химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

130, 551—556 (1969).

168. Schultz Allison H., Grice Af., Biochemistry, 1, 694—698 (1962).

169. Shaltiel S.f Patchornik Л, Bull. Res. Council Israel 10A, 48 (1961).

170. Shaltiel S, Patchornik A., J. Am. Chem. Soc, 85, 2799—2806 (1963).

171. Shaltiel S., Patchornik A., Israel J. Chem., 1, 187—190 (1963).

172. Shechter YPatchornik A., Burstein У, Biochemistry, 15, 5071—5075 (1976).

173. Sheppard R. C, In: Peptides: Structure and Biological Function, Gross E., Meienhofer J. (Eds.), Pierce, Rockford, Illinois, 1979, pp. 577—585.

174. Shotton D„ Hartley B. S., Biochem. J., 131, 643—675 (1973).

175. Slobin L. I., Singer 5. J. Biol. Chem., 243, 1777—1786 (1968).

176. Smith D. Maggio E. T.t Kenyon G. L, Biochemistry, 4, 766—771.

177. Smyth D. G., Stein W. H.t Moore 5., J. Biol. Chem., 237, 1845—1850 (1962).

178. Sokolovsky Al, Patchornik A., J. Am. Chem. Soc, 86, 1859—1860 (1964).

179. Sokolovsky M., Sadeh T.t Patchornik Л, J. Am. Chem. Soc, 86, 1212—1217 (1964).

180. Spackman D. H„ Stein W. //., Moore S, Anal. Chem., 30, 1190—1206 (1958).

181. Spande T. F., Witkop В., Degani Y., Patchornik A., Adv. Protein Chem., 24, 97—260 (1970).

182. Stark G. R.y Methods Enzymol, 11, 125—138 (1967).

183. Stark G. /?., Methods Enzymol, 47, 129—132 (1977).

184. Strumeuer D. White W. N., Koshland D. Jr. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 50, 931—935 (1963).

185. Swallow D. L., Abraham E. P., Biochem. J., 70, 364—373 (1958).

186. Synge R. L., Biochem. J., 39, 351—353 (1945).

187. Tang J. R., Hartley B. S.t Biochem. J., 102, 593—599 (1967).

188. Tang J. R., Hartley B. S, Biochem. J., 118, 611—623 (1970).

189. Tarbell D. S., Harnisch D. P., Chem. Rev., 49, 1—90 (1951).

190. Thompson A. R.% Biochem. J., 60, 507—515 (1955).

191. Titani /С, Hermodson M. A., Ericsson L H., Walsh /(. A., Neurath /7., Biochemistry, 11, 2427—2435 (1972).

192. Toennies G., Homiller R. P., J. Am. Chem. Soc, 64, 3054—3056 (1942).

193. Torchinskii Y. Al., Sulfhydryl and Disulfide Groups of Proteins, Plenum Press, New York, 1974.

194. Vanaman T. G, Stark G. #, J. Biol Chem., 245, 3565—3573 (1970).

195. Veronese F.t Fontana А., Воссй E., Benassl С. Л, Gazz. Chim. Ital, 97, 321—331 (1967).

196. Veronese P. Af, Воссй E., Benassi C. A., Scoffone Z. Naturforsch., 24, 294—300 (1969).

197. Wachter ?„ Werhahn R.y Anal Biochem., 97, 56—64 (1979).

198. Wachter ZT, Werhahn R.y In: Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis, Proc. Third Internat. Conf., Birr C. (Ed.), Elsevier/North Holland, Heidelberg, Amsterdam, New York, Oxford, 1980, pp. 21—33.

199. Wakselman Al, Guibejampel E.f Raoult A., Busse W. D. J. Chem. Soc Chem. Commun., 21—22 (1976).

200. Waxdal Af, /, Konigsberg W. H.t Henley W. L.f Edelman G. Af., Biochemistry, 7, 1959—1966 (1968).

201. Weiner Я, White W. N., Hoare D. G, Koshland D. J. Am. Chem Soc, 8, 3851—3859 (1966).

202. White F. /г, J. Biol. Chem., 235, 383—389 (1960).

203. White F. tf, Jr., Methods Enzymol, 25, 387—392 (1972).

204. Wieland Т., Schon W., Liebig's Ann. Chem, 593, 157—178 (1955).

134

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛНПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

205. Wieland Т., Lamperstorjer С, Birr С, Makromol. Chem., 92, 277—286

(1966) .

206. Wilchek Al, Witkop В.} Biochem. Biophys Res. Commun. 26, 296—300

(1967) .

207. Wilchek M., Sarid 5., Paichornik Biochim. Biophys Acta, 104, 616—618 (1965).

208. Wilchek Al, Spande 7, Milne G., Witkop В., Biochemistry, 7, 1777—1786

(1968) .

209. Witkop B.y Adv. Protein Chem., 16, 221—321 (1961).

210. Wootton /. C, Chambers G. K.t Holder A. A., Baron A. J., Taylor /. G., Fincham J. R. S., Blumenthal K. Al, Moon Smith F. L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71, 4361—4365 (1974).

211. Zeitler H.-J„ Eulitz Al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 16, 669—674 (1978).

212. Benesch R. E., Benesch R.t J. Am. Chem. Soc, 80, 1666 (1958).

Глава 3

ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

Дж. М. УИЛКИНСОН (J. М. WILKINSON, Department of Biochemistry, Royal College of Surgeons of England, 35/43, Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PN, U.K.)

3.1. Введение

Наличие протеолитических ферментов с разнообразной специфичностью позволяет использовать различные подходы к расщеплению полипептидных цепей с целью получения определенных наборов пептидов. Этой проблеме посвящено много обзоров; в одних рассматриваются общие свойства ферментов [7, 62, 76], в других основное внимание уделяется технике ферментативного расщепления полипептидной цепи [42, 50, 56, 99]. Сведения относительно недавно открытых ферментов можно найти в работе [51].

С появлением автоматических методов секвенирования первоочередной задачей исследователя стало получение нескольких крупных и легко доступных фрагментов исследуемого белка. В связи с этим в последнее время возрос интерес к использованию ферментов с высокой специфичностью. Ряд таких ферментов нашел широкое применение, другие, возможно, будут использоваться в ближайшем будущем. Однако известных в настоящее время ферментов бывает недостаточно для получения наборов пептидов с перекрывающейся последовательностью и вопрос поиска новых высокоспецифичных ферментов остается открытым.

В этой главе приведена информация о большинстве ферментов, получивших широкое практическое применение, включая возможные источники получения коммерческих препаратов. Сведения о специфичности ферментов приведены в табл. 3.1 и

3.2. Рассматриваются также вопросы практического применения ферментативных методов гидролиза с учетом последних публикаций; приводятся методы предварительной обработки белков и методы химической модификации с целью ограничения или расширения специфичности фермента.

Обычно в химии белка используют протеолитические ферменты, доступные в виде высокоочищенных коммерческих препаратов. Приготовление препаратов ферментов собственными силами не оправдывает себя. К сожалению, многих ферментов, представляющих несомненный интерес, все еще нет в продаже.

Таблица 3.1. Протеазы с высокой специфичностью

. Л „ „ _ а Дополнительный тип

Фермент Оптимум рН Основной тип гидролиза" ~ гидролиза Гидролиз не идет

Трипсин

7—9

-Lysb-;-Argb;-Aecb-

-Lys^Pro-

Тромбин

-Argb<-(X = Gly, Ala, Val, Asp, Cys, Arg)

Протеаза V8 из S. o«- 4 и 7,8 reus

-Glu^X-

-Asi

ЧЯи^Рго-; 431u^Glu

Клострипаин

7,7

-Arg*X-

I

- Lys - X -

Протеаза подчелюстной 7,5—8 железы мыши

Протеаза A. mellea 8,0

Протеаза Myxobacter 9,0 All

Постпролинспецифичная 7,5—8 протеаза

а Аес — аминоэтилцистеин.

i

Arg^X

Arg*X

Lys-Рга

-X'Lys-

-Prci>

-РпДрго

138 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ _Таблица 3.2. Протеазы с более широкой специфичностью

Фермент

Оптимум рН

Пептидные связи, чувствительные к действию ферминта

Гидролиз не идет

Химотрипсин 7—9

н*х-

-„t:

Pro

Термолизин

7-8

а-Протеаза 7,5—8 Crotalus atrox

Пепсин

Папайи

Эластаза

5—7,5

Н = Туг, Phe, Trp, Leu Н - Val, Leu, lie, Phe, Туг, Trp

(аиалогично термолизину)

-xWy-, -X^GIuiy-

Н — ароматический или объемный алифатический аминокислотный остаток

-Phc-X^-Y-

-Х^Н-Рго

идет гидролиз ряда других пептидных связен

7—9

а-Литическая 7—8 протеаза

N — небольшой нейтральный или гидрофобный аминокислотный остаток (Ser, Ala, Gly, Val, Leu)

-n*y-

(аналогично эластазе)

Тем не менее ниже приводятся методики применения некоторых из них в расчете на то, что соответствующие препараты появятся в ближайшем будущем.

3.2, Приготовление субстрата

Полнота ферментативного гидролиза определяется физическим состоянием субстрата. Так, например, если нативный белок и подвергается протеолизу, то весьма вероятно, что такой гидролиз будет ограниченным. Однако в случае необходимости получения фрагментов белка, обладающих частичной биологической

3.3. ОБЩИЕ УСЛОВИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА

139

активностью, этот метод вполне применим. Такой подход подробно обсуждается в разделе, посвященном использованию трипсина, пепсина и папаина. В общем случае для обеспечения полноты гидролиза белок денатурируют с обязательным восстановлением дисульфидных связей.

В большинстве случаев достаточно кипячения в течение 5— 10 мин при нейтральном рН или осаждения 5%-ным раствором трихлороуксусной кислоты. Восстановление дисульфидных связей проводят в присутствии денатурирующего агента, например 8 М мочевины или 6 М гуанидин-HCl, а затем алкилируют образующиеся остатки цистеина. Методы восстановления дисульфидных связей и последующего алкилирования рассматриваются в разд. 3.3 и в гл. 2.

При денатурации растворимость белков резко понижается, и, хотя ферментативный гидролиз нерастворимых субстратов особой проблемы не представляет, иногда обработка таких субстратов является сложной задачей. Для успешного ферментативного гидролиза нерастворимого белка полученный осадок следует по возможности перевести в тонкую суспензию. С этой целью белок переводят в раствор при экстремальном значении рН, а затем уже полученный раствор титруют до необходимого рН. Образец белка можно также растворить в 6 М гуанидин-HCl, который затем удаляется путем диализа. Если указанная обработка не дает удовлетворительных результатов, то белок солюбилизируют путем обратимой модификации по остаткам лизина, например с помощью цитраконилирования. В результате белок приобретает дополнительный заряд, что часто приводит к дезагрегации.

Некоторые протеолитические ферменты частично или полностью сохраняют свою активность в денатурирующих условиях, и, следовательно, их можно использовать при низких концентрациях мочевины, гуанидин-HCl или додецилсульфата натрия (ДСН). В ряде случаев для повышения растворимости увеличивают концентрацию буферного раствора или гидролиз ведут при повышенной температуре. Далее приводятся подробные сведения о ферментах, сохраняющих ферментативную активность в денатурирующих условиях или при повышенной температуре. Особое внимание уделяется трипсину, клострипаину, протеазе V8 из S. aureus, химотрипсину, термолизину и папаину.

3.3. Общие условия ферментативного гидролиза

Подбор оптимальных условий гидролиза осуществляют, варьируя четыре основных параметра: состав буфера, соотношение фермент : субстрат, температуру и время. Конкретные условия, в которых следует проводить гидролиз данным ферментом, при-

140 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

ведены в разделах, посвященных каждому ферменту. Однако предварительно необходимо сделать несколько замечаний общего характера.

3.3.1. Буферные растворы

Обычно используют летучие буферы, особенно в том случае, если полученные пептиды предполагают разделять с помощью ионообменной хроматографии или электрофореза на бумаге. Если дальнейшее разделение пептидов проводят методом ВЭЖХ, концентрация солей значения не имеет (гл. 6). Для большинства ферментов оптимальным диапазоном рН является 7,5—8,5. В этом диапазоне обычно используют 1%-ный (масс./об.) бикарбонат аммония (рН 7,9) и 100 мМ N-этилмор-фолинацетат. Гидролиз пепсином проводят в 10 мМ НС1 или 5%-ной уксусной кислоте при рН 2,0. Для сохранения активности некоторых ферментов необходимо добавлять в реакционную смесь специфические реагенты, например сульфгидрильные реагенты (см. клострипаин и папаин) или ионы Са2+ (см. термолизин).

3.3.2. Соотношение фермент: субстрат

Обычно ферментативный гидролиз проходит количественно при соотношении фермент : субстрат=1 : 50-т-ЮО. Если требуется ограничить степень гидролиза, то соотношение увеличивают (до 1 : 1000). В то же время в некоторых случаях для достижения полноты гидролиза соотношение приходится уменьшать (до 1 : 10).

3.3.3. Температура

В большинстве случаев гидролиз проводят при 37 °С. Снижение температуры до 20 °С приводит к уменьшению скорости ферментативной реакции; этот прием используют с целью ограниченного протеолиза. Только два фермента — термолизин и протеаза из миксобактерий сохраняют высокую степень ферментативной активности при температуре >40°С.

3.3.4. Продолжительность ферментативного гидролиза

Согласно литературным данным, для полного ферментативного гидролиза инкубацию с ферментом проводят в течение 2—4 ч. Сокращение продолжительности инкубации до 10 мин, как правило, приводит к гидролизу только нескольких связей, наиболее чувствительных к действию фермента. В случае некоторых

3.3. ОБЩИЕ УСЛОВИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА

141

ферментов или особенно стабильных субстратов продолжительность гидролиза увеличивают до 16—24 ч. При этом с целью подавления микрофлоры в реакционную смесь следует добавить каплю толуола.

3.3.5. Контроль за процессом ферментативного гидролиза

В большинстве случаев ферментативный гидролиз проходит количественно и процесс не нуждается в специальном контроле. Иногда, при достаточном количестве материала, целесообразно вести контроль за скоростью реакции с помощью автоматического титратора. Однако, если требуется провести гидролиз по нескольким специфическим связям, необходимо подобрать условия гидролиза, в частности найти оптимальные температуру и время. В этом случае о степени гидролиза судят по молекулярной массе (по данным электрофореза в полиакриламидном геле) образующихся фрагментов. Пример такого анализа приведен в работе [38].

3.3.6. Завершение ферментативной реакции

Ферментативная реакция может быть остановлена различными приемами, самый простой из которых — замораживание с последующим лиофильным высушиванием. Другим приемом является изменение рН, например подкисление, поскольку большинство ферментов в этих условиях теряют активность. В некоторых случаях, в особенности при проведении ограниченного протеолиза, реакцию целесообразно прерывать с помощью специфических ингибиторов. Сведения о специфических ингибиторах можно найти в соответствующих разделах, посвященных каждому ферменту. Известны три класса протеолитических ферментов: сериновые протеазы, сульфгидрильные протеазы и металло-ферменты. Специфическими ингибиторами сериновых протеаз являются диизопропилфторофосфат (ДФФ) и фенилметилсуль-фонилфторид (ФМСФ). Применение последнего предпочтительнее, поскольку ДФФ высоко токсичен. Обычно готовят 1 М растворы ДФФ в безводном пропандиоле и ФМСФ—-в изопро-паноле. Ферментативную реакцию останавливают добавлением ингибитора до достижения концентрации 1 ммоль/л. Гидролиз сульфгидрильными протеазами останавливают добавлением небольшого избытка алкилирующих агентов, например иодоуксусной кислоты, по отношению к сульфгидрильному реагенту, добавленному для активации фермента. Металлоферменты инги-бируют добавлением хелатирующих реагентов, например 10 мМ ЭДТА.

142 3. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМИ МЕТОДАМИ

3.4. Методы модификации белков

Перед протеолнтическим гидролизом большинство белков необходимо модифицировать с помощью химических методов. Модификация сводится к расщеплению дисульфидных связей п далее в случае восстановления с последующим алкилированием позволяет получить стабильные производные цистеина. В случае аминоэтилирования модифицированные остатки цистеина служат дополн

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ножи касуми
стол трансформер журнальный обеденный цена
поарки на новый год
коипозиции с искусственными дельфиниумом

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)