химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

птиды ?

Нет

многоцепочечные белки

______+_______

Этап идентификации внутри-и межцепочечных дисульфидных связей

Нет

Нет

Нет

в зависимости от того связаны ли! .цепи дисульфидными связями | „

в зависимости от того присутствуют ли в белке одновременно внутри-и межцепочечные дисульфидные СВЯЗИ^ Дд

могут ли быть разделены субъединицы и/или цепи после , селективного расщепления межцепочечных дисульфидных I связей

| Да

фракционирование на отдельные .цепи с интзктными внутрицепо-, чечными дисулмридными связями

I----------------:—I

1 Идентификация дисульфидных связей '

расщепление дисульфидных связей цистинсодержащих пептидов путем окисления надмуравьиной кислотой или восстановлением с последующим апеллированием

выделение полуцистинсодержащих пептидов

определение аминокислотного состава и в случае необходимости N-концевого аминокислотного остатка и аминокислотной последовательности ^

если пептиды содержат один остаток цистина

белка известна ?

определение

аминокислотной

последовательности

установить идентичность полуцистинсодержащих пептидов и положение дисульфидной связи путем сравнения

РИС. 4.1. Общая схема определения положения дисульфидных связей в очищенных белках и пептидах.

168

4. ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ

связей могут быть получены с помощью физико-химических методов. Продемонстрируем сказанное на следующем примере [13, 19].

После восстановления в мягких условиях дитиотреитом молекула человеческого иммуноглобулина IgG присоединяет 8 молей [14С] иодоацетамида, в то время как нативный белок присоединяет всего 0,5 моля этого реагента. Поскольку восстановление проводят в условиях, обеспечивающих полную диссоциацию полипептидных цепей, это означает, что молекула иммуноглобулина имеет не более четырех межцепочечных дисульфидных мостиков. Следовательно, остальные 26 остатков полуцистина, найденные по данным аминокислотного анализа, образуют внутрицепочечные связи. Более того, распределение меченых остатков в отдельных цепях свидетельствует о том, что каждая легкая цепь связана с тяжелой одной дисульфидной связью, а две тяжелые цепи соединены двумя дисульфидными мостиками.

При анализе белков со сложной четвертичной структурой целесообразно разделять их на составляющие субъединицы или полипептиды. В случае иммуноглобулинов для диссоциации полипептидных цепей проводили избирательное восстановление межцепочечных дисульфидных связей [44, 46]. Для получения крупных, хорошо идентифицируемых фрагментов, пригодных для дальнейшего расщепления до коротких цистинсодержащих пептидов, нативные белки расщепляют бромоцианом или протеолитическими ферментами [19, 28, 42, 46, 47].

Для оценки соответствия цистинсодержащих пептидов структуре нативного белка существенное значение имеет выход пептидов. Действительно, выделение пептида с высоким выходом служит наиболее убедительным доказательством того, что два остатка полуцистина связаны между собой в нативном белке. Считается вполне удовлетворительным, если выход составляет 50%, однако выход может быть занижен из-за механических потерь и неколичественного протекания реакции расщепления. Низкий выход пептидов не исключает иного распределения дисульфидных связей, и, следовательно, полученные данные могут быть признаны убедительными лишь при отсутствии противоречивых сведений, например если не будет найден цистинсодержа-щий пептид, включающий один из идентифицированных остатков полуцистина.

4.3. Определение числа дисульфидных связей

Число дисульфидных связей определяют по содержанию в белке остатков карбоксиметилцистеина, т. е. по аминокислотному составу белка до и после его полного восстановления и карбо-

4.4. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДО КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ

169

ксиметилирования. В случае многоцепочечных белков для получения дополнительной информации о распределении дисульфидных связей их фракционируют на составляющие полипептидные цепи. Остатки полуцистина определяют по содержанию метки после восстановления и последующего алкилирования радиоактивно меченными SH-реагентами. Удовлетворительные результаты получают при применении [14С] иодоацетамида (1,2 мкКи/мкмоль) и [иС]иодоуксусной кислоты (0,5 мкКи/мкмоль) [19, 31].

Содержание дисульфидных групп в белке можно определить спектрофотометрически или флуориметрически. Наиболее распространена методика, основанная на спектрофотометрическом определении дисульфидных групп с помощью реактива Эллмана [14]. В работе [29] с помощью этой методики определяли число внутри- и межцепочечных связей в человеческом иммуноглобулине IgM. Восстановленный (или нативный) белок осаждали на холоду 5%-ной трихлороуксусной кислотой (ТХУ), осадок отделяли центрифугированием и пятикратно промывали раствором ТХУ для удаления восстановителя. Затем осадок растворяли в небольшом объеме 5 М гуанидина, раствор осветляли центрифугированием, концентрацию белка определяли по поглощению при 280 нм. К аликвотной части раствора белка добавляли равный объем 0,1 м трис-HCl (рН9,1), содержащего 5М гуанидин, 2Х10"4 М 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную) кислоту (ДТНБ); рН реакционной смеси 8,1. Содержание сульфгидрильных групп рассчитывали по поглощению при 412 нм и коэффициенту молярной экстинкции 2-нитро-5-бензоата (е = 13 600). Дисульфидные группы определяют также по тушению флуоресценции флуоресцсинмеркуриацетата [26].

4.4. Расщепление полипептидной цепи до коротких цистинсодержащих пептидов

Как уже отмечалось ранее, фрагментацию белков следует проводить в условиях, исключающих дисульфидный обмен: предпочтительно в диапазоне рН 2—6,5. Тем не менее для достижения удовлетворительных результатов часто приходится вести реакцию в области более основных рН. Например, с успехом применяют гидролиз трипсином и термолизином при рН 7,0— 7,5 [19, 30, 41, 42]. Однако ввиду различной стабильности дисульфидных связей в белках при объяснении полученных результатов в этом случае не следует делать поспешных выводов.

Для первоначальной обработки белка часто применяют пепсин из-за его высокой активности в кислой среде и способности гидролизовать нативные белки. После того как стабильная структура нативного белка разрушена пепсином, можно прово-

170

4. ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ

дить дальнейший гидролиз другими ферментами в области рН, оптимальной для сохранения дисульфидных связей. При определении положения дисульфидных связей широко применяется расщепление бромоцианом в слабокислой среде по остаткам метионина. Метод обладает тем преимуществом, что при этом образуются вполне определенные фрагменты, которые могут быть выделены и использованы для последующей фрагментации.

Выбор ферментов для последующего расщепления определяется различными факторами и преследует цель получить небольшие пептиды, содержащие одну дисульфидную связь. Наиболее часто применяют обработку трипсином, химотрипсином, стафилококковой протеазой или термолизином в отдельности или в различных сочетаниях. Иногда с успехом используют ферменты с более узкой специфичностью, например плазмин, эластазу [5, 11]. Для анализа пептидов, содержащих две дисульфидные связи, разделенные несколькими остатками аминокислот применяют деградацию по Эдману [20].

Особенности методов расщепления при определении дисульфидных связей рассмотрены в настоящей главе, относительно гидролиза протеазами см. гл. 3 и 10, относительно химических методов расщепления см. гл. 1 и 2.

4.4.1. Расщепление бромоцианом

Этот метод расщепления белков подробно рассматривается в разд. 2.4.1.1. [21].

4.4.2. Гидролиз пепсином

Согласно методике Спакмена и сотр. [41], впервые использованной при изучении рибонуклеазы А, 0,1 %-ный раствор белка в 0,05 М Na-цитратном буфере (рН 1,0) инкубируют с пепсином при соотношении фермент : субстрат—1 : 50 при 25 °С в течение 16 ч. Последующие модификации методики включают увеличение концентрации фермента, проведение инкубации при 37 °С, уменьшение времени гидролиза, применение других растворителей, например 5%-ной муравьиной кислоты и 0,03 М НС1 [30, 34, 42, 43]. Гидролиз останавливают замораживанием, в случае необходимости раствор лиофилизируют. Полезную информацию можно найти в разд. 3.6.3.

4.4.3. Гидролиз трипсином и химотрипсином

После инкубации белка с пепсином по методике, описанной в разд. 4.4.2, реакционную смесь подщелачивают до рН 6,5 и инкубируют с трипсином (при соотношении фермент: субст-

4.4. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДО КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ

171

рат=1 : 25) при 25 °С в течение 8 ч [41], а затем с химотрипсином при соотношении фермент : субстрат™ 1 : 100. Реакцию прерывают путем подкисления конц. НС1 до рН 2. Степень гидролиза пептидных связей определяют по увеличению содержания свободных аминогрупп, используя реакцию с нингидрином или о-фталевым диальдегидом. Хорошие результаты получены при проведении гидролиза при 40 °С [30]. Дополнительные сведения о проведении ферментативного гидролиза приводятся в разд. 3.6.1.

Иногда гидролиз трипсином проводят при нейтральном или слабощелочном значении рН, однако при этом необходимо доказать, что не происходит дисульфидного обмена. Фрагменты человеческого иммуноглобулина IgG (полученные при расщеплении белка бромоцианом) инкубировали с трипсином (2%) при рН 7,2 в течение 4 ч [19]. При гидролизе в присутствии избытка [См] иодоацетамида показано, что белок не содержит нестабильных дисульфидных связей. В аналогичных условиях проводили триптический гидролиз фрагмента иммуноглобулина IgG (полученного при гидролизе белка пепсином), однако в отсутствие контроля за дисульфидным обменом [42]. Положение двух из четырех дисульфидных связей кардиотоксина яда кобры определено по строению цистинсодержащих пептидов, полученных при гидролизе белка трипсином при рН 7 в течение 24 ч [30]. Дополнительные сведения приводятся в разд. 3.5.1.

4.4.4. Гидролиз стафилококковой протеазой

Протеаза из культуральной жидкости Staphylococcus aureus V8 [12] при рН 4 в аммонийноацетатном буфере специфически расщепляет пептидные связи по карбоксильной группе остатка глутаминовой кислоты [24].

При последовательном расщеплении человеческого [J-тромбо-глобулина бромоцианом в 70%-ной муравьиной кислоте и стафилококковой протеазой при рН 4,0 получены цистинсодержа-щие пептиды, по структуре которых определено положение двух дисульфидных связей [3]. Белок, обработанный бромоцианом (20 мг/мл), инкубировали с ферментом (при соотношении фермент : субстрат= 1 : 40) в 0,05 М аммонийноацетатном буфере при рН 4,0 при 37 °С в течение 18 ч. См. также разд. 3.5.3.

4.4.5. Гидролиз термолизином

При определении положения дисульфидных связей в а-лакталь-бумине [45] и 2,5 S мышином ростовом факторе нервной ткани [2] цистинсодержащие пептиды получали гидролизом пептиче-ских фрагментов термолизином. В случае а-лактальбумина гид-

172

4. ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ

ролиз проводили при 37 °С в 0,0025 м СаС12 при рН 7,5. рН устанавливали постепенным добавлением 1 М триса, реакцию останавливали путем подкисления реакционной смеси до рН 3,1 с помощью НО. Пептиды ростового фактора растворяли в воде и инкубировали с термолизином в течение 22 ч, поддерживая рН 7,0 с помощью автотитратора. Высокий выход цистинсодер-жащих пептидов свидетельствовал об отсутствии дисульфидного обмена [45]. Гидролиз термолизином проводят также при рН 6,5 и 6,9 [5, 30]. См. также разд. 3.6.2.

4.4.6. Гидролиз после малеилирования и сукцинилирования

Встречаются случаи, когда белок сохраняет устойчивость к действию протеаз после денатурации с 8 М мочевиной, 6 М гуанидин-HCl, кипячения или выдерживания в кислой среде. Подход к анализу таких белков разработан в работе [5]. Хотя токсин B-IV (нейротоксин, селективный к ракообразным) оказался чрезвычайно устойчивым к протеолизу как в нативном, так и в денатурированном состоянии, его производные (малеил-и сукцинил-) были чувствительны к действию трипсина.

4.4.6.L Сукцинилирование [9]. К 1%-ному раствору белка в 1,0 М Na-бикарбонатном буфере (рН 8,0) при 25 °С постепенно в течение 1 ч добавляют 0,8 части (по массе) янтарного ангидрида. рН 8,0 реакционной смеси поддерживают путем добавления 0,1 М NaOH. Через 1—2 ч реакционную смесь разбавляют 2,5 объема дистиллированной воды и диализуют в течение 12 ч. Модификацию некоторых белков вполне возможно проводить в более мягких условиях [22]. Затем модифицированный белок может быть инкубирован одновременно в присутствии трипсина, химотрипсина и термолизина при соотношении фермент : субстрат= 1 : 50. Условия инкубации: 0,1 М К-фосфатный буфер (рН 6,8), 40 °С. Спустя 4 ч раствор подкисляют до рНЗ,0 и высушивают лиофильно.

4.4.6.2. Малеилирование [5]. С помощью частичного малеилирования устойчивому к протеолизу белку можно придать чувствительность к действию трипсина. Реакцию проводят при 10-кратном избытке малеинового ангидрида (на каждую аминогруппу) при рН 8,0 в течение 5 ч. Затем доводят рН смеси до 7,0 и инкубируют модифицированный белок с трипсином при 37 °С и при соотношении фермент : субстрат= 1 : 33. Реакцию останавливают путем подкисления до рН 3,0. Снятие защитных групп проводят при рН 3,5, 37 °С в течение 48 ч [7]. Смесь пептидов может быть подвергнута дальнейшему гидролизу трипсином или другими протеазами.

4.5. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЦИСТИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ 173

Следует отметить, что при модификации и гидролизе белок выдерживают в нейтральной или слабоосновной среде, т. е. в условиях, в принципе не исключающих дисульфидный обмен.

Относительно малеилироваиия см. разд. 3.4.2.2.

4.5. Фракционирование цистинсодержащих пептидов

Выделение и очистка цистинсодержащих пептидов представляет самостоятельную задачу. Основные проблемы связаны здесь с нестабильностью дисульфидных связей и необходимостью анализа полученных пептидов колориметрическими методами. В слабокислой среде (рН 2,0—6,5) дисульфидные связи относительно устойчивы. Это обстоятельство ограничивает выбор методов расщепления полипептидной цепи и методов выделения полученных пептидов. Поэтому на предварительном этапе надо определить структуру полуцистинсодержащих фрагментов. Зная первичную структуру, гораздо легче составить схему расщепления нативного белка, позволяющую сконцентрировать внимание лишь на пептидах, содержащих дисульфидные связи.

4.5.1. Методы фракционирования

Ввиду устойчивости цистинсодержащих пептидов в слабокислой среде (рН 2,0—6,5) для фракционирования используют гель-фильтрацию [8] и ионообменную хроматографию [2, 41]. Гель-фильтрацию проводят на сефадексе в 25% -ной уксусной кислоте [17], ионообменную хроматографию — на катеонитах [45]. При фракционировании необходимо прежде всего разделить цистинсодержащие пептиды, отделение их от других пептидов вовсе не обязательно [36, 41]. Прочие пептиды легко отделить на последующей стадии, после окисления цистина в цис-теиновую кислоту. Например, пептиды с цистеиновой кислотой можно эффективно фракционировать с помощью высокоэффективной или ион-парной хроматографии [23]. В присутствии фосфорной кислоты достигается почти идеальное разрешение при хроматографии на эффективных колонках в органических растворителях (гл. 6).

4.5.2. Обнаружение цистинсодержащих пептидов

При разделении и очистке цист

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
объекты строительства фото
купить билеты в тюз
где обучают слесарей по ромышленной вентиляции
купить agq1.1a27 в санкт-петербурге

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.02.2017)