химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

инсодержащих пептидов необходимо располагать избирательным методом обнаружения. Широкое применение находит определение аминокислотного состава фракций после окисления пептидов надмуравьиной кислотой [41]. По наличию в пептиде остатка цистеиновой кислоты выявляют фракции, содержащие цистин. Показано, что сера

174

4. ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ

в частично окисленном состоянии обесцвечивает раствор иодо-платината [16]. Эта реакция может использоваться как быстрый и чувствительный тест на дисульфиды, хотя аналогичную реакцию дает сера в виде тиолов и тиоэфиров. Чувствительный флуориметрический метод обнаружения основан на тушении флуоресценции при взаимодействии дисульфидов с флуоресценн-меркуриацетатом в основной среде [26]. К сожалению, методика плохо воспроизводится.

4.5.2.1. Дисульфидный анализ [1|. Методика хорошо воспроизводится и может быть автоматизирована. Раствор пептида (в том числе фракции после хроматографии) смешивают с равным объемом G М NaOH и инкубируют в течение ~30 мин. Реакцию останавливают путем добавления при энергичном перемешивании 0,5 мл 2 М фосфорной кислоты, содержащей 2XI0-3 М ЭДТА. К полученному раствору (рН 6,0—7,0) добавляют 0,1 мл раствора ДТП И (1,0 мг/мл в 0,02 М ацетате натрия, рН 5,5) и определяют поглощение при 412 им. ЭДТА связывает ионы металлов, катализирующие окисление тиолов и тем самым стабилизирует окраску. Тем не менее спустя 60 мин поглощение падает на 1—2%. При построении градуировочного графика исиолыукл глутатион (0—2,5X10-* моль/л).

4.6. Идентификация и локализация цистинсодержащих пептидов

Для точной идентификации пептидов, связанных дисульфидными мостиками, необходимо расщепить дисульфидные связи и выделить образующиеся фрагменты.

4.6.1. Расщепление дисульфидных связей

Методы расщепления дисульфидных связей рассматриваются в разд. 1.5.1 и 2.2. Общеприняты методы окисления надмуравьиной кислотой [41] и восстановления с последующим алкилиро-ванием [48]. Образующиеся полуцистинпептиды выделяют с помощью обычных методов химии белка, включающих гель-фильтрацию, хроматографию, электрофорез на бумаге, высокоэффективную хроматографию и др.

4.6.2. Идентификация по известной аминокислотной последовательности

Анализ известной аминокислотной последовательности позволяет наметить оптимальный подход к определению положения дисульфидных связей. Для однозначной идентификации каждый цистинсодержащий пептид должен включать лишь одну дисуль-фидную связь. Следовательно, линейная последовательность интактной полипептидной цепи между ближайшими остатками полуцистина должна быть расщеплена хотя бы в одной точке. Иногда хорошие результаты дает расщепление бромоцианом.

4.6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЦНСТИИСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ 175

Однако в случае крупных белков, имеющих несколько дисульфидных мостиков, более эффективен гидролиз с помощью относительно низкоспецифичиых протеаз, например термолизи-иа [45].

Из множества возможных схем приведем простую и изящную схему анализа определения положения дисульфидных связей в миотоксиие а [18].

Нативный миогоксин а

1) расщепление бромоцианом

2) триптический гидролиз

3) разделение пептидов

lle-Cyb-llc-Prt>-Pro-Scr-Ser-Asp-Leu-Gl>-Lys

Су s-Су л- Lys

Gln-Cys-His-Lys + другие пептиды

После расщепления бромоцианом и триптического гидролиза были выделены три коротких пептида, связанные дисульфидны-ми мостиками (вероятное положение дисульфидных связей указано штриховыми линиями). Поскольку при анализе руководствовались известной структурой, пептиды были подвергнуты одностадийной деградации по Эдману в секвенсере, обессолены и фракционированы. При этом были получены два фрагмента:

Cys-Ne-Pro-Pro-Ser-Ser-Asp-Leu-Gly-Lys Gln-Cys His-Lys Cys-Lys Cys

Из приведенных структур следует, что при секвенировании был удален остаток Не, один остаток Cys, а остаток Gin циклизо-вался в пирролидонкарбоновую кислоту. Отсюда следует следующее расположение дисульфидных связей в миотоксине а:

Ile-Cy s- Не- Pro- Pro-Ser-Ser- Asp- Leu-Gly- Lys

I

Cys-Cys-Lys

l

Gln-Cys-His-Lys

176

4. ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ

Вполне очевидно, что каждый белок требует своей специфической схемы анализа.

4.6.3. Идентификация дисульфидных связей у белков с неизвестной аминокислотной последовательностью

При анализе белка с неизвестной структурой работать приходится «вслепую». Обычно для получения цистинсодержащих пептидов, имеющих лишь одну дисульфидную связь, с успехом используют термолизин [45]. Таким путем удается выделить и секвенировать пептиды независимо от порядка расположения остатков полуцистина в полипептидной цепи. Для сравнительного анализа, например структурно гомологичных белков, этот метод вполне приемлем. Он дает достаточно полную информацию еще до завершения определения полной первичной структуры.

4.6.4. Общие замечания

Предположим, что аминокислотная последовательность и положение большинства дисульфидных связей в белке установлены; в этом случае, очевидно, место последнего дисульфидного мостика можно принять без доказательств. Например, положение трех из четырех мостиков определено однозначно, следовательно, уместно предположить, что последний мостик связывает два неидентифицированных остатка полуцистина. Как уже отмечалось, выделение цистинсодержащих пептидов может сопровождаться значительными потерями, в некоторых случаях выход составляет <50%. Однако при отсутствии противоречивых фактов даже этого бывает вполне достаточно для однозначной локализации S—S-мостиков. Естественно, вывод будет справедлив при условии стабильности дисульфидных связей в пределах белковой молекулы. Редким исключением, с которым обычно не приходится встречаться, является р-лактоглобулин [27], дисульфидные связи которого нестабильны.

4.7. Специальные методы

4.7.1. Красители

Для обнаружения цистеина и цистина на хроматограммах используются специальные реагенты [39], сведения о которых можно найти в разд. 8.14.3.

4.7.2. Диагональное картирование

Метод диагональных карт был разработан специально для анализа цистинсодержащих пептидов [4, 6]. Известны различные модификации этого метода, однако наиболее часто используют

4.7. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

177

его исходный вариант — электрофорез на бумаге. Ферментативный гидролизат исследуемого белка разделяют электрофорети-чески на бумаге ватман ЗММ (400X400 мм). Затем электрофо-реграмму высушивают и выдерживают в парах надмуравьиной кислоты в течение 2 ч для окисления S—S-связей. После высушивания в вакуум-эксикаторе над NaOH проводят электрофорез в аналогичных условиях, но в направлении, перпендикулярном первоначальному. В результате все немодифицированные при окислении пептиды располагаются на электрофореграмме по диагонали, под углом 45°. Цистинсодержащие пептиды, которые подвергались промежуточному окислению, образуют лары фрагментов, располагающиеся вне диагонали. Эти зоны элюи-руют и полученные пептиды анализируют стандартными методами. Для выделения цистинсодержащих пептидов после первого электрофореза можно вырезать контрольную полоску, обработать парами надмуравьиной кислоты, подшить ее к другому листу бумаги и провести электрофорез вторично. Сравнивая полученную электрофореграмму с исходной, можно локализовать зоны, соответствующие цистинсодержащим пептидам, вырезать их и элюировать интактный материал для последующих операций. Известные модификации этого метода включают получение различных производных цистеина, например S-аминоэтилцистеи-на [33].

4.7.3. Специфическое расщепление по остаткам цистеина

К высокоспецифическим методам относятся расщепление по остаткам цистеина с помощью 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты (НТБК) [25]. Эффективность этого метода была продемонстрирована на примере антигенов гистосовместимости, когда с помощью этой методики сравнивались последовательно расположенные дисульфидные петли [15]. Размеры дисульфидных циклов определяли по длине полученных фрагментов. Метод может найти применение при выявлении структурной гомологии родственных белков. К сожалению, образующиеся фрагменты имеют на N-конце тиазолидиновые циклы и не могут быть секвенированы непосредственно. Имеются данные, что деблокирование можно проводить на никеле Ренея [32] (гл. 2). При этом остатки цистина превращаются в аланин, остатки метионина— в р-аминомасляную кислоту, становится возможным секве-нирование.

4.7.3.1. Расщепление 2-нитро-5~тиоцианобензойной кислотой [10, 15]. Образец лиофилизованного белка (несколько нмоль) растворяют в 0,2 М трис-ацетатном буфере (рН 8,0), содержащем

12-7/3

178

4. ДИСУЛЬФИДНЫЕ связи

6 М гуанидин-НС1+2 мМ дитиотреит+1 мМ ЭТДА, и инкубируют при 37 °с в течение 2 ч. Затем образец разбавляют 0,7 мл исходного буфера и добавляют 0,5 мл 30 мМ НТБК. Инкубируют реакционную смесь при 20 °с в течение 30 мин, доводят рН до 9,5 с помощью 1 М NaOH и вновь инкубируют при 55 °с в течение 24 ч. Реакцию останавливают путем гтодкисления до рН 4 ледяной уксусной кислотой.

Литература

1. Anderson \Х\ L„ Wetlaufer D. В., Anal. Biochem., 67, 493—502 (1975).

2. Angeletti R. H.} Hermodson Af. A., Bradshaw R. Л., Biocheinistrv, 12, 100— 115 (1973).

3. Begg G. S., Pepper D. S., Chesterman C. N.t Morgan F. /., Biochemistry, 17, 1739—1744 (1978).

4. Bennett J. C, Methods Enzymol., 11, 330—339 (1967).

5. Blumenthal K. Af., Kent W. R.t J. Biol. Chem., 252, 3328—3331 (1977).

6. Brown J. R., Hartley B. S., Biochem. J., 101, 214—228 (1966).

7. Butler P. J. G.t Harris J. L, Hartley B. S., Leberman R.t Biochem. J, 112, 679—689 (1969).

8. Canfield R. E.t Liu A. F.t J. Biol. Chem., 240, 1997—2002 (1965).

9. Chu F. S., Crary Bergdoll Af. S., Biochemistry, 8, 2890—2896 (1969).

10. Degani Y.. Patchornik A., Biochemistry, 13, 1 — II (1974).

11. Doolittle R. F.f Cottrell B. A., Strong D., Watt K. W. K.t Biochem. Biophys. Res. Commun , 84, 495—500 (1978).

12. Drapeau G. R., Boily Y., Houmard J. Biol. Chem., 247, 6720—6729 (1972).

13. Edelman G. Al, Gall W. E., Waxdal Al Konigsberg W. A., Biochemistry, 7, 1950—1958 (1968).

14. Ellman G. L., Arch. Biochem. Biophys., 82, 70—77 (1959).

15. Ferguson W. S., Terhorst С. Т., Robb R. L.t Strominger J. L, Mol. Immunol.,

16, 23—28 (1979).

16. Fowler В., Robins A. /., J. Chromatogr., 72, 105—111 (1972).

17. Fox /. W., Elzinga Af., Tu А. Т., Fed. Eur. Biol. Scientists Lett., 80, 217— 220 (1977).

18. Fox J. tt\, Elzinga Af., Tu A. Г., Biochemistry, 18. 678—684 (1979).

19. Gall W. Cunningham B. A., Waxdal M. /., Konigsberg W. H., Edelman G. Af., Biochemistry, 7, 1973—1982 (1968).

20. Gauldie J., Hanson /. Al, Shipolini R. A., Vernon C. A.t Eur. J. Biochem , 83, 405—410 (1978).

21. Gross E., Witkop В., J. Am. Chem. Soc, 83, 1510—1511 (1961).

22. Habeeb A. F. S. A., Cassidy H. G.f Singer S. Biochim. Biophys. Acta, 29 587—593 (1958).

23. Hearn Al T. W.t Hancock IF. 5., Trends Biochem. Sci., Pcrs. Edn. N58—N62 (1979).

24. Hourmard Drapeau G. /?., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 3506—3509 (1972).

25. Jacobson G. R., Schaffer Al Stark G. R., Vanaman T. C.f J. Biol. Chem , 248, 6583—6591 (1973).

26. Karush J., Klinman N. R„ Marks R.4 Anal, Biochem., 9, 100—1 14 (1964).

27. McKenzie H. A., Ralston G. B.t Shaw D. C, Biochemistry, 11 4539—4547 (1972).

28. Mestecky /., Schrohenloher R. E.t Kulhavy R., Wright G. P., Tomana M Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71. 544—548 (1974).

29. Miller F., Mctzger tf, J. Biol. Chem., 240, 4740—4745 (1965).

ЛИТЕРАТУРА

179*

30. Nurita К., Cheng /C.-LtJ Chang W.-C, Lo T.-B., Int. J. Peptide Protein Res., 11, 229—237 (1978).

31. Oliveira В., Lamm M. E., Biochemistry, 10, 26—31 (1971).

32. Otieno S., Biochemistry, 17, 5468—5473 (1978).

33. Perham R. N., Biochem. J., 105, 1203—1207 (1967).

34. Preval C. de., Fougereau Af., Eur. J. Biochem., 30, 452—462 (1972).

35. Ryle A. P., Sanger F.t Biochem. J., 60, 535—540 (1955).

36. Rtjle A. P., Sanger F.t Smith L. F., Kitai R., Biochem. J., 60, 541—556 (1955).

37. Sanger F., Nature (Lond.), 171, 1025—1026 (1953).

38. Schrohenloher R. Immunochemistry, 8, 375—389 (1971).

39. Scoffone E., Fontana Л., In: Protein Sequence Determination, Needle-man S. B. (Ed.), 2nd edn., Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1975, p. 202.

40. Smithies O., Science, 150, 1595—1598 (1965).

41. Spackman D. H., Stein W. H.t Moore S., J. Biol. Chem., 235, 648—659 (1960).

42. Steiner L A.t Porter R. R.t Biochemistry, 6, 3957—3970 (1967).

43. Strausbauch P. //., Hurwitz E., Gival /)., Biochemistry, 10, 2231—2237 (1971).

44. Strosberg A. D.t Margolies M. N., Maber E., J. Immunol., 115, 1422—1424 (1975).

45. Vanaman T. C.f Brew K.t Hill R. L.t J. Biol Chem., 245, 4583—4590 (1970).

46. Waxdal M. Konigsberg W. A., Henley W. L.f Edelman G. M., Biochemistry, 7, 1959—1966 (1968).

47. Waxdal M. J.t Konigsberg W. A., Edelman G. M., Biochemistry, 7 1967— 1972 (1968).

48. Zahler W. L.t Cleland W. J. Biol. Chem., 243, 716—719 (1968).

12*

Глава 5

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

А. Д. ШТРОСБЕРГ (A. D. STROSBERG, Molecular Immunology Laboratory, 1RBM — CNRS and University of Paris VII, Place Jussieu 2, Paris 7525J, France)

5.1. Введение

Аффинная хроматография-—один из главных методов очистки белков — основана на взаимодействии между двумя биологически активными веществами, одно из которых обычно ковалент-но присоединено к инертному носителю. Аффинная хроматография используется для очистки белков — антител, ферментов, гормонов, рецепторов — и других биополимеров — полисахаридов и нуклеиновых кислот, а также биологических макрочастиц, например вирусов и клеток.

В этой главе рассматриваются вопросы и проблемы практического характера, которые возникают на разных этапах эксперимента. В схематическом виде различные этапы аффинной хроматографии представлены на рис. 5.1.

Более подробное изложение теоретических основ аффинной хроматографии читатель может найти в литературе, указанной в конце главы.

5.2. Область применения аффинной хроматографии

На каком этапе общей схемы очистки следует использовать аффинную хроматографию? Различные возможности применения аффинной хроматографии в схематическом виде представлены на рис. 5.2.

Аффинная хроматография может быть использована на начальном этапе очистки при условии, что выделяемый белок настолько прочно и специфически взаимодействует с лигандом, что отделение его от сопутствующих примесей достигается в одну стадию. К таким примерам относится извлечение из сыворотки крови специфических антител с помощью иммобилизованных антигенов, извлечение гормонов из солюбилизировап-ных плазматических мембран. Аффинная хроматография особенно эффективна в качестве начального этапа в том случае, если стабильность выделяемого вещества вызывает сомнение и необходимо по возможности сократить число стадий очистки. Причиной нестабильности может быть термолабильность белко-

5.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АФФИННОГО СОРБЕНТА

181

приготовление материала-носителя, выбор пространственной группы и лиганда

приготовление образца, нанесение на колонку

неслецифическое элюирование буферами

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
узи малого таза стоимость
цирковое представление цска 02 января
стол обеденный раскладной 60х60
наклейки на машину газель

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.11.2017)