химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

руется в присутствии ЭДТА, а также 1 мМ раствором лизина или цистеина [111].

Специфическое расщепление по остаткам цистеина. На примере р-цепи гемоглобина человека и токсина яда пчелы было показано, что фермент из A. mellea можно использовать для специфического гидролиза по остаткам аминоэтилцистеина [15]. После модификации остатков лизина путем трифтороаце-тилирования проводили алкилирование указанных белков по SH-группам с помощью этиленимина. При обработке ферментом наблюдался специфический гидролиз по всем остаткам аминоэтилцистеина за исключением фрагментов -Acc-Lys- и -Lys-Aec-.

3.5J. Протеаза II из Myxobacter AL1 [117]

Подробная характеристика этого фермента приведена в работе [47]. Фермент не выпускается в виде коммерческого препарата.

3.5.7.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Протеаза II проявляет специфичность к N-концевой пептидной связи остатков лизина, аналогично про-

3.5. ПРОТЕАЗЫ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

155

теазе из A. mellea [117]. Показано, что гидролиз пенициллопепсина IV в течение 1 ч приводит к расщеплению только по остаткам лизина [13], а гидролиз алкогольдегидрогеназы в течение 4 ч — к расщеплению с аналогичной специфичностью включая гидролиз связи -Pro-Lys- [49]. При этом не идет гидролиз пептидных связей остатков аргинина, хотя в отдельных случаях отмечается неспецифический гидролиз других пептидных связей. Неспецифический гидролиз можно исключить путем уменьшения времени инкубации. Протеаза II гидролизует обе связи -Gly-Lys- фрагмента дигидрофолатредуктазы, полученного после расщепления белка под действием BrCN, с сохранением пептидной связи остатков аргинина [25].

Сравнительный анализ продуктов гидролиза пенициллопепсина IV ферментами из A. mellea и Myxobacier показал, что последний является более специфичным.

Условия гидролиза. Фермент из Myxobacier проявляет максимум активности при рН 8,5—9,0, характеризуется устойчивостью к автолизу, термостабильностью при 60 °С и ингибируется в присутствии 50 мМ ЭДТА [117]. Гидролиз проводят в 20 мМ трис-НС1-буфере (рН 9,0) при 37 °С в течение 4 ч при соотношении фермент : субстрат= 1 : 100 [49].

3.5.8. Постпролинспецифичный фермент

Поскольку остаток пролина в структурном отношении принципиально отличается от других аминокислотных остатков и вместе с тем относится к природным аминокислотам и входит в состав многих белков, можно было рассчитывать, что в природе существует фермент, расщепляющий соответствующие пептидные связи. Подобный фермент представлял бы несомненный интерес, поскольку пролин — редкая аминокислота и его присутствие ограничивает возможность атаки соседних пептидных связей другими протеолитическими ферментами. До настоящего времени выделен только один постпролинспецифичный фермент [54]. Выделение и очистку этого фермента из почек ягненка проводили методом аффинной хроматографии. По предварительным данным фермент относится к классу сериновых протеаз [123]. Подробная характеристика фермента приведена в работах [109, 124]. Фермент не выпускается в виде коммерческого препарата.

3.5.8.1. Специфичность и условия гидролиза. На примере гидролиза коротких пептидов, содержащих не более 13 аминокислотных остатков, показано, что фермент гидролизует все типы связей -Рго-Х- за исключением -Pro-Pro- [54]. Скорость гидролиза зависит от природы остатка X: максимальная скорость наблю-

156 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

дается, если X обладает гидрофобными свойствами, минимальная при кислотных или основных свойствах. Показано также, что фермент гидролизует связи -Ala-Х-, но скорость гидролиза составляет 1/100 : 1/1 ООО скорости гидролиза связи -Рго-Х-. При инкубации октапептида наблюдался ограниченный гидролиз связи -Pro-Thr- [20], в то время как обработка 22- и 33-член-ных пептидов в течение 36 ч приводила к расщеплению только 10—20% связей, чувствительных к действию фермента [23]. Полученнные данные свидетельствуют о том, что фермент можно использовать только для гидролиза коротких пептидов.

Условия гидролиза. Фермент проявляет максимум активности в диапазоне рН 7,5—8,0. Гидролиз проводят в 100 мМ NH4HCO3 (рН 7,8), содержащем 1 мМ ДТТ и 1 мМ ЭДТА при 22 °С в течение 24 ч.

3.6. Протеазы с низкой специфичностью

В этом разделе приводятся сведения о важных в практическом отношении ферментах (свойства которых приведены в табл. 3.2), обладающих более широкой специфичностью. Охвачены далеко не все ферменты, однако рассмотрены большинство протеаз с широкой специфичностью. Многие из них гидролизуют пептидные связи, соседние с гидрофобными аминокислотными остатками. Рассмотрены также ферменты, такие, как пепсин и папаин, поскольку они часто используются с целью ограниченного протеолиза нативных белков.

3.6.1. Химотрипсин

Химотрипсин — один из наиболее специфичных ферментов, которые обсуждаются в этом разделе; он широко применяется для получения первичных гидролизатов [50, 56, 99].

Специфичность. Химотрипсин в основном гидролизует С-кои-цевую пептидную связь ароматического или объемного гидрофобного остатка типа -Н-Х-, где X = Tyr, Phe, Тгр или Leu. Связи -Н-Pro- устойчивы к действию фермента. Химотрипсин проявляет более широкую специфичность по сравнению с трипсином, так как может расщеплять пептидные связи других аминокислотных остатков, например Leu, His, Не, Met, Ser и Val.

Условия гидролиза. Гидролиз проводят в условиях, аналогичных гидролизу трипсином: в 100 мМ NH4HCO3, соотношение фермент : субстрат= 1 : 50, 37 °С, 4 ч. Иногда используют буфер

3.6. ПРОТЕАЗЫ С НИЗКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

157

с рН 7,0, содержащий 2М гуанидин-HCl [101]. Химотрипсин является сериновой протеазой и ингибируется ДФФ и ФМСФ. Наличие примеси трипсина в препаратах химотрипсина встречается редко. При необходимости действие трипсина можно исключить, добавляя в реакционную смесь соевый ингибитор трипсина (разд. 3.5.1.1).

3.6.2. Термолизин

Термолизин выделяют из Bacillus thermoproteotyticus. Фермент находит чрезвычайно широкое применение в работах по определению аминокислотной последовательности белков. Термолизин выпускается в виде коммерческого препарата фирмой Calbio-chem и некоторыми другими. Подробную информацию о применении этого фермента можно найти в работах [41, 65].

3.6.2.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Фермент гидролизует N-концевые пептидные связи гидрофобных аминокислотных остатков типа -Х-Н-, где в большинстве случаев H = Val, Leu, lie, Phe, Туг или Trp. Однако специфичность этого фермента значительно шире, так как фермент гидролизует с достаточно высокой скоростью пептидные связи аланина. Довольно редко наблюдается гидролиз по остаткам Asn, Thr, His и Gly. Из множества работ, посвященных исследованию специфичности термолизина, особого внимания заслуживают работы [1, 41]. Фрагмент Рго-Пе- чувствителен к действию фермента, а в последовательности типа -X-Phe-Pro- связь -X-Phe-устойчива. Гидролиз термолизином ингибируется соседними а-амино- или карбоксильными группами, следовательно, фермент не обладает экзопептидазной активностью. Амино- и карбоксильные группы боковых цепей аминокислотных остатков не оказывают заметного влияния на специфичность фермента.

Условия гидролиза. Термолизин проявляет активность в диапазоне рН 7,0—8,0, требует присутствия ионов Са2"1-. Гидролиз проводят в 100 мМ NH4HCO3, содержащем 5 мМ СаСЬ. Большинство препаратов фермента содержит значительное количество Са2+, которого в принципе достаточно для проявления ферментативной активности. Фермент ингибируется в присутствии ЭДТА. Обработка белков при 37 °С в течение 4 ч при соотношении фермент : субстрат=1 : 50 позволяет получить удовлетворительные результаты, хотя иногда требуется провести дополнительные исследования для подбора оптимальных условий. Термолизин термостабилен, сохраняет 100% активности при инкубации при 60 °С в течение 1 ч и значительную часть — при 80 °С [65]. Фермент устойчив в 8 М мочевине, а также

158 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

в 20%-ном этаноле или метаноле, однако в этих условиях повышается вероятность термической денатурации фермента и вследствие этого гидролиз следует проводить при 20 °С.

3.6.3. Пепсин

Подробную информацию о каталитической активности и использовании пепсина можно найти в работах [11, 27]. Этот фермент — практически единственная широко изученная и доступная в виде коммерческого препарата кислая протеаза (наряду с протеазой V8 из 5. aureus).

3.6.3.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Пепсин специфичен главным образом к пептидным связям ароматических и объемных алифатических аминокислотных остатков. Связи, включающие глутаминовую кислоту, также чувствительны к действию фермента. К сожалению, пепсин характеризуется широкой специфичностью к ряду других пептидных связей, поэтому окончательный результат частичного гидролиза предсказать трудно. Фермент применяется с целью ограниченного протеолиза нативных белков. Так, например, обработка пепсином при рН 4,5—5,0 приводит к получению крупных фрагментов иммуноглобулинов [73].

Условия гидролиза. Пепсин проявляет активность в диапазоне рН 1—5 (оптимальные условия рН 2,0). Гидролиз проводят в 10 мМ НС1 или 5%-ной уксусной кислоте. Фермент необратимо ингибируется при рН>6,0. Наиболее удачные результаты дает применение пепсина при определении положения дисульфидных связей, так как дисульфидный обмен минимален именно при низких рН; инкубация с пепсином приводит к получению коротких пептидов с правильно замкнутыми дисульфид-ными связями' [101] (см. также разд. 4.4.2).

3.6.4. Папаин

Папаин — SH-фермент, выделенный из латекса дынного дерева. Подробную информацию о свойствах этого фермента можно найти в работе [32]. Фермент выпускается рядом фирм.

3.6.4.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Субстратная специфичность папаина подробно изучена в работе [85]. Показано, что фермент содержит достаточно протяженный участок связывания, причем гидролиз специфической связи происходит в результате взаимодействия с одним из фрагментов этого участка. Участок связывания обладает повышенным сродством к двум последовательно распо-

3.G. ПРОТЕАЗЫ С НИЗКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

ложенным остаткам фенилаланина в субстрате [32]. В целом папаин гидролизует самые разнообразные пептидные связи, и, следовательно, результат гидролиза практически непредсказуем.

Папаин применялся для получения крупных фрагментов на-тивных белков, например иммуноглобулинов [79], миозина [63], экстрацеллюлярного фрагмента антигенов гистосовмести-мости человека [80].

Условия гидролиза. Папаин проявляет максимум активности в диапазоне рН 5—7,5, причем активацию фермента проводят в присутствии сульфгидрильных реагентов. Гидролиз проводят в 0,2 М пиридин-ацетатном буфере (рН 6,5), содержащем 1% (по объему) 2,3-димеркаптопропан-1-ола, в течение 1 ч при 37 °С и соотношении фермент : субстрат= 1 : 50 (по объему) [84]. Папаин легко инактивируется при окислении в присутствии низких концентраций цистеина, солями тяжелых металлов или цианат-ионами [97]. Папаин устойчив в присутствии мочевины, причем активность сохраняется даже в 8 М растворе мочевины, однако раствор последней должен быть тщательно деионизирован, чтобы исключить инактивирующее действие цнанат-ионов.

3.6.5. Эластаза

Эластаза — сериновая протеаза, гомологичная химотрипсину и трипсину. Подробное описание свойств фермента приведено в работе [40]. Эластаза выпускается несколькими фирмами.

3.6.5.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Эластаза характеризуется широкой специфичностью. В основном фермент гидролизует С-концевые пептидные связи аминокислотных остатков с небольшой гидрофобной боковой цепью, например аланина [40]. При изучении специфичности эластазы обнаружен гидролиз пептидных связей, соседних с остатками нейтральных аминокислот [72]. При обработке окисленных цепей инсулина наблюдали расщепление по остаткам Ser, Ala, Gly, Val и Leu.

Условия реакции. Гидролиз проводят в условиях, аналогичных трипсину и химотрипсину, т. е. в 100 мМ NH4HC03 при 37 °С в течение 1—4 ч при соотношении фермент : субстрат^ = 1 : 50.

3.6.6. а-Протеаза из Crotalus atrox

а-Протеазу выделяют из яда Crotalus atrox. Свойства фермента приведены в работах [77, 125]. Фермент гидролизует N-концс-вые пептидные связи гидрофобных аминокислотных остатков

160 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

[77, 66] и, таким образом, по специфичности аналогичен термолизину. а-Протеаза проявляет максимум активности в диапазоне рН 7,5—8,0; она иногда используется при определении первичной структуры белков [107]. Однако для выявления всех преимуществ этого фермента необходимо провести дополнительные исследования. Фермент выпускается в виде коммерческого препарата фирмой Pierce.

3.6.7. oc-Литическая протеаза из Sorangim sp.

Выделение а-литической протеазы описано в 1965 г. [114]. В виде коммерческого препарата фермент не выпускается. По специфичности фермент аналогичен эластазе. Предполагают, что а-литическая протеаза более специфична [115], но прямого сопоставления двух ферментов сделано не было. Сравнительно недавно фермент был использован в ряде исследований [100—103].

3.7. Заключение

Основное внимание в этой главе уделено методам получения крупных фрагментов белка и соответственно методам ограниченного гидролиза с использованием ферментов, обладающих высокой специфичностью. Использование таких методов играет существенную роль как в определении аминокислотной последовательности белков, так и в структурно-функциональных исследованиях. Наиболее специфические протеазы гидролизуют полипептидную цепь по основным аминокислотным остаткам — Lys и Arg или по кислотным — Glu. Другие ферменты обладают более широкой специфичностью к гидрофобным аминокислотным остаткам. Тем не менее такие ферменты нашли широкое применение при дополнительном гидролизе крупных фрагментов белка. В этой главе описаны также свойства протеазы, гидролизу-ющей по остаткам пролина. Этот фермент представляет несомненный интерес, но в настоящее время еще не получил широкого применения. Следует надеяться, что возможности аналитической химии белка будут расширяться в дальнейшем благодаря выпуску новых коммерческих препаратов из числа описанных в этой главе и открытию новых высокоспецифичных ферментов.

Литература

1. Ambler R. P., Meadway R. /., Biochem. J., 108, 893—895 (1968).

2. Atassi Af. Z.. Habeeb A. F. S. Л, Methods Enzymol., 25, 546—553 (1972).

3. Austen B. Af, Smith E. L, Biochem. Biophys. Res Commun, 72, 411—417 (1976).

ЛИТЕРАТУРА

161

4. Birk У., Methods Enzymol., 45, 700—707 (1976).

5 Blumenthal К. Л1, Moon К., Smith E. L., JL Biol. Chem., 250, 3644—3654

(1975) .

G. Boesman M.t Levi/ Al, Schenkein /., Arch Biochem. Biophys., 175, 463—476

(1976) .

7. Boyer P. D. (Ed.), Enzymes, 3rd edn., vol. 3, Academic Press, New York, London, 1971.

8. Braunitzer G. von, Beyreuther K., Fujiki H.t Schrank В., Hoppe-Seyler^ Z. Physiol. Chem., 349, 265 (1968).

9 Butter P. J. G., Hartley B. S., Methods Enzymol., 25, 191 — 199

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
дверная ручка реферат
конструкторские чертежи пилларсов
банкетка с ящиком для хранения
домашний кинотеатр в комплексе

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.08.2017)