплению радиоактивной метки при использовании радиоактивно меченных лигандов.

Присутствие в образце лиганда протеаз может препятство-

5.5. ОБЩИЕ ПРИЕМЫ

187

вать определению биологической активности исследуемых белков. Влияние лиганда можно исключить либо разбавлением образца, либо исчерпывающим диализом. Однако на этой стадии может возникнуть опасность денатурации белка. С целью предотвращения деградации белка все операции, включая нанесение, сорбцию, промывку и элюирование, проводят в присутствии ингибиторов протеаз.

5.5. Общие приемы аффинной хроматографии

В случае отсутствия очищенных препаратов высокоспецифичных лигандов используют общие приемы аффинной хроматографии, основанные на применении лигандов с групповой специфичностью. В настоящее время наибольшее распространение получили три типа аффинных сорбентов:

1) иммобилизованные лектины для выделения растворимых или включенных в состав клеточных стенок гликопротеинов;

2) иммобилизованные антитела для получения очищенных препаратов антигенов;

3) иммобилизованные кофакторы ферментов.

5.5.1. Иммобилизованные лектины

Хроматография с использованием иммобилизованных лектинов основана на их избирательном сродстве к различным концевым углеводам или группам углеводов в молекуле гликопротеина. Иммобилизованные конканавалин А или лектин чечевицы используют для специфического выделения гликопротеинов или клеток, содержащих остатки глюкозы или маннозы. Иммобилизованный лимулин применяют для выделения гликопротеинов с высоким содержанием сиаловых кислот. Иммобилизованный агглютинин арахиса проявляет специфичность к гликопротеи-пам, содержащим N-ацетилгалактозамин, а также к популяциям Т-лимфоцитов на различных стадиях дифференциации. Элюирование проводят концентрированными растворами углеводов с соответствующей специфичностью к данному лектину. Например, для элюирования с иммобилизованного конканавалина А или лектина чечевицы используют а-глюкопиранозид, а в случае иммобилизованного лимулина — сиаловые кислоты.

5.5.2. Иммобилизованные антитела

Так называемый принцип «иммуноадсорбции» был применен в одной из первых работ по аффинной хроматографии. Сначала очищенный антиген, использованный для иммунизации, присо-

188

5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

единяют к нерастворимому носителю, а затем осуществляют сорбцию специфических антител, содержащихся в сыворотке, на полу

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кровать маша и медведь дубок
форма для гандбола
штатные магнитолы volkswagen caddy купить
led лента авто

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.04.2017)