химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ну [58].

Активность трипсина падает в денатурирующих условиях, например в присутствии 4 М мочевины сохраняется лишь 48% активности [39]. Удовлетворительные результаты получены при гидролизе трипсином в 2 М гуанидин-HCl [101]. Фермент необратимо инактивируется в присутствии ДФФ и ФМСФ. Известен также ряд специфических ингибиторов, например ингибитор из сои [4], который образует с трипсином стехиометрический комплекс и часто используется для остановки реакции [58]. При этом рекомендуется добавлять в реакционную смесь 4 мг ингибитора на 1 мг фермента. Гидролиз можно остановить подкис-лением; однако инактивация обратима, и при повышении рН активность фермента восстанавливается.

Специфическое расщепление по остаткам аргинина. Специфичность трипсина можно ограничить благодаря обратимому блокированию остатков лизина (разд. 3.4.3). В этом случае гидролиз проходит только по остаткам аргинина. Наиболее распространена модификация цитраконилированием; если продолжительность гидролиза трипсином слишком велика, используют малеилирование. Деблокирование малеильных или цитра-конильных групп проводят подкислением реакционной смеси до рН<3,5, а затем осуществляют разделение полученных пептидов. При подкислении фермент инактивируется, однако для предотвращения его активации при последующем повышении

3.5. ПРОТЕАЗЫ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

149

рН, рекомендуется отделять его от продуктов реакции или инак-тивировать необратимо. Если с модифицированными пептидами предполагается работать в кислой среде, то в пептид рекомендуется вводить трифтороацетильные группы.

Специфическое расщепление по остаткам лизина. При необходимости провести гидролиз белка только по остаткам лизина используют обратимую модификацию по остаткам аргинина [75] (разд. 3.4.4). Полученные пептиды фракционируют при низких рН, а затем снимают защитные группировки. При использовании этого метода получают воспроизводимые результаты [5, 122], однако в отдельных случаях после модификации наблюдается снижение растворимости белка, в особенности после лиофильного высушивания.

Специфическое расщепление по остаткам цистеина. Алкили-рование остатков цистеина этиленимином приводит к получению аналога лизина — S-аминоэтилцистеина [81], и, таким образом, возникают дополнительные участки, чувствительные к действию трипсина. Скорость гидролиза по остаткам аминоэтилцистеина значительно ниже по сравнению с гидролизом по остаткам лизина и аргинина [12, 78]. При условии модификации остатков лизина и аргинина гидролиз трипсином проходит избирательно по остаткам цистеина. При этом стадия модификации остатков лизина и аргинина должна предшествовать восстановлению и последующему аминоэтилированию. Напротив, в случае цитра-конилирования предварительно модифицируют сульфгидриль-ные группы белка. Кислотная природа защитных групп лизина и объемные боковые цепи модифицированных остатков аргинина препятствуют расщеплению трипсином, если один из этих остатков находится вблизи остатка аминоэтилцистеина.

Специфическое расщепление по остаткам аспарагиновой кислоты. Метод модификации карбоксильных групп диаминами [112] позволяет проводить гидролиз белка избирательно по остаткам аспарагиновой кислоты. При этом происходит модификация С-концевой и карбоксильных групп глутаминовой кислоты. В связи с этим маловероятно, что метод найдет практическое применение для гидролиза белков. Однако метод вполне применим для гидролиза коротких пептидов, содержащих ограниченное количество или вообще не содержащих глутаминовой кислоты.

3.5.2. Тромбин

Одним из наиболее специфичных и доступных ферментов является тромбин, и достойно удивления, что он до сих пор не нашел практического применения. По-видимому, ограниченный интерес к ферменту объясняется тем, что различные партии пре-

150 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

парата варьируют по степени очистки и активности. Тромбин выпускается рядом фирм: Calbiochem, Miles Lab., Sigma. Описан метод дополнительной очистки коммерческого препарата тромбина на СП-сефадексе G-50 [106]. Подробное описание методов определения активности и идентификации различных молекулярных форм тромбина приведено в работе [64].

3.5.2.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Гидролиз тромбином проходит по С-концевой пептидной связи остатков аргинина типа -Arg-X-. В на-тивном субстрате фибриногене этой связью является -Arg-Gly-, в других белках в качестве остатка X может быть аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, цистеин, валин [64]. Наблюдается также гидролиз по связи -Arg-His- в кальмодулине [108]. Обработка тромбином приводит к расщеплению только очень ограниченного числа пептидных связей аргинина, и, следовательно, этот метод можно считать идеальным для получения крупных фрагментов белка, предназначенных для автоматического секве-нирования. В некоторых случаях тромбин даже в жестких условиях гидролизует в белке только одну пептидную связь, в других случаях степень гидролиза зависит от продолжительности реакции и температуры. Соответствующие примеры приведены в работе [106].

Условия гидролиза. Тромбин — сериновая протеаза; проявляет максимум активности при рН 8,0. Гидролиз проводят в условиях, аналогичных трипсину, т. е. в 100 мМ NH4HC03 при 37 °С в течение 4—8 ч, но два последних параметра могут варьировать в широких пределах. Активность тромбина определяют по степени свертывания фибриногена в условных единицах NIH (введенных National Institutes of Health, США) [64]. Соотношение фермент : субстрат также варьирует в широком диапазоне: от 1 : 100 до 1 : 5 [46, 70] и от 1 до 60 ед./мг субстрата [59, 118]. В связи с этим в каждом конкретном случае следует подбирать оптимальные условия гидролиза, например, осуществляя контроль за процессом гидролиза с помощью электрофореза. Соответствующие примеры приведены в работе [71]. Тромбин ингибируется ДФФ и ФМСФ.

3.5.3. Протеаза V8 из Staphylococcus aureus

Протеазу V8 выделяют из штамма V8 S. aureus [43]; она поставляется как коммерческий препарат фирмой Miles, ферменты с аналогичной специфичностью выделены из штамма 8325N St. aureus [83] и из сорго [28, 29], но они не выпускаются в виде коммерческих препаратов.

3.5 ПРОТЕАЗЫ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

151

Специфичность. Фермент проявляет специфичность в основном к С-концевой пептидной связи глутаминовой кислоты типа -Glu-X-, где в качестве X может быть любой аминокислотный остаток, кроме пролина и глутаминовой кислоты. Показано, что субстратная специфичность зависит от состава буферных растворов [17]. Так, например, в 50 мМ ацетате аммония (рН 4,0) или 50 мМ NH4HCO3 (рН 7,8) фермент характеризуется высокой специфичностью, в то время как в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,8) происходит гидролиз по остаткам глутаминовой и аспарагиновой кислот. По другим данным [3], в фосфатном буфере иногда наблюдается увеличение скорости гидролиза. Различие в специфичности можно объяснить тем, что скорость гидролиза по остаткам аспарагиновой кислоты в фосфатном буфере значительно выше, чем в ацетатном или бикарбонатном буферах. Известно также, что связи, соседние с S-карбоксиметил-цистеином не чувствительны к действию фермента [119].

Особого внимания заслуживают работы, посвященные изучению протеазы V8 [21—23, 107]. Согласно литературным данным, при обработке протеазой V8 иногда наблюдается неспецифический гидролиз ряда связей, главным образом связи -Ser-X-. Однако в большинстве случаев протеаза V8 селективно гидролизует пептидные связи остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот [116]. Иногда наблюдается только частичный гидролиз чувствительных к действию фермента связей, особенно если в коротком фрагменте содержится несколько остатков глутаминовой кислоты.

Условия гидролиза. Протеаза V8 сохраняет активность в диапазоне рН 3,5—9,5 [17], причем максимальная активность наблюдается при рН 4,0 и 7,8 [43]. Эта сериновая протеаза ингибируется ДФФ. Фермент активен в 0,2%-ном ДСН и сохраняет 50% активности в 4М мочевине [17]. Таким образом, гидролиз протеазой можно проводить в денатурирующих условиях, когда необходимо солюбилизировать субстрат. В литературе нет прямых доказательств того, что связывание ДСН с субстратом влияет на активность фермента. Гидролиз проводят в 50 мМ ацетате аммония (рН 4,0) при 37 °С, причем продолжительность гидролиза может достигать 18 ч [43]. Однако в зависимости от требуемой специфичности фермента гидролиз осуществляют при рН 7,8 в 50 мМ NH4HCO3 или 50 мМ натрийфосфатном буфере.

3.5.4. Клострипаин

Сульфгидрильная протеаза клострипаин выделена из Clostridium histolyiicum [68]. Подробную информацию об использовании этого фермента можно найти в работе [67]. Фермент выпу-

152 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

скается в виде коммерческого препарата фирмами Worthington и Boehringer. Сравнительно недавно предложен метод дополнительной очистки этих препаратов методом аффинной хроматографии на со-аминоалкилагарозе (сефароза-С7ЫН2) [31]. Метод позволяет получить высокоактивный препарат, немного отличающийся от известного ранее. Перед употреблением рекомендуется подвергать коммерческий препарат клострипаина дополнительной очистке с помощью указанного метода.

3.5.4.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. В основном специфичность клострипаина сводится к гидролизу С-концевой пептидной связи по остаткам аргинина (связь типа -Arg-X-), хотя иногда наблюдается гидролиз отдельных связей -Lys-X-. Степень гидролиза но остаткам лизина можно ограничить, варьируя условия. Так, например, были найдены условия гидролиза 20-членного фрагмента лизоцима по двум остаткам аргинина, при сохранении пептидной связи остатка лизина [93], а также {52-гликопротеина I человека [61] по остаткам аргинина и отдельным остаткам лизина. Описан [103] гидролиз фрагмента дигидрофолатредуктазы (полученного при расщеплении белка под действием BrCN) по остаткам аргинина с сохранением пептидной связи остатков лизина. Выход пептидов, полученных в результате гидролиза по остаткам аргинина, составляет 40—100%. Аналогичные результаты получены при гидролизе фрагмента фосфоглицераткиназы лошади (полученного при расщеплении белка под действием BrCN). В этом случае клострипаин гидролизует фрагмент белка по трем остаткам аргинина, не затрагивая пяти пептидных связей остатков лизина. Специфичность препарата клострипаина, дополнительно очищенного методом аффинной хроматографии, исследована на примере парвальбумина хека, содержащего один остаток аргинина и 12 остатков лизина. Инкубация белка при 37 °С в течение 12 ч приводит к гидролизу по остатку аргинина. Имеются данные [19, 69], что фермент проявляет аналогичную специфичность в отношении других объектов. Таким образом, специфичность клострипаина аналогична действию трипсина на белки с модифицированными остатками лизина. На практике метод гидролиза клострипаином обладает определенными преимуществами, поскольку при этом исключаются стадии модификации и деблокирования остатков лизина.

Условия гидролиза. Клострипаин проявляет максимум активности при рН 7,7 в присутствии сульфгидрильных реагентов [68]. Целесообразно проводить гидролиз в присутствии ионов Са2+, хотя их присутствие не обязательно. Гидролиз проводят при соотношении фермент : субстрат = 1 : 50 в 100 мМ NH4HC03 и 1 мМ дитиотреите при 25 °С в течение 4 ч. Рекомендуется

3.5. ПРОТЕАЗЫ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

153

предварительно активировать фермент в 10 мМ ДТТ и 20 мМ NH4HCO3 в течение 1 ч, а затем инкубировать раствор белка при соотношении фермент : субстрат= 1 : 200 в 50 мМ NH4HCO3 при 37 °С в течение 12 ч [31]. Температуру раствора и продолжительность гидролиза варьируют в зависимости от поставленных задач. С целью солюбилизации субстрата в некоторых случаях в реакционную смесь добавляют 2 М мочевину [93].

3.5.5, Протеаза подчелюстной железы

Фермент выделен из подчелюстной железы мыши [86, 87]. Максимум активности наблюдается при рН 7,5—8,0. Подробную информацию о свойствах этого фермента можно найти в работе [6]. Показано, что эта сериновая протеаза ингибируется ДФФ, гомологична тромбину [89, 90]. Аналогичные результаты опубликованы в работе [104]. Фермент выпускается в виде коммерческого препарата фирмами Pierce и Boehringer.

3.5.5.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Изучение действия фермента на различные синтетические и нативные субстраты показало, что фермент специфичен к С-концевой пептидной связи остатков аргинина [88]. На примере гидролиза яичного лизоцима и инсулина быка показано, что гидролиз проходит по некоторым остаткам аргинина и не затрагивает остатки лизина. Аналогичные результаты получены при гидролизе х-цепи иммуноглобулина [113]. При этом идет гидролиз по большинству остатков аргинина, за исключением устойчивых пептидных связей -Arg-Val- и -Arg-Arg. Таким образом, по специфичности фермент аналогичен клострипаину. Однако при обработке фосфатидилхолинсвязывающего белка из печени быка наблюдается расщепление только по одному из 10 остатков аргинина [69].

Условия гидролиза. Гидролиз проводят в 1 % NH4HCO3 (рН 8,0) при 37 °С в течение различных периодов времени (до 24 ч) при соотношении фермент : субстрат= 1 : 50. Гидролиз останавливают подкислением НС1 до рН 1,5—2,0 [88].

3.5.6. Протеаза из Armillaria mellea

Фермент выделен из базидиомицета Armillaria mellea [ПО] и получен в виде активного препарата [60, 110, 111]. Показано, что фермент представляет собой металлопротеин (2п2+-содер-жащий) с молекулярной массой 14 000 и с максимумом активности при рН 6,8. Фермент не выпускается в виде коммерческого препарата.

154 3- ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

3.5.6.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. При изучении специфичности фермента было показано, что гидролиз проходит по N-концевой пептидной связи остатков лизина и аминоэтилцистеина (Аес) типа -X-Lys-и -Х-Аес-, даже если Х = Рго. Расщепление связи -Pro-Lys наблюдали при обработке инсулина и других субстратов [16, 36]. Было также показано, что пептидные связи, содержащие вблизи остатков лизина кислотные остатки, устойчивы к действию фермента. В некоторых случаях наблюдается гидролиз С-концевой пептидной связи аргинина -Arg-X. Степень гидролиза по этой связи возрастает, если X = Leu или Не, хотя не все фрагменты этого типа подвергаются гидролизу.

Фермент из A. mellea использовали для ограниченного гидролиза иммуноглобулинов G и D [44, 48]. Результаты этих исследований свидетельствуют о его высокой специфичности.

Условия гидролиза. Гидролиз проводят в 0,2 М N-этилмор-фолин — ацетатном буфере (рН 8,0) при соотношении фермент : :субстрат=1 : 100 при 35 °С в течение 22 ч [15] или в 0,1 М NH4HCO3 при соотношение фермент : субстрат=1 : 500н-1000 при 37 °С [36]. Удовлетворительные результаты получены при проведении реакции в диапазоне рН 4—9 и при повышении температуры до 50 °С. Оптимальные результаты получены при обработке субстратов в 10 мМ трис — HCl-буфере (рН 7,0), содержащем 0,15 М NaCl и 2 мМ ацетат кальция, при соотношении фермент : субстрат= 1 : 100 при 37 °С в течение 3 ч [44]. Фермент ингиби

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы для начинающих
сеть медцентров
стул betty капучино
ближайший концерт в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)