химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ительными точками для расщепления исследуемого белка трипсином и протеазой из A. mellea. Иногда применяют модификацию остатков аспарагиновой кислоты, что также создает дополнительные участки для гидролиза трипсином.

Модификацию остатков лизина и аргинина используют с целью ограничения действия трипсина. Интерес представляют обратимые методы модификации, которые позволяют регенерировать исходные аминокислотные остатки после проведения ферментативного гидролиза.

3.4.1. Расщепление дисульфидных связей

3.4.1.1. Окисление. Расщепление дисульфидных связей путем окисления надмуравьиной кислотой приводит к получению стабильных остатков цистеиновой кислоты, а также к увеличению общего отрицательного заряда полипептидной цепи. Подробное обсуждение этого метода, а также практические рекомендации можно найти в разд. 2.2.3.

3.4.1.2. Восстановление. Методы восстановления дисульфидных связей подробно описаны в гл. 2 и в работе [55].

3.4.2. Алкилирование сульфгидрильных групп

Известно несколько алкилирующих реагентов, и выбор реагента зависит от свойств функциональной группы, которую необходимо ввести в полипептидную цепь. Далее обсуждаются три наиболее распространенных способа алкилирования.

3.4.2.1. Карбоксиметилирование. Карбоксиметилирование — наиболее общепринятый метод модификации сульфгидрильных групп белков. Для введения кислотных или нейтральных группировок в качестве реагентов используют иодоуксусную кислоту или иодоацетамид. Предварительно оба реактива перекристал-лизовывают для удаления свободного иода. Иодоуксусную кислоту перекристаллизовывают из гексана, иодоацетамид — из петролейного эфира. Оба реагента добавляют в реакционную

3.4. МЕТОДЫ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ

143

смесь в небольшом избытке относительно общей концентрации сульфгидрильных групп. Раствор иодоуксусной кислоты перед использованием нейтрализуют с помощью триса или NaOH. Реакцию проводят при 0°С в течение 1 ч. В этих условиях исключается возможность алкилирования других функциональных групп белка. Метод подробно обсуждается в работе [37] и в разд. 2.2.1.

Оба реактива доступны в виде радиоактивно меченных препаратов и могут использоваться для введения в полипептидную цепь радиоактивной метки. При введении метки вначале добавляют радиоактивный препарат (иодоуксусную кислоту или иодоацетамид), а затем небольшой избыток «холодного» реагента. При этом достигается наиболее высокая степень включения метки, так как известно, что реакционная способность сульфгидрильных групп значительно выше по сравнению с восстановителем, присутствующим в реакционной смеси.

3.4.2.2. Аминоэтилирование. S-Аминоэтнльную группу вводят в полипептидную цепь с помощью алкилирования сульфгидрильных групп этиленимином [81, 82]. Этот тип модификации имеет большое значение, так как аминоэтилцистеин — аналог лизина, чувствительный к действию трипсина (разд. 3.5.1). Показано, что необходимо использовать восьмикратный избыток этиленимина в расчете на одну сульфгидрильную группу [12]. При низких рН наблюдается единственная побочная реакция алкилирования остатков метионина [91]. В связи с этим следует избегать подкисления реакционной смеси до полного удаления алки-лирующего реагента. Более подробно метод рассматривается в гл. 2.

3.4.2.3. Другие реакции алкилирования. Для получения кислотоустойчивого остатка 5-пиридилэтилцистеина используют 4-ви-нилпиридин [26]. Применение в качестве алкилирующего реагента 2-бромоэтилтриметиламмонийбромида приводит к получению производного цистеина, также устойчивого в условиях кислотного гидролиза и в условиях автоматического секвенирова-ния [45]. Более подробно метод рассматривается в гл. 2.

3.4.3. Модификация остатков лизина

Описано несколько методов модификации лизина, наибольший интерес из которых представляют цитраконилирование, малеи-лирование и трифтороацетилирование. Выбор метода зависит от относительной стабильности модифицированных групп при последующей обработке препаратов белка. Все три варианта модифицированного лизина устойчивы в диапазоне рН 8—9

144 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

Однако цитраконильные и малеильные производные неустойчивы в кислотных условиях, а трифтороацетильные — при высоких рН. Кроме указанных типов модификации следует упомянуть тетрафторосукцинилирование, которое приводит к получению производных лизина, неустойчивых в щелочной среде [8J. В связи с этим метод не нашел практического применения. Результаты изучения стабильности модифицированного лизина, степени регенерации аминогрупп и реконструкции нативной структуры и биологической активности исследуемых белков приведены в работе [2]. Из всех известных способов модификации остатков лизина наиболее предпочтительно цитраконилн-рование, поскольку в этом случае деблокирование проходит в мягких условиях и с высоким выходом при сохранении биологической активности исследуемого белка. К недостаткам метода относится высокая лабильность цитраконильных групп при 40 °С даже при рН 8,0. Если по условиям эксперимента белок необходимо выдерживать в указанных условиях в течение длительного времени, то более целесообразно использовать малеи-лирование. Еще одним недостатком обоих методов является возможность алкилирования свободных сульфгидрильных групп [9]. Если после деблокирования остатков лизина необходимо регенерировать сульфгидрильные группы, их предварительно переводят в S-сульфопроизводные, либо в смешанные дисульфиды (например, с цистеином).

3.4.3.1. Цитраконилирование. Для обратимой модификации остатков лизина в качестве реагента используют цитраконовый ангидрид [14]. Реакцию проводят при перемешивании и 20 °С, рН реакционной среды контролируют с помощью рН-метра. Белок (15 мг/мл) растворяют или суспендируют в воде и доводят рН до 8,0. К раствору небольшими порциями (1 мкл/мг белка) добавляют цитраконовый ангидрид и поддерживают рН 8,0 подтитровывая реакционную смесь 5 М NaOH. Через 30 мин рН реакционной среды не меняется, что свидетельствует о завершении реакции. Модифицированный белок подвергают диализу или гель-фильтрации в 0,1 М бикарбонате аммония. Большинство белков в результате модификации переходит в раствор. Однако в случае необходимости реакцию можно проводить в растворе мочевины или гуанидин-HCl.

Цитраконильные группы гидролизуют путем инкубирования при рН 3,5 и 20 °С в течение 12 ч. Скорость реакции деблокирования возрастает с уменьшением рН. Так, например, было предложено использовать для гидролиза диализ против 10 мм НС1 (рН 2,0) при 20 °С в течение 6 ч [30].

3.4.3.2. Малеилирование. На основании изучения условий малеи-лирования [9] было предложено проводить реакцию в карбо-

3.4. МЕТОДЫ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ

145

натном или фосфатном буферных растворах при 2 °С. Деблокирование проводят в более жестких условиях по сравнению с цитраконилированными белками. Период полупревращения защитных групп в реакции деблокирования при рН 3,5 и 37 °С составляет 11 —12 ч. Деблокирование проводят обычно при рН 2,5 и 40 °С в течение 120 ч [24],

Методика [10]. Перед употреблением малеиновый ангидрид очищают возгонкой. 20 мг бычьего химотрипсиногена растворяют в 20 мл 0,1 М пирофосфатного буфера (рН 9,0), затем при 2°С добавляют 300 мкл (6 порций по 50 мкл) 1,0 М раствора малеинового ангидрида в перегнанном диоксане. рН 9,0 поддерживают титрованием ОД М NaOH. Обессоливание проводят путем гель-фильтрации на колонке (3X40 см) с сефадексом G-25 в 0,01 М растворе аммиака. Для снятия малеильных групп раствор белка титруют муравьиной кислотой и аммиаком да рН 3,5 и раствор инкубируют при 37 °С в течение 30 ч, а затем при 60 °С в течение 60 ч.

Методика частичного малеилирования описана в разд. 4.4.6.2.

ЗА.3.3. Трифтороацетилирование. Трифтороацетильную группу вводят с помощью S-этилтиолтрифтороацетата [33, 37]. Белок растворяют в воде или растворе мочевины и титруют до рН 10 1 М КОН. Раствор тщательно перемешивают, добавляют S-этилтиолтрифтороацетат ,(10 мкл/мг белка) и инкубируют при 20 °С, поддерживая рН с помощью 1 М КОН. Избыток реагента удаляют диализом.

Трифтороацетильные защитные группы гидролизуют в присутствии 1 М пиперидина при 0°С в течение 2 ч. Затем рН доводят до 6 с помощью 0,5 М уксусной кислоты и избыток реагента удаляют путем лиофильного высушивания.

3.4.4. Модификация остатков аргинина

Для модификации остатков аргинина в белках предложен ряд реагентов, например малоновый ангидрид [53], циклогексан-дион [105], 2,3-бутадиоп [121] нитромалоновый альдегид [95]. Сведения о некоторых способах модификации можно найти в работе [120]. К сожалению, в большинстве случаев реакцию проводят в жестких условиях (при экстремальных рН), что приводит к необратимой модификации остатков аргинина и сопровождается побочными реакциями. Далее приводится методика с использованием 1,2-циклогександиона [75]. Полученные производные аргинина устойчивы при кислотных рН, образуют комплекс с борат-ионом, устойчивый при рН 8. Методика описана в работе [98].

10 -703

146 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

Модификация остатков аргинина 1,2-циклогександионом. Белок растворяют в 0,2 М -Na-боратном буфере (рН 9,0; 10 мг/мл) и инкубируют с 0,15 М 1,2-циклогександионом при 35 °С в течение 2 ч. Подкисляют реакционную среду равным объемом 30%-ной уксусной кислоты, избыток реагента удаляют с помощью диализа против разбавленного раствора уксусной кислоты, диализат высушивают лиофильно. Согласно другому варианту методики, по завершении инкубации реакционную смесь диализуют против 0,1 М Na-боратного буфера (рН 8,0). В этом случае получают препарат, пригодный для ферментативного гидролиза.

Модифицированные остатки аргинина деблокируют путем инкубации при рН 7,0 в 0,5 М растворе гидроксиламина при 35 °С в атмосфере инертного газа в течение 12 ч.

3.4.5. Модификация карбоксильных групп белка

Модификацию карбоксильных групп в коротких пептидах осуществляют с помощью водорастворимого карбодиимида путем конденсации с соответствующими диаминами (1,2-диаминоэта-ном или диаминометаном). При соответствующем выборе диамина остатки аспарагиновой кислоты превращаются в аналог лизина [112]. Реакцию конденсации пептида с 2 М диамином проводят при рН 4,75 в присутствии 0,4 М солянокислого 1-этил-3-(3-диэтиламинопропил) карбодиимида при 20 °С в течение 1 ч. Затем добавляют вторую порцию карбодиимида и инкубируют еще в течение 5 ч. Модифицированные пептиды отделяют от продуктов реакции и избытка реагентов путем гель-фильтрации. В результате происходит необратимая модификация всех карбоксильных групп белка. Возможности использования этого типа реакции для модификации высокомолекулярных белков не исследовались. Указанным способом был модифицирован 29-членный пептид глюкагон; это самый крупный пептид, подвергнутый такой модификации.

3.5. Протеазы с высокой специфичностью

В этом разделе приведены сведения о ферментах, обладающих довольно узкой специфичностью, т. е. расщепляющих ограниченное число пептидных связей. Свойства этих ферментов представлены в табл. 3.1. Из ферментов этого типа наиболее важное значение имеет трипсин. Область применения трипсина может быть существенно расширена с помощью реакций модификации, рассмотренных в предыдущем разделе. Благодаря таким модификациям можно вести гидролиз либо по остаткам лизина, либо по остаткам аргинина. В настоящее время все более широкое

3.5. ПРОТЕАЗЫ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

147

применение находит протеаза V8 из S.aureus. При обработке этим ферментом присходит гидролиз пептидной связи остатков дикарбоновых кислот, главным образом глутаминовой кислоты, благодаря чему метод составляет серьезную конкуренцию расщеплению с помощью трипсина. Сравнительно недавно опубликованы данные о протеазе из мутанта Pseudomonas fragi [18]. Предварительные исследования свидетельствуют о том, что фермент гидролизует пептидную связь по аминогруппе остатков аспарагиновой или цистеиновой кислот. И хотя еще рано говорить о практическом применении этого фермента, вполне возможно, что он составит конкуренцию протеазе V8. Известны ферменты, специфичные в отношении остатков аргинина или лизина, однако они не нашли еще такого широкого применения, как трипсин. В целом эти ферменты расщепляют только часть предполагаемых пептидных связей, что в некоторых случаях является их несомненным преимуществом.

3.5.1. Трипсин

Одним из наиболее доступных высокоспецифичных ферментов* получивших широкое применение, является трипсин. Препараты трипсина получают из различных источников, однако иногда в них присутствует примесь химотрипсина. В этом случае следы химотрипсина ингибируют с помощью ь-(1-тозиламидо-2-фе-нил)этилхлорометилкетона (ТФК) [57]. Рекомендуется использовать трипсин, обработанный ТФК, выпускаемый фирмой Worthington.

3.5J.1. Специфичность и условия гидролиза.

Специфичность. Трипсин специфически гидролизует пептидные связи по карбоксильной группе лизина и аргинина, т. е. типа -Lys-X- и -Arg-X-. Однако специфичность фермента не абсолютна, например фрагменты -Lys-Pro- и -Arg-Pro- устойчивы к действию трипсина. Присутствие кислотных остатков вблизи атакуемой связи приводит к резкому снижению скорости гидролиза, а в некоторых случаях полностью его исключает. Положительно заряженные группы также снижают скорость гидролиза. Например, если Arg и Lys находятся в ближайшем соседстве или расположены на N-конце полипептидной цепи,, происходит лишь частичное расщепление пептидных связей.

В литературе приводится ряд примеров неспецифического действия трипсина, хотя такие случаи встречаются крайне редко. Чувствительными к действию фермента могут быть пептидные связи, расположенные вблизи ароматических или гидрофобных аминокислотных остатков. Показано, что такой тип гидролиза не связан с примесью химотрипсина, а является свойством

10*

148 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

самого трипсина или присутствующего в виде примеси г|>трип-сина [52]. В ряде случаев наблюдается расщепление связей -Arg-Pro-, например во фрагментах -Trp-Arg-Pro-Ala- [74] и -Ala-Arg-Pro-Ala- [35]. Число полученных пептидов может не соответствовать общему количеству остатков аргинина и лизина (плюс один). Можно получить пептиды с остатком лизина или аргинина, расположенным не в С-концевом участке пептида. Однако такие случаи чрезвычайно редки. Таким образом, при интерпретации полученных результатов следует избегать поспешных выводов.

Условия гидролиза. Трипсин — это сериновая протеаза, обладающая максимальной активностью в диапазоне рН 7—9. Фермент обратимо инактивируется при рН<4. С целью предотвращения автолиза трипсин растворяют в 10 мМ НС1, после чего образец можно хранить в замороженном состоянии в течение нескольких недель. Гидролиз трипсином проводят в 0,1 М аммонийбикарбонатном буфере при соотношении фермент : суб-страт=1 : 50-М00 при 37°С в течение 1—4 ч. Гидролиз можно ограничить, используя в качестве субстрата нативный белок или снижая температуру и продолжительность инкубации. Так, например, при 25 °С в течение 30 мин в тропонине С наблюдается расщепление только б из 15 связей, чувствительных к трипси

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
щит управления для вентиляции арктос
В магазине КНС выгодно C27F390FHI - отличное предложение от супермаркета компьютерной техники!
немецкая посуда сковороды
магазин спортивной экипировки

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.06.2017)